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抗人IL-1β单链抗体的构建及其中和活性的检测
目的:原核表达抗人IL-1β(hIL-1β)的scFv,并对纯化后抗体的特异性、亲和力以及中和活性进行检测,为研制治疗类风湿关节炎的小分子抗体药物奠定基础.方法:使用PCR方法从含有抗hIL-1β抗体基因的质粒中获得抗hIL-1β的单链抗体基因,将其插入原核表达载体pET-27b(+)中,构建重组表达载体pET-27 b-A-hIL-1β-scFv.将该载体转化大肠杆菌Rosetta后诱导表达,经包涵体变性、复性得到可溶的抗hIL-1βscFv蛋白.利用高效液相色谱仪对其纯度进行分析后使用Western blot和ELISA方法测定scFv抗体对抗原特异性结合能力和亲和力,使用MTT的方法检测scFv抗体中和人IL-1β蛋白的能力.结果:成功地对抗hIL-1β单链抗体进行构建、诱导、表达和纯化.得到纯度为72.05％、相对分子质量约为28 ku的目的蛋白.ELISA和Western blot结果证实scFv蛋白对hIL-1β具有特异性结合能力.MTT实验结果证实该scFv抗体可以有效阻断hIL-1β刺激L929细胞的增殖.结论:通过原核表达系统得到的抗hIL-1β单链抗体,纯化后,鉴定其与hIL-1β蛋白有特异性结合能力,并且表现出中和hIL-1β的活性,为进一步研究治疗RA的小分子抗体奠定了基础.
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单链抗体-碱性磷酸酶融合蛋白的制备
目的:制备单链抗体-碱性磷酸酶融合蛋白.方法:把碱性磷酸酶编码区插入pSTE2-8E5质粒DNA,用scFvC66的重链和轻链可变区DNA取代scFv-8E5的重链和轻链可变区DNA,构成表达载体pSTE2-C66-Ap在大肠杆菌中表达,用聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫印迹法分析产物活性.结果:获得一个分子量为75 kD的scFvC66-Ap融合蛋白,可结合来自KG1a细胞裂解物中的一个分子量约60 kD的蛋白质带,其结合功能可通过其碱性磷酸酶活性直接测定.结论:建立了一个用大肠杆菌制备单链抗体-碱性磷酸酶融合蛋白的方法,它可能取代常规的碱性磷酸酶标记方法而用于免疫检测.
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抗转铁蛋白受体双价抗体的构建、表达及鉴定
目的:抗转铁蛋白受体(TfR)双价抗体(bsFv)构建、表达及其与细胞结合的活性鉴定.方法:以抗TfR的单链抗体(scFv)为模板,设计引物引入中间连接肽(G4s)及酶切位点AscI,通过PCR方法扩增两条scFv片段,将其连接并克隆至原核表达载体pAB1,转化大肠杆菌TG1,阳性菌经IPTG诱导表达,FCM检测bsFv与K562,HepG2肿瘤细胞结合的活性及特异性.结果:酶切鉴定及DNA测序证明该bsFv构建成功;SDS-PAGE、Western blot鉴定表明表达蛋白分子量与bsFv理论值一致;FCM结果证明bsFv可与K562,HepG2肿瘤细胞特异性结合,且结合的阳性率较scFv有所提高.结论:成功构建了抗转TfR的bsFv,且能与K562,HepG2肿瘤细胞特异性结合.
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抗CD20单链抗体融合显性抗原肽的原核表达和其抑瘤活性研究
目的：人工设计并表达美罗华（C2B8）单链可变区抗体与李斯特菌溶细胞素O（Listeriolysin O，LLO）显性抗原表位构成的重组融合蛋白（ScFv－pLLO），初步分析其抗淋巴瘤细胞活性。方法：查询数据库获得美罗华（C2B8）单抗VH 和VL基因序列，构建抗CD20单链抗体（ ScFv）基因序列，选取LLO的2个CD4＋T细胞表位，构建单链抗体融合抗原表位的重组蛋白基因序列，克隆至原核表达载体，经诱导表达纯化，流式细胞术和免疫共沉淀分析其与淋巴瘤细胞结合能力，细胞增殖实验测定其对淋巴瘤细胞生长的影响，凋亡实验分析其诱导淋巴瘤细胞凋亡的能力，淋巴细胞增殖实验分析其免疫原性。结果：成功诱导表达重组蛋白ScFv－pLLO。 ScFv－pLLO可不同程度地靶向结合不同淋巴瘤细胞系，并明显抑制Raji细胞生长和诱导其凋亡。 ScFv－pLLO可刺激免疫小鼠脾细胞增殖。结论：重组蛋白ScFv－pLLO保留了ScFv 的功能，可靶向结合和抑制CD20阳性淋巴瘤细胞的生长，同时可激活机体免疫应答，为进一步研究其模拟瘤细胞表面抗原和作为瘤细胞疫苗佐剂的功能奠定基础。
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特异性抗细胞表面分子单链抗体的分离和鉴定
目的:从抗KG1a细胞的噬菌体展示文库中分离和鉴定抗造血干/祖细胞表面分子单链抗体(scFv),克隆其基因并研究其对应抗原在不同细胞表面的分布.方法:用完整的KG1a细胞吸附法富集文库3轮,再用CD44单克隆抗体为引导分子进行引导选择,分离单克隆后用间接免疫荧光法鉴别其细胞结合特异性.对具有不同细胞结合特异性的克隆进行DNA序列分析,用一级结构不同的单链抗体作免疫印迹鉴别抗原分子量.结果:间接免疫荧光结果显示,64个阳性克隆分别识别不同的细胞系,分属3种细胞结合谱,DNA序列测定结果证明C95、H1两个克隆具有独特的一级结构,利用Western blot成功测定它们特异性识别KG1a细胞膜蛋白的表观分子量分别为34 kD/22 kD.结论:成功建立了分离和鉴定抗细胞表面分子phage-scFv单克隆的方法,并从抗KG1a细胞的噬菌体展示文库中分离出2个抗造血干/祖细胞的特异性克隆.
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抗TfR scFv-SLC融合蛋白的构建、表达与鉴定
目的:构建、表达和鉴定抗转铁蛋白受体(TfR)单链抗体(scFv)-次级淋巴组织趋化因子(SLC)融合蛋白.方法:以pDsRed2-N1-CCL21为模板,设计引物,采用PCR扩增得到两端有EcoRⅠ、NotⅠ酶切位点的SLC基因.以EcoRⅠ、NotⅠ双酶切pET28a+scFv载体和PCR产物,连接后转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导TfR scFv-SLC融合蛋白的表达.SDS-PAGE、Western blot分析TfR scFv-SLC的表达特性.FCM测定scFv-SLC与肿瘤细胞结合活性.结果:EcoRⅠ和NotⅠ双酶切鉴定可见约350 bp的小片段,与SLC的理论值相符,DNA测序结果表明含有TfR scFv-Linker-SLC序列,表明pET28a+scFv-SLC融合基因表达载体构建成功.IPTG诱导产物经SDS-PAGE分析可见约41 kD的条带,符合scFv-SLC理论值.FCM结果显示TfR scFv-SLC可与MCF-7、HepG2细胞结合,且结合的阳性率较TfR scFv有所提高.结论:成功构建与表达scFv-SLC融合蛋白,且能与MCF7、HepG2等细胞特异性结合.
关键词： 转铁蛋白受体 单链抗体 次级淋巴组织趋化因子 融合蛋白 -
抗B7-H4-scFv/PE38KDEL重组免疫毒素的表达和功能性检测
目的:构建基于抗B7-H4单链抗体(scFv)的重组毒素anti-B7-H4-scFv-PE38KDEL,检测毒素蛋白的抗肿瘤作用.方法:通过重叠延伸PCR(SOE-PCR)技术将anti-B7-H4-scFv基因和毒素PE38KDEL基因进行连接,重组基因克隆到原核表达载体 pET28a(+)中表达,蛋白经变复性和镍柱亲和层析(Ni-NTA)纯化后进行Western blot 鉴定;间接ELISA 和流式分析技术进行特异性鉴定.利用MTT法和皮下移植瘤模型实验,检测毒素对体外、内肿瘤细胞的抑制作用,并对肿瘤组织进行HE染色和免疫组化分析.结果:酶联后得到重组表达载体pET28a-anti-B7-H4-scFv-PE38KDEL,纯化后的毒素蛋白对肿瘤细胞具有一定杀伤力,并且在肿瘤模型实验中能抑制体内肿瘤的生长.结论:成功构建了基于抗B7-H4单链抗体的重组毒素表达体系,经鉴定重组毒素蛋白有良好的生物学功能活性和抗肿瘤活性.
关键词： B7-H4 单链抗体 绿脓杆菌外毒素PE38KDEL 重组免疫毒素 靶向治疗 -
抗人HAb18G分子单链抗体基因的构建及在大肠杆菌中的分泌表达
目的:构建抗人HAb18G分子单链抗体基因,并在大肠杆菌中进行分泌表达.方法:通过连接肽(Gly4Ser)3基因序列将已成功克隆的抗人肝癌单抗HAb18轻、重链可变区基因拼接成单链抗体(ScFv)基因,并在5′和3′端引入相应的酶切位点,克隆至改造的分泌性表达载体pCANTAB 5His之中,转化到E.coli HB2151中进行诱导表达.亲和层析纯化表达蛋白后,以SDS-PAGE电泳、Western blot及ELISA等方法分析检测表达产物.结果:经限制性酶切鉴定及DNA测序分析,证实基因构建正确.SDS-PAGE电泳和Western blot分析表明ScFv基因在大肠杆菌中成功表达.表达产物的相对分子质量(Mr)为31 kD,与理论预期值相符,并且可与相应的抗原特异结合.结论:成功实现了抗人HAb18G分子单链抗体的原核分泌表达,为其在人肝癌诊治中的进一步应用奠定了基础.
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与肝癌细胞系HepG2特异性结合单链抗体的筛选与序列分析
目的:从人源噬菌体抗体库中筛选与肝癌细胞系HepG2特异性结合的单链抗体,为寻找肝癌细胞表面特异性标志及靶向研究奠定基础.方法:以正常肝细胞系L02为阴性筛选细胞,以肝癌细胞系HepG2为阳性筛选靶细胞,从人源噬菌体抗体库(Griffin.1 Library)经三轮筛选后,阳性菌质粒PCR确定其中含有单链抗体基因的克隆,通过细胞ELISA及FCM筛选特异性的单链抗体噬菌体,通过ABI3730全自动荧光测序仪测序,并通过GeneBank比对进行同源性分析,IPTG诱导可溶性单链抗体表达,并检测其与肝癌细胞株结合的特异性.结果:获得了2个特异性较高的阳性噬菌体单个克隆.经DNA测序后, 在Genebank中与人的免疫球蛋白库进行比对,并用IMGT/V-Quest软件进行分析,确定为2个插入序列不同的单链抗体片段.经细胞ELISA证明其阳性克隆菌培养上清可与肝癌细胞株特异性结合.获得的序列成功登陆Genebank,序列号为AY686498-AY686499.结论:从人源噬菌体抗体库中筛选到与肝癌细胞系HepG2特异性结合的具有功能活性的单链抗体,为进一步寻找肝癌细胞表面特异性抗原及靶向研究奠定了基础.
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抗人纤维蛋白单链抗体的人源化
目的:人源化抗人纤维蛋白单链抗体,降低人抗鼠抗体反应.方法:从人免疫球蛋白基因数据库中挑选到与鼠源抗人纤维蛋白单链抗体scFv-8E5重链(VH-8E5)和轻链(VL-8E5)同源性高的序列,作为人源化改造的框架,其中植入scFv-8E5的互补决定区.人工合成其DNA片段,用DNA连接酶连接成完整的人源化VH-8E5和VL-8E5,构建表达载体,转化JM109后用IPTG诱导表达,ELISA测定其抗原结合活性.结果:表达产物分子量30 kD左右,人源化scFv-8E5与亲本抗体scFv-8E5抗原结合活性无明显差别,可耐受至少2 w,4℃保存,数次反复冰融或一定时间的37℃孵育.结论:人源化scFv-8E5具有特异性识别人纤维蛋白的活性,鼠源scFv-8E5的人源化基本获得成功.
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特异性抗人cyclin D1人源单链抗体的筛选
目的 从噬菌体抗体库中筛选人源性抗人cyclinD1蛋白的单链抗体并进行鉴定.方法 以原核表达并用Ni-NTA Agarose纯化的重组人cyclinD1蛋白为抗原,通过"吸附-洗脱-扩增"淘选过程从噬菌体抗体库中筛选特异性抗人cyclinD1蛋白的单链抗体,通过ELISA方法对获得抗体的特异性和结合活性进行分析鉴定.结果 经过4轮筛选,获得7株能与人cyclinD1蛋白结合的阳性克隆,其中3株噬菌体的可溶性表达单链抗体能与人cyclinD1蛋白有特异性结合活性.结论 利用噬菌体抗体库技术可以不经免疫过程制备出特异性的人源性抗人cyclinD1抗体.
关键词： 人cyclinD1蛋白 噬菌体抗体库 单链抗体 淘选 -
HIV-1 p24单链抗体的构建及其噬菌体文库筛选
目的通过噬菌体展示技术构建HIV-1 p24单链抗体库,从中筛选出高亲和力的抗体基因,为进一步单链抗体表达打下基础.方法从HIV患者的血清中提取mRNA,RTP-CR扩增出HIV-1 p24基因,扩增的产物用ClaⅠ和BstxⅠ双酶切消化后,连接到同样双酶切的pIRES1表达质粒,把构建的重组pIRES1-p24质粒免疫Balb/c小鼠.1个月后,取鼠脾细胞mRNA构建出单链抗体(ScFv)cDNA文库.该文库以噬菌粒pCANTAB5E cDNA为载体,转化大肠杆菌TG1,后用p24蛋白对表达的重组噬菌体单链抗体文库进行筛选.结果经过4轮吸附-洗脱-富集筛选,洗脱噬菌体滴度大于1010pfu/ml,ELISA及其测序表明获取了表达抗HIV1p24单链抗体的基因.结论单链抗体和噬菌体展示技术成功的应用简化了获取特异性的单链抗体基因程序.
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从噬菌体抗体库中筛选抗HIV-Tat蛋白单链抗体
目的 从Tomlinson(I+J)噬菌体抗体库中筛选人源化抗HIV-Tat蛋白单链抗体(scFv)并进行鉴定.方法 以HIV-Tat蛋白为抗原,通过"吸附-洗脱-扩增"过程从噬菌体抗体库中筛选特异性抗Tat蛋白单链抗体,对其进行基因序列测定,并检测其抗原结合活性.结果 经过筛选,获得了1株能与Tat蛋白特异性结合的阳性克隆,经检索kabat数据库,发现其轻、重链可变区分别属于VκⅠ型、VH Ⅲ型.结论 利用噬菌体抗体库技术可以不经过免疫制备出高特异性的人源化抗Tat蛋白单链抗体.
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抗人肝癌MDscFV基因的表达及其免疫活性初步研究
将抗人肝癌单克隆抗体MD的重链可变区VH和轻链可变区VL基因重组,并使其表达.采用PT-PCR技术扩增VH及VL基因,通过重叠延伸拼接PCR在VH和VL基因间引入连接短肽,体外构建MdscFV基因,经过常规转化与筛选,诱导表达蛋白.MDscFV基因全长为732bp,VH354bp位于上游;VL330bp位于下游.重组蛋白相对分子量36kDa.scFV保留了与亲本抗体MD相似的免疫活性.成功地构建了抗人单链抗体MDscFV,并获得了较高水平的功能性表达.
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基于同源模建技术的抗肝癌单链抗体人源化抗体库设计
目的：完成抗肝癌噬菌体单链抗体scFv DM的人源化设计，为进一步构建人源化抗肝癌噬菌体单链抗体库奠定基础。方法通过IgBlast搜索基因数据库获取鼠源抗体序列模板，从蛋白质晶体结构数据库获得结构模板；在 SGI图形工作站上，通过 InsightlⅡ软件包进行抗肝癌噬菌体单链抗体scFv DM的三维结构模建，分析抗体氨基酸序列和分子结构，确定影响抗原结合部位的框架区关键残基。结果成功模建抗肝癌噬菌体单链抗体scFv DM的三维结构，确定AAW67378、BAB18257分别为单链抗体scFv DM的重链和轻链框架区佳人源化模板，确定了人源化残基、回复突变的残基，将可能影响抗原结合位点结构的残基的鼠源和人源副本编入到人源化抗体库序列中。结论计算机辅助下的同源模建技术可为抗体人源化设计提供方案，为抗肝癌噬菌体单链抗体scFv DM同步实现人源化和优化提供可能性。
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抗Aβ42单链抗体对阿尔茨海默病小鼠脑中淀粉样沉积的改善作用
目的 探讨以β淀粉样蛋白(Aβ)42为靶抗原筛选人源天然单链抗体(scFv)噬菌体抗体库中的特异性抗体对阿尔茨海默病(AD)模型鼠中淀粉样沉积的影响.方法 以Aβ42抗原包被免疫管,对人源天然scFv噬菌体抗体库进行筛选,经过3轮吸附-洗脱-扩增淘选富集,制备单克隆噬菌体抗体颗粒,用酶联免疫吸附(ELISA)法检测scFv的结合活性,得到一株阳性克隆scFv23.采用Western印迹和免疫组化的方法检测了scFv23与Aβ42单体、寡聚体、纤维和鼠脑中Aβ沉积的结合能力.并通过甲氮甲唑蓝(MTT)法检测scFv23对Aβ42寡聚体引起细胞毒性的影响,同时采用硫黄素-T荧光法(ThT-F)测定scFv23对Aβ42聚集形成纤维的影响.后,通过体内实验检测了scFv23对AD鼠模型脑中Aβ42沉积的影响.结果 通过对人源天然scFv噬菌体抗体库进行筛选得到一株与Aβ42具有高亲和力的克隆scFv23.实验发现scFv23可以特异性识别Aβ42寡聚体,纤维聚集体和鼠脑中Aβ42沉积,但是不能与Aβ42单体特异性结合.根据体外实验结果,scFv23可以有效抑制Aβ42寡聚体所诱导的细胞死亡,并且scFv23可以抑制Aβ42纤维聚集体的形成.体内实验结果发现,scFv23可以有效清除AD鼠模型中Aβ42沉积.结论 通过噬菌体文库筛选得到的scFv23能够特异性识别脑组织中的淀粉样沉积,并且有效抑制转基因鼠中淀粉样沉积的形成.体外实验表明scFv23可以有效抑制Aβ42寡聚体所诱导的细胞毒性.特异性识别Aβ42的scFv可能会成为治疗AD的一种有效策略.
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人源化卵巢癌单链抗体基因的构建与表达
目的:通过基因工程技术获得完全人源化的卵巢癌患者自身的单链抗体并在毕氏酵母中获得表达,为人源化单链抗体(ScFv)在卵巢癌的诊断与治疗的应用提供实验基础.方法:用TRIZOL法自卵巢癌患者的淋巴细胞中提取RNA,利用SOEingPCR方法分别获得VH、VL基因,构建真核表达载体pPICZαa/ScFv.电转化毕赤酵母菌株X-33.用PCR法筛选转染阳性克隆,SDS-PAGE法鉴定甲醇诱导的培养上清液中的ScFv的表达,筛选高表达工程菌.结果:构建ScFv基因,VH与VL连接后得到700 bp左右的条带,ScFv基因在毕赤酵母中获得表达,在26 000处出现目的条带.结论:获得ScFv基因及其真核表达载体以及高效表达ScFv的毕赤酵母工程菌.
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大容量天然人源单链抗体库的构建及抗乙型肝炎病毒PreS1单链抗体的淘选
目的:从大容量抗体库中淘选全人源化抗乙型肝炎病毒PreS1的单链抗体.方法:以60例健康供者的外周血淋巴细胞为来源,构建了1010人源天然单链抗体库,并以PreS1抗原肽进行淘选.3轮淘选后,单克隆经ELISA检测,富集的特异性单克隆经E.coli HB2151表达后进行Western检测并测序.结果:3轮淘选之后,噬菌体的投入/产出比提高了100倍.抗原抗体反应结果显示,A410=1.0的抗PreS1的单链抗体得到富集.Western结果显示其插入的单链抗体片段正确.该抗体基因序列的DNAPLOT软件分析结果进一步表明该抗体是人抗体,其VH属于VH1亚族,Vλ属于Vλ1亚族.结论:这一技术是获得全人源化抗PreS1的单链抗体的有效途径,同时为基因工程抗体用于临床治疗乙型肝炎奠定基础.
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抗乙酰胆碱受体单链抗体酵母表达的特性鉴定
[目的]探讨毕赤酵母GS115表达的重症肌无力单链抗体A7的一般特性及与大鼠肋间肌乙酰胆碱受体的结合特异性.[方法]采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和蛋白印迹试验,检测已经转化至毕赤酵母GS115中的重症肌无力重组载体pPIC9K-ScFv A7表达的单链抗体A7蛋白的分子质量;应用间接免疫荧光技术确定表达蛋白与大鼠肋间肌乙酰胆碱受体的亲和性.[结果]毕赤酵母GS115培养上清液中有目的蛋白的表达,分子质量约为44ku;间接免疫荧光试验显示,在大鼠肋间肌细胞间有荧光出现.[结论]单链抗体A7可以在毕赤酵母中成功地表达,并且可与大鼠肋间肌乙酰胆碱受体结合.
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重症肌无力单链抗体基因的制备
[目的]构建抗人乙酰胆碱受体主要免疫原区单链抗体.[方法]应用多聚酶链反应从抗人乙酰胆碱受体主要免疫原区抗原结合片段扩增重链和轻链可变区基因,并克隆到载体噬粒pHEN2.将含有单链抗体基因的重组噬粒转化大肠杆菌DH5α,分离提纯重组噬粒后再经酶切、琼脂糖凝胶电泳检查以确认单链抗体基因的正确性.[结果]电泳检查发现了大小分别为378 bp,339 bp和762 bp的重链可变区、轻链可变区和单链抗体基因,且位置正确.[结论]已成功地构建了抗人乙酰胆碱受体主要免疫原区单链抗体基因.
