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单链抗体的构建及其在医学上的应用
基因工程抗体在疾病诊断、治疗及医学研究等方面都有着广泛的应用.近几年来,国内外学者对抗体的研究已迈入基因工程抗体阶段,其中单链抗体(single chain Fv,scFv)因其具有分子质量小、穿透力强、体内循环半衰期短及排除了Fc段所致的免疫复合物反应等优点,成为基因工程抗体探索领域中的研究热点.尤其是将scFv应用于医学的研究已取得突破性进展,现就scFv的构建及其在医学上的应用综述如下.
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基于TNF功能表位设计新型人源单链抗体
目的：开发基于 TNF 功能表位的新型人源单链抗体。方法利用自主研制的鼠抗 TNF-α中和单抗 Z12能特异性识别 TNF-α的141~146位功能表位特性，通过理论模拟构建 TNF/抗体 Z12相互作用的复合物模型设计获得功能性拮抗肽（PT2、PT3、PT4、PT7）以及单域抗体 PTVH5（以人抗体可变区重链框架 VH5为支架合理展示 PT2、PT3、PT4），利用计算机辅助分子设计以及同源模建、分子对接方法，进一步合理选择人抗体可变区轻链框架（Vκ1）作为展示支架，通过构象判别、作用能比较以及识别区域确认并选择合适的连接肽设计新型单链分子 ScFv_AB1。结果理论分析发现，ScFv_AB1稳定性较好，识别 TNF-α的141~146功能位点（即 Z12识别的位点）。生物学实验证明， ScFv_AB1能与 TNF-α结合、抑制 TNF-α与TNFR 的结合、抑制 TNF-α介导的细胞毒作用。结论初步验证了“借助计算机模建，基于人抗体可变区的框架结构和拮抗肽设计单链抗体分子”的策略是可行的，从而为人源小分子抗体的制备提供了一条可供选择的途径。
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抗明胶酶单链抗体与力达霉素融合蛋白抗肿瘤作用机制及疗效研究
目的：探讨抗明胶酶单链抗体 Fv 与力达霉素（LDM）融合蛋白的抗肿瘤作用机制及疗效。方法采用三联径向加压 C4柱制备 LDM 发色团 AE，体外分子重建将其装入融合蛋白 Fv-LDP 中，Superdex 75层析获得 Fv-LDP-AE。反相 HPLC 测定纯度或相对含量。流式细胞术测定 DNA 含量；采用 SA-β-gal 染色、Western blot 和细胞伤口愈合实验分别检测药物对细胞衰老、蛋白表达和迁移的影响；通过动物模型评价药物疗效。结果 Fv-LDP-AE 承袭了 LDM 诱导肿瘤细胞周期阻滞、凋亡和裂亡的作用特点，并显示出更强的诱导衰老和抗迁移作用。Fv-LDP-AE 诱导凋亡和抑制迁移依次与 caspases 通路激活和 MMP-2降调节有关。Fv-LDP-AE 可抑制小鼠和裸鼠移植瘤生长，抑制率分别可达到86.6%和82.5%。结论 Fv-LDP-AE 对小鼠和裸鼠移植瘤有效，可能与其对细胞周期阻滞、凋亡、裂亡和衰老的诱导以及迁移的抑制有关。
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HBsAg人源噬菌体单链抗体的筛选及其在临床诊断中的应用
目的筛选乙型肝炎病毒(HBV)表面抗原(HBsAg)的人源噬菌体单链抗体,并探讨其在临床治疗和诊断中的应用价值.方法以HBsAg阳性血清超速离心纯化的HBsAg为固相抗原,从噬菌体单链可变区半合成抗体库中经过5轮"吸附-洗脱-扩增"筛选过程,获得特异性较强的HBsAg人源单链可变区抗体(ScFv);用该抗体对10例石蜡包埋的乙型肝炎患者肝组织进行免疫组化鉴定. 结果酶联免疫吸附法(ELISA)结果表明,制备的HBV 人源单链抗体能与HBsAg抗原特异性结合;免疫组化结果表明,该抗体能够特异性识别乙型肝炎患者肝组织中的HBsAg抗原,与正常肝组织及丙型肝炎病毒(HCV)的抗原均无交叉反应. 结论此法制备的单链抗体亲和性好,特异性强,且制备方法简便,周期短,为HBV病原的检测提供了新的有效试剂,为今后HBsAg人源抗体的研究和应用奠定了基础.
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易错PCR提高人源抗狂犬病毒单链抗体的亲和力
目的 通过易错PCR技术提高1株人源抗狂犬病毒单链抗体RV08的亲和力.方法 采用Agilent公司GeneMorph Ⅱ Random Mutagenesis Kit对RV08轻、重链可变区进行易错PCR扩增,随机引入突变,通过单链抗体(Single-chain antibody fragment ScFv)噬菌体呈现技术构建随机突变抗体文库,经狂犬病毒颗粒aG株固相富集筛选,通过ELISA和IFA鉴定阳性抗体克隆并进行序列测定.利用IgG表达载体VH/VK双质粒系统瞬时转染293T细胞实现IgG抗体的分泌型表达,通过非竞争ELISA测定突变抗体亲和力.结果 RV08随机突变抗体库的库容为6×106 cfu/ml,目的基因插入率为100％.重链序列突变频率约为0.95％,轻链序列突变频率约为1.2％,后获得5株高亲和力的抗体突变株,其中3株抗体HL46、HL2和HL37亲和力分别为原始克隆RV08的1.79倍、1.47倍和1.23倍.结论 易错PCR技术与噬菌体抗体库技术相结合使得抗体亲和力获得明显提高,为抗体的体外亲和力成熟提供了参考方法.
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人源性bFGF单链抗体的筛选、表达及鉴定
目的 用重组人碱性成纤维细胞生长因子(rhbFGF)筛选大容量人源噬菌体抗体库,获得能与bFGF特异性结合的人源性单链抗体(scFv).方法 用rhbFGF对大容量人源噬菌体抗体库进行4轮"吸附-洗脱-扩增"筛选,并通过phage ELISA法对随机挑选的克隆进行抗原结合活性测定,得到的阳性克隆进一步进行原核可溶性表达及鉴定.结果 从104个随机挑选的克隆中,筛得39株抗bFGF的抗体,通过对抗体可变区基因进行多样性分析,发现存在8种不同抗体可变区基因,挑选其中8株phage ELISA显色高的克隆进行酶切和测序鉴定,发现其中7株为正确的抗体基因序列,通过大肠杆菌成功的进行了scFv的可溶性表达,通过竞争ELISA发现其中一株scFv能够抑制bFGF与其高亲和力受体FGFR1βⅢC的结合.结论 通过筛选噬菌体抗体库获得到7株抗bFGF特异性抗体,其中一株抗体能够抑制bFGF与其高亲和力受体FGFR1的结合.
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去唾液酸糖蛋白受体H1亚单位的表达、纯化及其单链抗体的筛选与鉴定
目的去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)H1亚单位的重组、表达、纯化及其单链抗体的筛选与鉴定.方法将ASGPR H1亚单位糖识别区基因(CRDH1)定向克隆至原核表达载体pET-32c经IPTG诱导表达,表达产物用Ni2+螯合柱亲和纯化,免疫印迹技术(WB)检测;用纯化的CRDH1对人源噬菌体抗体库进行4轮固相筛选,阳性克隆用表达标记(Trx-His-s tag)进行差异筛选.取阳性噬菌体C3感染宿主菌HB2151,37℃振荡培养过夜,终浓度为1 mmol/L的IPTG诱导表达,12%SDS-PAGE与Western blot鉴定以及免疫组化鉴定纯化的单链抗体C3与肝细胞结合的特性.结果CRDH1/pET-32c在原核系统经诱导表达出相对分子质量(Mr)约35×103大小的融合蛋白,以包涵体的形式存在;通过Ni2+亲和柱纯化获得CRDH1融合蛋白;经4轮筛选和差异筛选后,有2株可分泌性表达与CRDH1特异性结合的单链抗体,DNA序列分析表明单链抗体重链基因和轻链基因分别属于人免疫球蛋白VH3家族和VKI家族.噬菌体C3经诱导表达出Mr约28×103大小的融合蛋白,可溶性分泌表达于培养基中;通过Ni2+亲和柱纯化获得单链抗体,ELISA、Western blot表明单链抗体C3能较好结合rCRDH1,免疫组化显示该单链抗体可与肝癌细胞、肝细胞特异结合.结论成功表达ASGPR并筛选出其人源单链抗体.该单链抗体可与表达的rCRDH1以及肝细胞和肝癌细胞特异性结合,提示对肝脏疾病的靶向治疗有潜在的应用价值.
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来自噬菌体抗体库识别KG1a细胞的scFv5C1的高效表达、纯化及其生物学特性
目的为深入研究源于噬菌体抗体库特定单链抗体（scFv）的功能和其识别抗原的分子特征，将识别KG1a细胞的单链抗体5C1 scFv高效表达、纯化；用scFv测定未知抗原的相对分子质量（Mr）；并研究5C1 scFv对KG1a部分细胞生物学特性的影响。方法基因重组构建表达5C1 scFv的载体pSTE-5C1，在大肠杆菌中诱导表达，金属离子螯和亲和层析法纯化，获得高纯度的活性5C1 scFv；借助生物素-链亲和素的高亲和力和高灵敏度的显色系统，用Western blot分析其识别的KG1a细胞膜蛋白的Mr；用聚集实验分析5C1 scFv对KG1a细胞同型聚集的影响。结果 5C1 scFv在大肠杆菌中获高效表达，纯化后活性蛋白产量可达每升培养物50～60mg，纯度大于95%；成功地测定了其识别抗原的Mr为（85.0/124.5）×103；并确认5C1 scFv以浓度依赖方式抑制KG1a细胞的同型聚集。结论高效表达纯化的5C1 scFv特异性识别Mr为（85.0/124.5）×103的KG1a细胞膜表面分子，此分子可能是一种在KG1a细胞表面表达的参与细胞同型聚集的分子或受体。这些结果为进一步深入研究抗原本质及克隆抗原分子基因奠定了良好的基础。
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人源抗HER2单链抗体/鱼精蛋白截短体融合蛋白的表达、纯化及鉴定
在人类乳腺癌组织中人类表皮生长因子受体2 (HER2)和受体趋化因子4(CXCR4)的表达成正相关,由于HER2与CXCR4/CXCL-12轴在乳腺癌骨转移中的重要作用,使其成为可供选择的肿瘤治疗靶点.本研究将HER2单链抗体(ScFv)与鱼精蛋白截短体(tP)融合,以期获得同时具有抗原与核酸结合活性的ScFv-tP融合蛋白,核酸与该融合蛋白结合后,有望实现小分子干扰RNA( siRNA)的靶向递送,对HER2与CXCR4/CXCL-12轴进行RNA干扰(RNAi),为新型抗肿瘤药物应用于临床提供资料.
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重组抗HBsAg单链抗体在HBV转基因小鼠体内作用的研究
目的研究重组人源抗HBsAg单链抗体(HBscFv)在HBV转基因小鼠体内的活性作用,探讨HBV转基因小鼠作为HBsAg特异性抗体的结合活性评价模型的可行性.方法工程菌表达的HBscFv包涵体经固定化金属螯合层析和分子排阻层析两步纯化后,分步透析复性.复性后的HBscFv(0.9g/L)经尾静脉注射HBV转基因小鼠,一定时间后测定鼠血清中HBsAg的浓度,计算抗体注射前后HBsAg浓度下降的百分比(结合率),同时以人血源HBsAb IgG(40U/ml)和生理盐水作为对照.结果两步纯化获得纯度达到98%的重组HBscFv.HBscFv制品能够结合转基因小鼠体内的HBsAg,其结合率为(30.47±9.85)%,与生理盐水组差异有显著性(P<0.001),与HBsAb IgG组差异无显著性(P>0.05);对照品HBsAb IgG的结合率为(39.00±7.43)%,与生理盐水组差异也有显著性(P<0.001).比较HBscFv和HBsAb IgG的结合率及其浓度,求得HBscFv的结合效价为31.58U/mg.结论 HBscFv在转基因小鼠体内具有特异性结合HBsAg活性,HBV转基因小鼠可发展为评价HBsAg特异性抗体的体内结合活性的候选模型.
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抗细粒棘球蚴人工重组B抗原人源单链可变区抗体的筛选、鉴定和免疫活性检测
近年来,随着噬菌体抗体表面展示技术的不断发展,人们正广泛应用该技术研制各种人源噬菌体单链抗体.单链抗体仅为完整抗体的六分之一[1,2],因其具有分子小、容易进入病灶周围的微循环及在肾脏内清除异物快等优点,在疾病的治疗方面引起广泛重视.本研究利用该技术,成功地筛选到了抗细粒棘球蚴重组B抗原的人源单链可变区抗体,并对其特异性进行了鉴定.
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大容量噬菌体抗体库的构建及鉴定
目的构建大容量噬菌体单链抗体库,从中筛选人源单链抗体(ScFv). 方法从正常成人外周血和新生儿脐血分离淋巴细胞,用RT-PCR扩增轻链可变区基因(VL)和重链可变区基因(VH),通过重叠PCR法将VH和VL拼接形成ScFv基因,并克隆入噬菌体表达载体PDF,得到ScFv初级噬菌体抗体库.以高MOI超感染cre+菌株BS1365,通过loxp-cre定位重组系统,介导轻重链的组合配对,得到大容量抗体库,用多种抗原对抗体库进行生物淘筛,鉴定抗体库的性能. 结果获得了6×1010的大容量单链噬菌体抗体库.分别用卵清蛋白、胃蛋白酶、铁蛋白、人角蛋白、人TNF-α、地高辛等6种抗原进行筛选,均得到多样性的特异性噬菌体抗体. 结论经loxp-cre定位重组系统在单细胞内重组成功地构建了大容量单链噬菌体抗体库,初步尝试对6种抗原进行筛选均获成功,提示该抗体库可用于制备具有应用前景的人源抗体.
关键词： 噬菌体抗体库 Loxp-cre重组系统 单链抗体 -
ASGPR单链抗体-蜂毒肽融合蛋白的构建及其溶红细胞效应
去唾液酸糖蛋白受体(asialoglycoprotein receptor,ASGPR)是一种异源低聚物的内吞受体,定位于肝脏实质细胞朝向窦状隙一侧的细胞膜表面,在介导肝脏疾病靶向治疗方面具有潜在应用价值.我们在获得抗ASGPR单链抗体C1的基础上[1],将C1作为靶向分子,与编码蜂毒肽(melittin)的寡核苷酸基因连接,并克隆至原核表达载体,在大肠杆菌中融合表达,并探讨了融合蛋白(C1M)的体外溶红细胞效应.
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抗HIV-1 gp41单链抗体导向SEAD227A融合蛋白原核温控表达及活性检测
目的获得抗HIV-1 gp41单链抗体与葡萄球菌外毒素A融合表达的重组导向毒素蛋白.方法人工合成能广泛识别HIV-1 gp41的单链抗体(ScFv41)基因和金黄色葡萄球菌外毒素A(SEA)基因,将SEA基因第 227位编码Asp(D)的密码子GAT转换成编码Ala(A)的密码子GCT,并对两基因进行密码子优化.以大肠杆菌温控型表达质粒pBV220为载体,分别构建单表达ScFv41的质粒pBV-41和SEA与ScFv41融合表达的质粒pBV-SL41,转化大肠杆菌感受态细胞,通过提高温度诱导表达,表达产物经分子筛层析折叠复性后,检测单链抗体结合活性及重组导向毒素介导的细胞毒淋巴细胞(CTL)杀伤活性.结果表达质粒pBV-41和pBV-SL41分别在E.coli BL21(DE3)plys中44℃诱导6 h、42℃诱导7 h得到较高表达,经SDS-PAGE、薄层扫描分析表明,目的蛋白分别占菌体总蛋白的14.359%和23.482%,目的蛋白经复性后可与HIV-1抗原条发生良好的结合反应,并且SL41可激活外周血淋巴细胞(PBMC)并介导其杀伤稳定表达HIV-1 gp160蛋白的靶细胞.结论成功得到ScFv41与SEA融合表达蛋白SL41,为研制抗HIV-1重组导向毒素奠定基础.
关键词： HIV gp41 单链抗体 金黄色葡萄球菌外毒素A 表达 -
抗人纤维蛋白单链抗体重链可变区的人源化
目的 人源化抗人纤维蛋白单链抗体的重链,降低人抗鼠抗体反应. 方法 从基因文库中挑选到与鼠源抗人纤维蛋白单链抗体重链(VH-8E5)同源性71.8%的人源免疫球蛋白HUMHCH109重链(VH )序列,作为人源化改造VH-8E5的框架.人工合成人源化VH-8E5片段,用连接酶连接成完整的人源化VH-8E5,构建表达载体pOPE101-VH-8E5.转化JM109后用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导表达. 结果 经聚丙烯酰胺电泳和ELISA证明表达产物相对分子质量30×103左右,有特异性识别和结合人纤维蛋白能力,是亲本抗体ScFv-8E5活性的4/5左右.人源化ScFv-8E5表达产量为转化菌总蛋白的11.2% . 结论 人源化VH-8E5仍具有特异性识别人纤维蛋白的活性,ScFv-8E5重链的人源化基本获得成功.
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单链抗体在肿瘤靶向治疗中的研究进展
恶性肿瘤严重威胁着人类的健康,传统的治疗手段无论是手术治疗、放疗、化疗等都难以达到理想效果,因此恶性肿瘤的治疗一直是医学界难以克服的世界性难题.近年来,随着基因工程技术的高速发展,抗体在肿瘤的治疗以及诊断上成为了重要的手段之一.而作为小分子抗体的代表,单链抗体(ScFv)因其具有抗原亲活性、分子量小、穿透力强、体内循环半衰期短及排除了Fc段所致的免疫复合物反应等优点,而成为基因工程抗体研究领域中的热点课题.本文就单链抗体在肿瘤靶向治疗中的应用做一综述.
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131I标记的甲状腺未分化癌人源单链抗体在荷瘤裸鼠模型的放射免疫显像
目的 测定131I标记的甲状腺未分化癌(ATC)人源单链抗体(scFv)的放射性纯度与比活度,并探讨其在荷瘤裸鼠模型的体内分布情况和放射免疫显像特点,以期为ATC的诊断及治疗提供一种新的方法.材料与方法接种ATC细胞构建荷人ATC裸鼠模型.采用氯胺T法实现scFv的131I标记,Sephadex G25M柱纯化标记抗体,采用三氯醋酸法测定其标记率,采用纸层析法测定131I标记scFv的放化纯度、室温稳定性及血清稳定性.荷瘤裸鼠尾静脉注射131I-scFv后12、24、48、72 h取各组织器官分析131I-scFv在体内组织器官中的生物分布情况,另取荷瘤裸鼠尾静脉注射131I-scFv后12、24、48、72 h进行SPECT静态显像,观察瘤内放射性浓聚,待肿瘤清晰显影,进行SPECT/CT图像融合.结果 纯化后的131I-scFv标记率为91.64％,放化纯度为(93.3±0.3)％;131I-scFv放于室温及血清孵育1、6、12、24 h后所测得放射性化学纯度均高于90％.131I-scFv在肿瘤组织、肝、肾、肠、血液中具有较高的放射性分布.SPECT显示131I-scFv能够在肿瘤组织中选择性浓聚,肿瘤组织靶/非靶比值在48 h时达高为4.38,且显影清晰.结论 成功制备131I-scFv,131I-scFv在荷瘤裸鼠模型中有较好的显像效果,为进一步开展ATC的诊断及治疗研究奠定基础.
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捕获噬菌体酶联免疫吸附法筛选抗去唾液酸糖蛋白受体单链抗体的价值
目的评价捕获噬菌体酶免疫吸附试验法(ELISA)在筛选抗去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)单链抗体(scFv)中的价值.方法以含ASGPR基因的质粒(CRDH1/pET3b)为模板,通过聚合酶链反应扩增获得ASGPR H1亚单位糖识别区基因(CRDH1),定向克隆至原核表达载体pET-32c,并经IPTG诱导表达,其表达产物用Ni2+螯合柱亲和纯化;然后,采用捕获噬菌体ELISA对人源噬菌体抗体库进行筛选和鉴定,同时对筛选的抗CRDH1单链抗体进行DNA测序、表达、纯化和免疫印记鉴定.然后,与间接噬菌体ELISA比较.结果 CRDH1/pET-32c在原核系统中经诱导表达出分子量约35 000的融合蛋白,且以包涵体形式存在;通过Ni2+亲和柱纯化获得CRDH1融合蛋白后,采用捕获噬菌体ELISA进行四轮筛选,在60个噬菌体克隆中有45株与CRDH1特异性结合,其中仅1株与重组蛋白标签有交叉结合反应.DNA序列分析表明,有9株DNA序列各异,9株可分泌性表达与CRDH1特异性结合的scFv,纯化的scFv也可特异性识别rCRDH1.计算该筛选方法的假阳性率为2%,低于间接噬菌体ELISA筛选的假阳性率(58%).结论捕获噬菌体ELISA筛选CRDH1特异性scFv可有效降低硫氧还蛋白标签(Trx·Tag)引起的假阳性,提高筛选阳性率,并成功筛选出9株具有rCRDH1特异性的scFv.
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抗胃癌单链抗体可变区序列分析及空间结构模拟
目的:考察抗人胃癌抗体可变区轻、重链序列,选择合适的连接肽构建单链抗体,并模拟其三级结构,预测单链抗体结构与功能关系.方法:利用获得的源自抗人胃癌噬菌体抗体库中筛选出的抗体可变区轻、重链序列,通过分析抗体轻重链可变区C-端、N-端结构特征,选择合适的连接肽,进而利用分子模拟原理构建单链抗体可变区的空间构象;经过力学优化、动力学模拟确定其稳定的三维结构:借助距离几何学、表观静电分布、溶液可及性表面积分析,对单链抗体的结构特征及理化性质进行理论分析.结果:成功获得的单链抗体稳定构象,除连接肽位置的1个氨基酸构象不合理之外,其他位置构象合适.轻链CDR1、CDR2以及重链CDR3溶液可及性表面积分布较强,而轻链CDR3、重链CDR1、CDR2分布较弱.重链CDR3区带有较强的负电性.结论:所构建的单链抗体三维空间结构具有较高的合理性和可靠性.
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抗体库优化策略对特异性抗肝癌单链抗体的人源化
目的:对特异性抗肝癌单链抗体(single chain variable fragment,scFv)DM同步进行人源化和优化,以获得亲和力高和免疫原性低的人源化抗肝癌单链抗体.方法:通过分子结构和序列分析,确定对抗原结合位点的构象有重要影响的骨架区(FR)残基,把难以判断回复突变残基的人、鼠源副本同时编入人源化抗体序列中;通过重叠延伸PCR技术合成人源化抗体全基因,利用噬茵体展示技术构建人源化组合抗体库;通过肝癌细胞筛选阳性克隆,ELISA方法测定各个克隆抗原结合活性;用硫氰酸盐洗脱法测定并比较亲本抗体和人源化scFv的相对亲和力.结果:成功构建人源化组合抗体库,实际库容4.77×10 5,包含由2 5不同重链和2 2不同轻链组成的128种人源化DM;经过筛淘及ELISA鉴定,获得HDM1、HDM2和HDM3 3个阳性克隆,相对亲和力指数分别为HDM1 1.6 mol/L、HDM2 1.2 mol/L和HDM3 2.2 mol/L.结论:抗体库优化法是一个高效、简便的人源化方法;获得的3株阳性克隆HDM1、HDM2、HDM3与亲本抗体DM同样具有良好的抗原结合特异性和较高的亲和力.
