首页 > 文献资料
-
DNA-PKcs单链抗体DPK3-scFv的原核表达纯化及生物学作用研究
目的 原核表达和纯化DNA依赖性蛋白激酶催化亚单位(DNA-dependent protein kinase catalytic subunit,DNA-PKcs)单链抗体DPK3-scFv,观察其透入细胞及干扰辐射诱发DNA-PKcs磷酸化修饰的生物学作用.方法 PCR扩增DPK3-scFv基因,插入到带有His标签的原核表达载体pET28a,重组质粒转化工程茵BL21、优化表达.免疫荧光显微镜和蛋白免疫印迹观察DPK3-scFv透膜进入HeLa细胞及对电离辐射诱发靶分子DNA-PKcs的磷酸化修饰的影响.结果 成功构建单链抗体表达载体pET28a-DPK3-scFv,在2xYT培养基(16 g胰蛋白胨、5 g酵母提取物和lO g NaCI溶于1 L双蒸水中,高压灭茵)、20℃温度、O.2 mmol/L异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside,IPTG)条件下诱导可溶性表达,进一步获得了纯化单链抗体.DPK3-scFv能体外抑制DNA-PKcs激酶活性,纯化的DPK3-scFv可跨膜进入细胞内,并与DNA-PKcs共定位在细胞核.DPK3-seFv对γ射线照射HeLa细胞中DNA-PKcs及其S2056位点(pS2056)的自磷酸化具有显著抑制作用.结论 通过优化条件获得了可溶性原核表达的DPK3-scFv单链抗体,具有抑制其靶分子DNA-PKcs的磷酸激酶活性.
-
二硫键稳定的抗肝癌人源化单链抗体-突变体人TNFα融合基因在CHO(dhfr-)细胞中的表达
目的:提高抗肝癌靶向人肿瘤坏死因子(hScFv25-hTNFα)的稳定性和杀伤活性,构建二硫键稳定的抗肝癌人源化单链抗体-突变体人TNFα融合基因(ds-ScFv-hTNFα),并在CHO细胞中表达.方法:常规构建ds-ScFv-hTNFα融合基因,并克隆入真核表达载体pCI(dhfr1),磷酸钙共沉淀法转染中国仓鼠卵巢细胞株(CHO-dhfr-),甲氨蝶呤(MTX)高压筛选高表达细胞株,免疫荧光染色和MTT法检测重组蛋白的抗体和突变体hTNFα的双重活性.结果:目的基因在CHO(dhfr-)中获得了表达,表达产物具有抗体和突变体hTNFα的双重活性,且稳定性得到大幅度提高,达到4℃放置4个月活性无明显下降. 结论:抗肝癌人源化ds-ScFv- hTNFα融合基因在CHO细胞中获得功能性表达,为进一步的临床应用研究奠定了基础.
-
人破伤风免疫噬菌体单链抗体库的构建及体外亲和筛选
目的 构建人破伤风免疫噬菌体单链抗体库,筛选抗破伤风毒素重链C端(TeNT-Hc)的特异性单链抗体(scFv).方法 利用RT-PCR从5名破伤风抗体滴度较高的健康献浆员外周血淋巴细胞中获得全套人破伤风抗体VH和VL基因,经过重叠PCR将VH和VL基因连接获得scFv片段.将scFv片段克隆至pCANTAB5E载体,电转化大肠TG1感受态菌,获得抗体库.以TeNT-Hc为抗原对抗体库进行3轮筛选,获得特异性人源性抗TeNT-Hc单链抗体.scFv由pET32a(+)表达载体表达,产物包涵体采用HisTrap FF预装柱纯化并透析复性.采用非竞争酶免疫实验法测定scFv亲和常数(affinity constant,KD值).检测scFv抑制TeNT-Hc与神经节苷脂GT1b结合的体外中和活性,计算抑制率.结果 构建库容量为1×108的人破伤风免疫噬菌体单链抗体库,经过筛选获得3株特异性较好的人源性抗TeNT-Hc单链抗体.原核表达结果显示,3株scFv均以包涵体形式存在,表达量占菌体总蛋白的40％～45％.包涵体经洗涤、纯化和复性后,scFv均保持了与TeNT-Hc的特异结合活性,1L培养物经纯化后可获得4 ～6 mg scFv蛋白.亲和力测定结果,27G、22D和S-4-7H-scFv的KD值分别为(1.25×10-7),(2.31×10-7)和(1.97×10-7)mol/L.3株抗体对TeNT-Hc与神经节苷脂GT1b结合的抑制率分别为64.5％,58.6％和51.5％.结论 人破伤风免疫噬菌体单链抗体库的构建及具有体外中和活性的特异性抗TeNT-Hc单链抗体的获得,为人破伤风基因工程中和抗体的制备奠定了良好基础.
-
大容量天然噬菌体抗体库的建立及多样性初步验证
目的:构建超大容量天然噬菌体抗体库.方法:从正常人外周血和新生儿脐血中分离淋巴细胞(>180份),提取RNA,用RT-PCR分别扩增抗体可变区轻重链基因(VH和VL),通过重叠PCR技术将VH和VL连接为单链抗体ScFv形式,克隆插入到pDF噬菌粒载体,转化XL1-Blue细菌得到ScFv初级抗体库,并以高感染复数(MOI≥100)感染Cre+菌株BS1365,利用Cre/LoxP位点特异性重组原理,使VH和VL基因定向同源重组匹配,随后以低感染复数(MOI<1)感染XL1-Blue,获取次级工作库.分别用5种不同抗原进行筛选,所获阳性克隆送测序以获取抗体基因.结果:抗体V区基因得到有效扩增,初级库库容3.6×107,工作库容1.8×1011,5种不同抗原筛选均得到特异性结合噬菌体抗体;测序结果表明,所获取抗体涵盖了不同的基因亚群,进一步证明抗体库具有良好的多样性.结论:经Cre/Loxp定位重组系统成功构建了超大容量天然噬菌体抗体库,初步尝试对5种抗原进行筛选均获成功,提示该抗体库多样性较好,可用于制备人源抗体.
关键词： 噬菌体抗体库 Cre/LoxP重组系统 单链抗体 -
抗人TNF-α单链抗体rScFvH22原核表达及纯化
目的:应用PET32-c原核表达载体快速、高效地表达及纯化单链抗体.方法:将单链抗体H22基因克隆到PET32-c原核表达载体中,通过酶切及测序鉴定正确后,进行原核诱导表达和纯化,并检测纯化后单链抗体的功能.结果:DNA琼脂糖凝胶电泳表明,单链抗体基因克隆成功;SDS-PAGE结果表明,单链抗体得到成功表达和纯化;ELISA和Western印迹结果表明,单链抗体H22能够特异性结合人TNF-α.结论:成功地表达及纯化抗人TNF-α单链抗体rScFvH22.
-
单链抗体-碱性磷酸酶检测系统的建立
目的:建立简便快速的单链抗体检测方法.方法:用PCR法和DNA重组技术构建了突变型碱性磷酸酶基因和单链抗体-突变型碱性磷酸酶融合基因;利用IPTG诱导融合基因的表达,并用pNPP底物液检测碱性磷酸酶的活性,用ELISA法检测和比较了不同单链抗体的相对活性.结果:实现重组突变型碱性磷酸酶基因在大肠杆菌中的功能性表达,且活性较重组野生型碱性磷酸酶活性高30倍左右.重组单链抗体-突变型碱性磷酸酶融合基因在大肠杆菌中获得功能性表达,周质中表达产物具有双功能,并成功地利用该系统分析了不同单链抗体的相对活性.结论:该单链抗体-碱性磷酸酶检测系统能够方便地应用于单链抗体的活性分析.
-
关键词：
-
关键词：
-
关键词：
-
关键词：
-
抗表皮生长因子受体噬菌体抗体库的构建筛选及单链抗体可溶性表达
近年来的研究表明,表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)是肿瘤治疗中一个很重要的靶点.本研究应用噬菌体展示技术筛选EGFR特异性单链抗体(single chain Fv,scFv).利用高表达EGFR的人鳞状上皮癌细胞A431免疫小鼠,提取脾细胞mRNA,RT-PCR扩增VH和VL基因并拼装成scFv基因.将scFv基因连接到噬菌粒pCANTAB 5E中,电击转化E.coli TG1细胞,构建了库容为2.5×10 7的噬菌体单链抗体库.用纯化的EGFR为靶抗原对噬菌体抗体库进行5轮富集筛选,得到次级抗体库6F-10.挑取48个克隆进行ELISA测定,45个克隆为阳性.取阳性值高的克隆感染E.coli HB2151,IPTG诱导scFv的表达.scFv(约27 kD)以可溶形式存在于细胞质及细胞周质中,并可分泌至上清液.测序结果表明,scFv基因序列全长768 bp,编码256个氨基酸.VH为与小鼠Ig同源的重链可变区基因,VL为κ型轻链可变区基因;VH和VL均由3个抗原互补决定区和4个框架区构成.免疫印迹和细胞免疫荧光显示,可溶性scFv可分别与纯化的EGFR抗原以及细胞表面的EGFR发生特异性结合.抗EGFR特异性scFv的获得,为研制靶向EGFR的抗体药物与研究生物治疗提供导向载体分子.
-
噬菌体展示全人源抗GPC3的单链抗体的筛选及鉴定
使用全人源噬菌体单链抗体文库进行筛选,获得特异性靶向磷脂酰肌醇聚糖-3 (GPC3)的单链抗体,并对单链抗体的生物学活性和抗原表位进行鉴定.经过4轮“结合-淘洗-洗脱-扩增”后,利用噬菌体ELISA和IMGT数据库分析抗体序列的靶向性和完整性.单链抗体的基因序列与表达载体pET-22b进行双酶切并连接,重组载体转化大肠杆菌E.coli Rosetta (DE3),抗体表达后经Ni2+柱亲和层析纯化,通过SDS-PAGE和Western blot对单链抗体分子质量进行鉴定.抗体对抗原的亲和力常数通过ELISA和SPR实验获得,流式细胞术分析其与细胞膜受体的结合能力.经筛选获得4个单链抗体(1F7、1D7、1D4和1B10)具有良好的靶向性和亲和力,其中1F7单链抗体的亲和力和结合能力高.本课题抗GPC3单链抗体为双特性抗体和免疫毒素等新一类免疫治疗药物的开发奠定基础.
-
亲水突变法提高抗VEGFR2单链抗体的体外亲和力
为了提高抗VEGFR2单链抗体AK404R的亲和力,本研究采用亲水突变法将AK404R的重链CDR3区进行突变,建立次级突变单链抗体库.利用噬菌体展示技术从次级突变库中筛选具有抗VEGFR2特异性、高亲和力抗体,获得的抗体突变株经大肠杆菌HB2151分泌表达,镍亲和色谱柱纯化,并采用竞争性ELISA法、生物信息学方法分别对其亲和力和结构进行了分析.本研究终建立了6.4×105的次级突变单链抗体库,其中两株突变株的亲和力有明显提高,两株突变株经分离纯化得到电泳纯的蛋白,竞争性ELISA结果显示突变体WZ01和WZ02的亲和力比亲本提高了3倍;生物信息学方法分析突变体与抗原的作用面增大、契合紧密,这可能是亲和力提高的原因之一.研究结果表明,在重链CDR3区引入亲水性氨基酸构建抗体突变库,可有效提高scFv的亲和力.
-
抗EGFR/抗KDR双特异性单链抗体的构建及表达
针对EGFR或VEGFR信号通路的相互作用导致的耐药性,为增强抗EGFR或抗VEGFR2抗体单独使用疗效不住的癌症的治疗效果,本文利用重叠PCR将抗人EGFR胞外区单链抗体基因scFv-E 10和抗人VEGFR2(KDR)的单链抗体基因scFv-AK404R融合在一起,得到抗EGFR/抗KDR双特异性单链抗体(bispecific singlechain diabody,scDb)基因,scDb的连接肽序列为15个氨基酸(G4S)3,在肽链的C端引入His标签及myc标签.将scDb基因连接入载体pHEN2,转化大肠杆菌HB2151并诱导表达,经镍柱纯化获得电泳纯scDb蛋白,产量约为570 μg·L-1发酵液.ELISA测定显示,scDb与EGFR胞外区的结合与亲本scFv-E10相当,与KDR胞外区的结合略低于亲本scFv-AK404R,表明抗EGFR/抗KDR scDb可与EGFR和KDR两种抗原特异性结合,可用于进一步的抗肿瘤活性研究.
关键词： 表皮生长因子受体 血管内皮生长因子受体2 双特异性单链抗体 单链抗体 原核表达 -
两种重组菌中融合蛋白Fv-LDP含量测定方法的比较研究
目的:测定抗Ⅳ型胶原酶单链抗体Fv和力达霉素辅基蛋白LDP在大肠杆菌中表达产生的融合蛋白Fv-LDP含量.方法:摇瓶培养融合蛋白Fv-LDP表达菌,固定化金属亲和层析纯化融合蛋白Fv-LDP,分步透析使之复性,HPLC测其纯度.比色法测定菌体浓度,SDS-PAGE分离蛋白带,积分密度扫描法测定融合蛋白Fv-LDP表达百分比和含量.结果:在88.7～1 064 mg·L~(-1)范围内,融合蛋白Fv-LDP浓度和积分密度值呈线性关系(r=0.998 8),精密度RSD为2.09%(n=8),平均回收率为95.18%.结论:SDS-PAGE-SpotDenso法操作简单,重复性好,灵敏度高,适用于发酵过程中对融合蛋白Fv-LDP表达产量的控制分析.
-
人源抗BLyS单链抗体的筛选及其构建与表达
目的:从人源单链抗体库中筛选抗B细胞刺激因子(BLyS)的单链抗体基因、构建表达载体并实现单链抗体的表达.方法:以哺乳动物细胞展示型人源ScFv抗体库为起始文库,通过流式细胞术进行分选,获得荧光强度强、比例为0.1％的阳性细胞.从候选细胞中提取质粒并转化至DH5α中进行扩增,得到质粒转染293T细胞作为下一轮筛选所需的抗体库.经过依次降低抗原浓度进行了3轮分选得到2个候选的ScFv序列.经序列分析,选择其中一种单链抗体基因,利用基因工程技术构建分泌型表达质粒,转染293E细胞并通过镍亲和层析纯化获得B-10 ScFv抗体蛋白并通过FortieBio Octet QK进行亲和力分析.结果:经过3轮筛选获得了全新的抗BLyS ScFv抗体序列,成功构建并表达了anti-BlyS ScFv抗体蛋白,该单链抗体与的BLyS亲和常数为3.08 nmol·L-1.结论:从哺乳动物细胞展示型人源ScFv抗体库中成功获得了可结合BLyS的全新单链抗体基因序列,该单链抗体与BLyS具有较高的亲和力,这为后续的活性研究以及产品开发奠定了基础.
关键词： B细胞 B细胞刺激因子 哺乳动物细胞展示型人源ScFv抗体库 单链抗体 -
抗表皮生长因子受体的单链抗体ER(Fv)的构建及其抗肿瘤活性研究
目的 利用大肠杆菌表达抗表皮生长因子受体(EGFR)的单链抗体并对其抗肿瘤活性进行研究.方法 构建含有抗EGFR单链抗体基因片段的重组质粒,IPTG诱导大肠杆菌表达单链抗体ER(Fv),用Ni离子亲和柱纯化单链抗体.ELISA测定ER(Fv)与纯EGFR抗原的结合能力;流式细胞术分析ER(Fv)与肿瘤细胞的结合;MTT法检测ER(Fv)对肿瘤细胞体外增殖的影响;动物试验测定ER(Fv)的体内抑瘤效果.结果 应用基因工程菌表达带有组氨酸标签肽(His-tag)的单链抗体ER(Fv),相对分子质量约为27 × 103,主要以包涵体形式存在,收获量约为10 mg·L-1.ELISA测定ER(Fv)与纯EGFR抗原的亲和常数为4.0×107L·mol-1.单链抗体能与肿瘤细胞表面的EGFR发生特异性结合,其与3种EGFR高表达肿瘤细胞的解离常数皆为10-7mol·L-1.细胞增殖实验显示,单链抗体可抑制EGFR高表达肿瘤细胞的增殖.体内抑瘤实验表明,单链抗体对人鳞状上皮癌A431裸鼠移植瘤具有中度的生长抑制作用,5,10和20 mg· kg-1 3个剂量组35 d的抑瘤率分别为43.9%,46.7%和54.8%,与对照组相比存在显著差异.结论 成功地表达了抗EGFR单链抗体ER(Fv),其对肿瘤细胞具有良好的亲和力和一定的生长抑制作用,为研制靶向EGFR的抗体药物提供基础.
-
抗人结肠癌单链抗体CL-3在大肠杆菌中的表达、复性和纯化
目的:为得到单链抗体高效表达,我们对抗人结肠癌单链抗体 CL-3 在大肠杆菌中的表达、复性和纯化进行了研究.方法:以重组质粒表达载体 pJW2-CL-3 转化大肠杆菌DH5α,重组克隆在培基中温控诱导,以包涵体形式表达单链抗体.包涵体经溶解、复性、纯化后,以SDS-PAGE及Western Blot鉴定表达蛋白,ELISA法鉴定单链抗体的免疫活性.结果:42 ℃诱导 5 h 蛋白表达量占菌体蛋白的 30%. 8 mol/L 尿素可将包涵体大部分溶解,稀释于复性缓冲液中静置 10 ℃ 48 h 以上可使包涵体蛋白复性.纯化峰经鉴定, 27 KD 处表达之蛋白为带有E-tag的抗人结肠癌单链抗体 CL-3,并证明其具有与抗原CEA特异性结合的功能,免疫活性与亲代抗体 CL-3 相似.结论:本研究获得的以包涵体形式在大肠杆菌中表达的抗人结肠癌单链抗体 CL-3,具有与亲代抗体相似的免疫活性,为高效表达单链抗体,用于肿瘤的诊断和治疗提供了依据.
-
从大容量噬菌体抗体库中筛选人源性抗角蛋白scFv
目的 从大容量噬菌体抗体库中筛选人源性抗角蛋白单链抗体(scFv),测定其特异性结合活性并进行基因序列分析.方法 以混合分子量人表皮角蛋白包被固相,对构建的大容量噬菌体抗体库进行筛选,经4轮"吸附洗脱扩增"后,挑取单克隆,用ELISA法测定特异性结合活性,并对阳性克隆抗体基因进行DNA指纹分析及序列同源性分析.结果 经4轮筛选,获得9株可表达抗人角蛋白单链抗体的克隆,酶切鉴定正确后,经DNA指纹分析及序列同源性分析证明为不同的抗体基因.结论 利用噬菌体抗体库技术获得了人源性抗角蛋白单链抗体,为临床应用研究提供了具有更广阔应用前景的人源小分子抗体.
-
妇科医学重要新闻
基础研究卵巢癌北京大学人民医院成功构建了具有卵巢特异性的抗卵巢癌单链抗体83B2ScFv.复旦大学附属妇产医院进行了上皮性卵巢原癌基因HER/neu基因表达影响免疫活性细胞分布,研究发现两者呈负相关,卵巢癌的免疫性细胞和T细胞随HER/neu过度表达而表达下降.
