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浓缩铀脑内照射对新生大鼠脑发育的生化影响
为研究浓缩铀对新生大鼠脑发育的影响,给新生大鼠侧脑室内注射不同剂量的浓缩铀2μl (分别含235U 0、1、5 和 10μg)后,观察其对早期体格生长、行为发育的影响.以放射自显影示踪术观察脑内放射性核素行径定位,放射免疫技术检测超氧化物歧化酶(SOD)、内皮素(ET)的含量变化.结果显示,放射性核素行径主要定位于细胞核,在细胞浆和细胞间隙中亦有呈现;新生大鼠出现生长延迟及神经行为异常;随着浓缩铀剂量的增加,大鼠的小脑、皮质、海马、间脑中SOD、ET的含量有变化,小剂量组SOD和ET增升,而大剂量组却呈明显的抑制.结果提示,从生物化学角度表明,在新生大鼠中α辐射体浓缩铀对发育脑的损伤具有神经细胞的敏感性、易脆性和代偿性特征.
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提高新生大鼠原代心肌细胞纯度方法的探讨
目的：探讨提高新生大鼠原代心肌细胞纯度的方法。方法：应用0.08%心肌细胞消化液重复消化出生第1-3天乳鼠的心肌组织多次；收集的细胞用含10%胎牛血清的DMEM培养基中和。用差速贴壁分离法分离后，加入红细胞裂解液，以除去红细胞，加入溴脱氧尿嘧啶（Brdu）纯化心肌细胞后置CO2培养箱孵育2天，无血清同步化1天。结果：分离1只乳鼠获得的心肌细胞产量约为1.2×106个，有活力心肌细胞占90%以上，心肌细胞纯度>90%，3-4天后心肌细胞融合成片，并出现自发性节律性搏动。结论：该方法在保证心肌细胞产量和心肌细胞活性的同时，能大幅度提高心肌细胞纯度。
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血脂康对血管紧张素Ⅱ诱导新生大鼠心肌成纤维细胞增殖的影响
心肌纤维化是导致心室顺应性和收缩功能下降而发生泵衰竭的一个重要因素,心肌纤维化主要是因为心肌成纤维细胞(cardiac fibroblasts,CFs)的活化、增殖及其所分泌的胶原增多与沉积所致.血脂康是从特制的中药红曲中经提炼精制而成的血脂调节剂,被称为中国人的"天然他汀".现有文献证明,血脂康具有诸多调脂以外的作用,如抗氧化、减轻血管炎症、抑制血管平滑肌增殖、稳定动脉粥样斑块、改善血管内皮功能、减轻左室质量[1]等,被广泛应用于心脑血管疾病的治疗中.
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mBDNF/Akt/CREB和proBDNF/RhoA信号传导失衡在丙泊酚致新生鼠认知功能障碍的作用
目的 探讨mBDNF/Akt/CREB和proBDNF/RhoA信号传导失衡在丙泊酚致新生鼠认知功能障碍的作用.方法 新生7d大鼠随机分为6组(每组n=12):C组连续7d腹腔注射0.9％氯化钠溶液;P1组注射o.9％氯化钠溶液6d后,第7天注射丙泊酚;P2组连续7d注射丙泊酚;T、K及D组连续7d注射丙泊酚后,第7天再分别注射TAT-Pep5、K252a与DMSO.各组随机抽取6只大鼠进行血糖血气的监测,其余大鼠喂养至第25天进行Morris水迷宫实验,测试空间学习记忆能力.取海马组织,通过Western blot检测mBDNF/Akt/CREB及proBDNF/ RhoA信号通路的表达.结果 与C组比较,P1组与P2组大鼠幼年期逃逸潜伏期延长,空间探索时间缩短(P＜0.05),且P2组改变更为显著.与D组比较,K组大鼠幼年期逃逸潜伏期延长,空间探索时间缩短(P＜0.05);T组大鼠幼年期逃逸潜伏期缩短,空间探索时间延长(P＜0.05).与C组比较,P1组与P2组海马mBDNF/Akt/CREB表达下调(P＜0.05),且P2组下调更为显著;P1组与P2组海马proBDNF/RhoA表达上调(P＜0.05),且P2组上调更为显著.与D组比较,K组海马Akt/CREB下调(P＜0.05),T组海马RhoA下调(P＜0.05).结论 丙泊酚导致新生大鼠幼年期学习记忆功能障碍与mBDNF/Akt/CREB抗凋亡信号通路抑制,proBDNF/RhoA促凋亡信号通路增强有关.
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奥帕曲拉抑制内皮素-1诱导新生大鼠心肌细胞肥大
许多研究证明心力衰竭及心肌缺血时循环中的内皮素-1 (endothelin-1,ET-1)的浓度升高,终导致心肌细胞肥大以及心脏成纤维细胞(CFs)增殖和胶原合成[1-2].本实验室曾报道奥帕曲拉(Omapatrilat,OMA)呈浓度依赖性抑制ET-1诱导的CFs增殖及胶原合成,此作用部分通过B2受体介导[2],但OMA对心肌肥大及其机制目前尚未见报道.本研究探讨OMA抗心肌肥大的作用及其是否与NO/cGMP及PKC调控有关.
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新生大鼠神经干细胞的培养方法
神经干细胞研究是目前神经科学研究的热点,如何快速经济地培养出神经干细胞是每个研究者必须面对的问题.
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新生大鼠海马神经元原代无血清培养与鉴定
目的 建立一种简单、易行的海马神经元无血清体外培养方法以获得高纯度、高活力的海马神经元.方法 取新生24 h内SD大鼠,分离海马,经消化后种植于包被有Matrigel基膜的玻片上,24h后换含有N2、1B27的Neurobasal无血清培养基,于不同时间在倒置相差显微镜下观察细胞的生长状态；采用β-tublinⅢ免疫荧光细胞化学技术鉴定海马神经元纯度.结果大部分海马神经元于3～24h贴壁且可长出细长突起,3d细胞具有典型神经元的形态特征,5d后神经元突起进一步增多并形成稠密的网络连接,7d后神经元胞体丰满,趋于成熟.经 β-tublinⅢ免疫荧光技术鉴定纯度为94.2％±3.6％.结论此方法简单有效,可获得高纯度的海马神经元.
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缝隙连接蛋白43在培养的新生大鼠心室肌细胞中的时空表达
目的 讨连接蛋白43(Cx43)在培养的新生大鼠心室肌细胞中的时空表达变化规律.方法 利用免疫细胞化学方法及免疫电镜技术,观测培养2、4、8、10、12、16、20、26、30d大鼠心室肌细胞Cx43蛋白的表达;结果培养第2d心肌细胞开始表达Cx43,表达部位主要在细胞质中,呈点状;第4d细胞质中点状分布减少.主要集中在细胞膜连接处;第10d在细胞连接处增多,呈条、链状分布;以后基本恒定,无明显变化;第30d时Cx43颗粒出现紊乱分布; 绪论 Cx43在培养的新生大鼠心肌细胞中的表达随培养时间延长而出现位置和量的变化,与培养心肌细胞的生长、发育及功能变化一致.
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新生大鼠视网膜神经干细胞的分离培养与诱导分化
目的初步探讨新生大鼠视网膜神经干细胞的诱导分化. 方法从新生大鼠视网膜分离具有自我更新能力的细胞克隆,传代.用脑源性神经营养因子(BDNF)与血清单独或联合培养诱导其分化,采用免疫细胞化学及免疫荧光化学技术对分化前后的细胞进行鉴定. 结果分离获得的细胞具有连续克隆的能力,表达nestin.分化后细胞分别表达多种神经元及神经胶质细胞的特异性标志物;BDNF与血清联合作用可使细胞向神经元分化的比例提高. 结论新生大鼠视网膜内存在具有自我更新与多分化潜能特性的神经干细胞,BDNF作为辅助诱导剂,可促进其存活、分化、成熟,并可能诱导其向神经元方向分化.
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CD34在体外培养大鼠骨骼肌卫星细胞发育的免疫组织化学研究
目的观察CD34在发育中的体外培养大鼠骨骼肌卫星细胞中的分布,探讨CD34在发育中的大鼠骨骼肌卫星细胞中的作用.方法原代培养骨骼肌卫星细胞,第1次传代后,取贴壁2、4、8、16、24、48和72 h的细胞行CD34多克隆抗体的免疫组织化学染色.结果CD34免疫阳性反应存在于发育中的骨骼肌卫星细胞中,但在形成肌管后,细胞核免疫反应转为阴性,同时成纤维细胞呈弱阳性反应.结论CD34在发育中的骨骼肌卫星细胞中有一定量的分布,它可能在骨骼肌的生理发育中起某种调节作用.
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胰岛素样生长因子1在新生大鼠短暂脑缺血损伤修复中的关键作用
目的 7日龄新生大鼠短暂脑缺血诱导侧脑室室管膜下区(SVZ)神经干细胞增殖,观察胰岛素样生长因子1( IGF-1)对神经干细胞增殖的影响. 方法 7日龄新生SD大鼠64只,随机分为缺血组(n=24)、假手术组(n=24)、缺血阻断剂组(n=8)和缺血生理盐水组(n=8).利用免疫组织化学方法观察缺血组和假手术组在缺血后1、4、7d SVZ新生细胞数量和IGF-1表达的变化,并观察缺血阻断剂组和缺血生理盐水组在IGF-1受体阻断剂(JB1)阻断7d后SVZ新生细胞数量和IGF-1表达的变化. 结果 与同时间点假手术组比较,缺血后1、4、7d的SVZ新生细胞和IGF-1阳性细胞数量均显著增加,差异有统计学意义(P＜0.05)；使用JB1后,缺血阻断剂组IGF-1的表达被阻断,IGF-1阳性细胞缺如,而缺血生理盐水组IGF-1表达正常；使用JB1后,缺血阻断剂组SVZ新生细胞数量显著减少,与缺血生理盐水组相比,差异有统计学意义(P＜0.05). 结论 新生大鼠缺血再灌注损伤上调了IGF-1的表达,IGF-1表达增加促使SVZ神经干细胞增殖；使用JBI后,IGF-1的表达被阻断,神经干细胞增殖也显著减少,提示IGF-1在脑缺血损伤修复中起关键作用.
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新生大鼠心脏成纤维细胞体外分裂方式
目的 观察体外培养状态下心脏成纤维细胞(CFs)的形态特征和分裂增殖方式.方法 原代培养新生大鼠CFs,免疫荧光双标法分别检测波形蛋白和磷酸化组蛋白H3(H3P)共表达,波形蛋白和微管蛋白共表达.利用活细胞工作站和荧光显微镜观察处于不同分裂期的细胞时相.结果 CFs 0.5 ～ 1h贴壁,培养2～3 d细胞增殖旺盛,大量细胞进入有丝分裂期,其中多数CFs先隆起变圆,而少数则仍维持扁平状进行分裂.偶见无丝分裂现象.圆隆型有丝分裂时长为20～ 30min,扁平型分裂时长为40 ～ 50min.分裂前期胞核形状规则,H3P开始表达;前中期核膜破裂,纺锤体形成;中期染色体排列在赤道面,H3P高表达,纺锤体呈典型纺锤样;后期染色单体分开并移向两极,H3P在染色单体上持续表达;末期两个子核形成,微管聚集在两子核之间;胞质分裂期,两个子细胞形成,H3P不表达.结论 体外培养的CFs存在圆隆型和扁平型两种有丝分裂形态,在分裂方式上存在有丝分裂和无丝分裂两种形式.
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心脏成纤维细胞生物表型多样性
目的 探讨心脏成纤维细胞(CFs) 生物表型多样性.方法 新生1～3天SD大鼠12只,胰蛋白酶/胶原酶联合消化法分离培养新60只生大鼠CFs,比较原代和传代培养细胞形态学变化,免疫组织化学学检测鉴定常见成纤维细胞标记波形蛋白(vimentin) 、成纤维细胞特异性蛋白1(FSP1) 和盘状结构域受体(DDR2) 的表达,细胞免疫荧光检测CFs干细胞标记nanog、c-kit、sca-1、CD73和CD90的表达,细胞免疫荧光三标技术检测CFs干细胞标记间的共表达情况.结果 酶联合消化法分离培养的CFs收获细胞量大,第3代细胞活力好、纯度高. Vimentin、FSP1和DDR2在CFs中均表达,但DDR2在CFs中呈强表达.部分CFs分别表达nanog、c-kit、sca-1、CD73和CD90,部分nanog阳性的CFs分别和CD73、CD90和sca-1,及其CD90和sca-1存在共表达,nanog + /CD73 + 共表达阳性率高(59. 02％ ± 8. 39％) ,与其他3组相比差异均有极显著性(P＜0.01);而nanog + /CD90 + 共表达阳性率与nanog + /sca-1 + 之间差异无显著性(P＞0.05) ,但这两组与CD90 + /sca-1 + 相比差异均有极显著性(P＜0.01);CD90 + /sca-1 + 共表达阳性率均低于其他3组,差异具有极显著意义(P＜0.01).结论 CFs是具有干细胞特征混合细胞群,在表型上具有多样性.
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新生大鼠心肌telocytes在体外培养状态下的分裂方式
目的 探讨体外培养新生大鼠心肌telocytes的分裂方式.方法 采用0.1％胶原酶I/0.125％胰蛋白酶联合消化法分离培养新生大鼠心肌telocytes,活细胞工作站动态捕捉和苏木素染色检测telocytes的分裂方式.结果 酶联合消化法培养新生大鼠心肌telocytes纯度高、活力好,增殖迅速.无丝分裂时,胞核变大,以出芽方式生长,形成哑铃状细胞核,核芽逐渐拉伸并与母细胞分离.有丝分裂前中期,染色质缩短变粗为染色体,整齐地排列在赤道板处;分裂末期,染色体到达两极,子核已初步形成;胞质分裂期,胞质逐步拉开,形成两个子细胞.在有丝分裂不同时期,心肌telocytes均保持其原有的形态特征.结论 体外培养心肌telocytes增殖时有丝分裂和无丝分裂两种方式并存.
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新生大鼠多器官成纤维细胞nanog蛋白的表达差异
目的 探讨新生大鼠心、肝、脾、肺、肾和皮肤中成纤维细胞nanog蛋白表达差异及其意义.方法 用免疫组织化学、免疫荧光和体外细胞培养技术,对成纤维细胞进行nanog蛋白和波形蛋白(vimentin)标记,检测并比较新生大鼠不同器官中成纤维细胞nanog蛋白和vimentin表达及共表达特征.结果 新生大鼠心、肝、脾、肺、肾和皮肤6种器官中均有nanog蛋白和vimentin表达,在每个器官中均有少数成纤维细胞共表达这两种蛋白,共表达率分别为心(10.07±0.77)％、肝(9.97±3.70)％、脾(11.23±2.98)％、肺(15.07±2.87)％、肾(11.75±2.76)％、皮肤(16.14±1.28)％,其中皮肤和肺的共表达率高于心、肝、脾、肾(P＜0.05).结论 共表达nanog蛋白和vimentin的成纤维细胞可能更具有干细胞样特性;新生大鼠皮肤和肺的成纤维细胞可能更具有组织损伤修复潜能.
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新生大鼠心telocytes的形态学和蛋白标记
目的 探讨新生大鼠心telocytes(TCs)的形态学特征并验证其是否表达神经细胞、神经胶质细胞的特异性标记.方法 酶消化法培养新生大鼠原代细胞,免疫细胞化学、扫描电子显微镜鉴定TCs,免疫荧光技术检测TCs的神经细胞和神经胶质细胞的蛋白表达.新生大鼠大脑组织免疫组织化学染色作为阳性对照.结果 免疫组织化学检测显示波形蛋白(vimentin)表达阳性,免疫荧光检测vimentin和CD34共表达,但TCs内神经元特异性烯醇化酶(NSE)、GFAP、OX42、2'3'-环腺苷酸-3'-磷酸二酯酶(CNpase)表达阴性.扫描电子显微镜下TCs形态清晰典型,特征形态明显.结论 大鼠心TCs虽然具有与神经细胞类似的形态,但其并不具有神经细胞的特性.
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干细胞因子在体外培养大鼠骨骼肌卫星细胞表达和发育的免疫组织化学研究
目的观察干细胞因子(SCF)在发育中的体外培养大鼠骨骼肌卫星细胞中的分布,探讨SCF在大鼠骨骼肌卫星细胞中的作用. 方法原代培养骨骼肌卫星细胞,经两次传代后,取培养2、4、8、16、24、48、72h的细胞行SCF单克隆抗体的免疫组织化学染色. 结果 SCF免疫阳性反应物存在于发育中的骨骼肌卫星细胞中,形成肌管后,细胞核呈强阳性反应. 结论 SCF在发育的骨骼肌卫星细胞中有表达,它可能在骨骼肌的生理发育中起某种调节作用.
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新生大鼠神经干细胞球体外生长传代及分化鉴定
近年来,有关神经干细胞分离培养和研究已经成为神经生物学研究的热点.已有许多研究小组报道了大鼠、小鼠和人胚胎脑组织神经干细胞的分离和培养方法[1-3],但对新生大鼠的脑组织神经干细胞进行分离传代培养则鲜有报道.由于神经干细胞可作为一种移植手段治疗神经系统各种病变和损伤,还可用于研究不同生长因子对神经干细胞的体外发育的影响,其有着广泛的应用前景.因此,我们实验室利用新生当天大鼠大脑皮质和中脑进行神经干细胞的分离培养取得成功,现报道如下.
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新生鼠出血肺组织中内皮素-1、降钙素基因相关肽的水平与表达
目的研究新生大鼠出血肺组织中内皮素-1(ET-1)和降钙素基因相关肽(CGRP)的水平与表达,探讨两者与肺出血(PH)的关系.方法新生Wistar大鼠分正常对照组(NC)10只、PH组30只,前者置于正常室温(37℃),后者于低温[肛温(10±1)℃]、缺氧(FiO25%)4 h后快速复温(肛温37℃)、供氧(FiO2100%)2 h.免疫组化及放射免疫法测定两组肺组织ET-1及CGRP的水平及表达.结果 (1)PH组发生弥漫性、局灶性、点状PH分别占40%、33.3%、及26.7%;(2)PH组ET-1、CGRP免疫反应强度及irET-1、irCGRP水平均明显高于NC组(P＜0.01),其中弥漫性PH肺组织中ET-1免疫反应强度及irET-1水平高于点状及灶性PH(P＜0.05),但不同程度PH间CGRP免疫反应强度及irCGRP水平无差异;(3)ET-1主要表达于肺血管内皮细胞(PVEC)等部位,CGRP主要表达于肺神经内分泌细胞(PNECs).结论急性低温缺氧后复温供氧,可使PVEC中ET-1持续异常释放,PNECs释放的CGRP处于失代偿状态,从而导致肺血管痉挛,肺动脉高压,PVEC受氧自由基损害,终导致肺出血.
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细胞外信号调节激酶1/2在慢性肺疾病新生大鼠肺成纤维细胞中的研究
目的 探讨持续吸入高氧致慢性肺疾病新生大鼠肺成纤维细胞中细胞外信号调节激酶(ERK) 1/2蛋白信号表达的动态变化.方法 足月新生鼠生后12 h内分别持续吸人体积分数90％的高氧和空气,于3、7、14 d随机处死动物后,进行肺成纤维细胞的原代培养,应用免疫组化、Western-blot及real-time PCR方法检测ERK1/2蛋白及mRNA表达.结果 免疫组化及Western blot结果显示,高氧7、14 d时高氧组肺成纤维细胞p-ERK1/2蛋白的表达均明显高于同时间点对照组(P＜0.01).Western blot结果同时显示各组间ERK1/2总蛋白的表达差异无统计学意义.real-time PCR结果表明各组间ERK1、ERK2 mRNA水平差异无统计学意义(P＞0.05).结论 ERK1/2蛋白水平磷酸化活化参与了高氧致新生大鼠慢性肺疾病中肺纤维化的发生.
