OGT多克隆抗体的制备及特异性分析

目的:为了探讨O-GlcNAc糖基转移酶OGT的生理和病理作用,需制备能高效特异性检测OGT的抗体.方法:在NCBI数据库中,查找人源OGT基因序列,根据OGT的结构特点,选取OGT的C末端催化结构域中的一段多肽序列(464-949位点氨基酸)做抗原.首先,构建OGT的C末端催化结构域(464-949位点氨基酸)的重组表达载体pET30-a-OGT-C,转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,IPTG诱导表达融合His标签的OGT-C蛋白,Ni+珠亲和层析法纯化提取OGT-C蛋白.再以OGT-C重组蛋白作为抗原,免疫Wistar大鼠制备多克隆抗体,并用间接ELISA法检测OGT抗体的效价,Western blotting鉴定抗体特异性.结果:多抗效价达1∶80000;在免疫印迹实验中,此多抗可以高效的检测重组抗原,并可以特异性识别培养细胞内源表达的ncOGT和mOGT这2种OGT亚型.结论:实验结果表明,获得高效价、高特异性的OGT多克隆抗体,在OGT的生物学研究中可以用于检测ncOGT和mOGT的表达.

FHL1在胸主动脉瘤发病机制中的初步研究

目的:研究FHL1蛋白在胸主动脉瘤发病机制中的作用.方法:利用Western Blotting分析胸主动脉瘤患者与正常人主动脉组织中FHL1蛋白表达的情况,利用免疫组织化学检测FHL1蛋白在主动脉组织中的定位,并进一步分析该蛋白在两组中的表达情况,结合文献报道分析FHL1蛋白在胸主动脉瘤发病机制中的作用.结果:Western Blotting、免疫组织化学分析均表明FHL1蛋白在胸主动脉瘤患者主动脉组织表达水平较正常人明显降低,FHL1蛋白主要定位于主动脉血管平滑肌细胞的细胞质中.结论:FHL1蛋白在胸主动脉瘤患者主动脉组织中明显降低,这可能导致主动脉血管平滑肌细胞增殖能力下降,从而在胸主动脉瘤的发病中发挥重要的作用.

Notch1信号蛋白在卵巢癌细胞系中的表达

目的:检测卵巢癌细胞系中Notch1信号蛋白的表达,为在卵巢癌细胞中对Notchl进行RNA干涉研究的体外实验筛选靶细胞.方法:采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法及Western blotting对卵巢癌细胞系SKOV3、HO-8910、HO-8910-PM和3AO中Notch1进行检测.结果:Notch1信号蛋白在4种卵巢癌细胞系中均有表达,其在HO-8910-PM中表现为高表达,在SKOV3和3AO中表现为中等表达,在HO-8910中表现为低表达.结论:HO-8910-PM适合作为靶细胞,进行Notch1信号蛋白的RNA干涉研究.

家蚕过敏原CSP5克隆表达、纯化鉴定及分析

克隆家蚕过敏原CSP5(chemosensory protein 5 precursor)基因,表达、纯化该蛋白,鉴定其免疫活性,并进行生物信息学分析.人工合成家蚕化学感受蛋白5前体CSP5基因,将其连接至pMD18-T克隆载体,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达后进行纯化,用western blotting和ELISA鉴定其免疫学特性,并采用生物信息学方法预测CSP5蛋白的理化性质、三级结构、潜在B细胞抗原表位.本研究成功克隆了纯度较高的重组CSP5蛋白,测序鉴定蛋白分子质量约为14.25 kD.重组过敏原CSP5能与家蚕过敏患者血清IgE发生特异性结合.生物信息学方法推导其潜在B细胞抗原表位为17～22、35～36、51～55、70～74、106～ 110、112～115.获得的重组蛋白CSP5具有与天然蛋白相似的免疫学活性,为以标准化抗原作为临床特异性诊断和治疗以及由家蚕引起的过敏性疾病的进一步研究奠定了基础.

人精子纤维鞘内CABYR蛋白与AKAP3及Ropporin蛋白结合

p73蛋白在食管癌中表达及其临床意义

目的:研究p73蛋白在食管癌中的表达及其临床意义.方法:采用Western bloting技术检测37例食管鳞状细胞癌肿瘤组织、癌旁组织、区域淋巴结和相应正常食管组织中p73 蛋白的表达,并探讨与食管癌临床病理特征的关系.结果:37例食管肿瘤组织中有18例(48.6%)p73蛋白过度表达,其阳性表达率显著高于相应的癌旁组织、区域淋巴结和正常组织(P＜0.05),并与食管癌TNM分期、细胞分化程度和病理类型均无明显关系(P＞0.05).结论:p73蛋白在食管肿瘤组织中呈高水平阳性检出率,p73蛋白可能参与了调控食管癌的发展过程.

热激蛋白47在人脑胶质瘤组织中的表达及其临床意义

目的:研究热激蛋白47(heat shock protein 47,HSP47)在人脑胶质瘤组织中的表达情况及其临床意义.方法:收集2008年1月至2009年12月沈阳军区总医院神经外科收治并手术的92例胶质瘤患者的肿瘤组织和同期手术切除病理诊断为胶质细胞增生的非胶质瘤组织10例,另有15例冻存的胶质瘤组织(收集于2014年5月至2014年6月),应用免疫组织化学方法、Western blotting检测其中HSP47蛋白的表达部位及表达水平,并结合随访资料分析HSP47蛋白表达与临床病理指标、患者生存期之间的关系.结果:HSP47阳性主要定位于Ⅲ、Ⅳ级胶质瘤细胞胞质和血管内皮细胞,HSP47在胶质瘤组织中表达率为52.17％、在非胶质瘤组织中无表达,x2检验非肿瘤组和胶质瘤组之间HSP47表达的差异有统计学意义(x2=9.855,P=0.002).不同年龄、性别胶质瘤患者间HSP47蛋白的表达差异无统计学意义(P =0.423,P=0.820);HSP47蛋白随着WHO病理级别增高阳性表达逐渐增多(P＜0.05).HSP47蛋白低表达组患者中位生存时间明显长于高表达组患者[43(95％ CI,22.4～63.6)vs 17(95％ CI,14.5～19.5)个月,P＜0.01].结论:HSP47在胶质瘤中过表达,并与病理级别呈正相关,高表达患者预后不良;HSP47可以作为胶质瘤诊断和治疗的新靶点.

结核分枝杆菌特异性抗原Rv3117的克隆表达和诱导小鼠免疫应答的实验研究

目的 克隆表达结核分枝杆菌Rv3117蛋白,并进行诱导小鼠免疫应答的初步研究.方法 通过聚合酶链反应(PCR)扩增结核分枝杆菌Rv3117基因,克隆入pET32a载体,构建重组质粒pET32a-Rv3117,转化入大肠埃希菌BL21(E.coli) plysS(DE3),异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达,镍柱亲和纯化,通过SDS-PAGE鉴定其表达情况；以目的蛋白免疫C57BL/6小鼠血清并行Western blotting分析.结果 成功构建原核表达载体pET32a-Rv3117,获得纯化的目的蛋白,其在E.coli BL21 plysS(DE3)中主要以可溶性形式表达,相对分子质量(48 100)与预期相符.Western blotting分析结果显示在目标位置有阳性条带.结论 成功克隆结核分枝杆菌重组蛋白Rv3117,其能够诱导C57BL/6小鼠的免疫应答.

自发性糖尿病长爪沙鼠环氧化酶(COX)-2在三种组织中的表达

目的 研究环氧化酶(COX)-2基因在糖尿病长爪沙鼠3种组织中的表达水平,进一步探索其与长爪沙鼠糖尿病发生和发展的关系.方法 选取糖尿病长爪沙鼠和正常沙鼠各6只,分别采集动物的骨骼肌、肝脏和肾脏组织,用实时PCR和Western blotting检测COX-2基因在各组织中mRNA和蛋白表达水平.结果 实时PCR的结果表明,COX-2基因的mRNA水平在糖尿病组动物的骨骼肌组织中表达与对照组无明显差异,而肝脏和肾脏组织中有表达升高趋势.Western blotting结果显示,糖尿病组COX-2的蛋白水平在肝脏和肾脏组织中存在表达升高趋势,且肾脏具有统计学意义.结论 COX-2在糖尿病长爪沙鼠肝脏和肾脏组织中表达升高,在肾脏组织尤其明显,说明COX-2对长爪沙鼠糖尿病的影响可能发生在肝脏和肾脏组织中.

ND3在自发性糖尿病长爪沙鼠5种组织中的表达

目的 分析糖尿病长爪沙鼠5种组织中ND3基因在mRNA和蛋白水平的表达,以期探索长爪沙鼠糖尿病模型中ND3的作用及其靶器官.方法 选取血糖正常对照组沙鼠和糖尿病实验组沙鼠各6只,分别采集动物的肾脏、肝脏、骨骼肌、脑和心脏组织,采用实时定量PCR和Western blotting方法检测在各组织中ND3 mRNA和ND3蛋白水平表达状况.结果 与对照组动物相比,糖尿病长爪沙鼠ND3 mRNA表达水平在肾脏组织中极显著升高,肝脏和肌肉组织中则显著降低,脑组织中仅有降低趋势,而在心脏组织中仅有升高趋势.检测ND3蛋白水平表明,除心脏组织外,其他组织均与mRNA水平表达结果一致.结论 肾脏组织可能是糖尿病长爪沙鼠ND3基因作用的主要部位,同时在其他4种组织中该基因也发挥着一定作用.

仙地液对大鼠溃疡性结肠炎结肠组织中ICAM-1表达的影响

目的:检测大鼠结肠组织中的ICAM-1,观察中药灌肠对ICAM-1蛋白表达的影响,探讨中药灌肠治疗溃疡性结肠炎可能的作用机制及环节.方法:大鼠随机分为6个实验组,自由饮用葡聚糖硫酸钠(dextran sulfate sodium,DSS)水溶液诱导UC模型,以仙地液灌肠干预后,用Western Blotting免疫印迹增强化学发光的方法,以Actin为内参照半定量检测大鼠结肠黏膜及组织中ICAM-1蛋白的表达情况.结果:经中药灌肠干预后的大鼠与模型组相比结肠黏膜及组织中的ICAM-1含量均明显下降,P＜0.05.结论:中药灌肠可能通过下调溃疡性结肠炎结肠组织中的ICAM-1表达实现其治疗作用.

纳米山药多糖对4种肿瘤细胞的作用

目的 研究纳米山药多糖的抗肿瘤活性,并对其作用机制进行探究.方法 细胞增殖/毒性检测试剂盒(CCK-8试剂盒)测定各给药组对肿瘤细胞抑制率的影响;Western blotting检测不同给药组给药48 h后对4种肿瘤细胞凋亡相关蛋白caspase-3、caspase-8表达情况的影响;细胞划痕实验检测各给药组对肿瘤细胞迁移能力的影响.结果 CCK-8实验表明,与对照组相比,纳米山药多糖高剂量组(80 ng·mL-1)、氟尿嘧啶组(80 ng·mL-1)能够明显抑制肿瘤细胞增殖(P＜0.05);Westernblowing实验显示纳米山药多糖高剂量组(80 ng·mL-1)与氟尿嘧啶组(80 ng·mL-1)肿瘤细胞凋亡蛋白caspase-3、caspase-8条带灰度降低,蛋白含量表达与对照组比较明显减少(P＜0.05);细胞划痕实验表明纳米山药多糖作用于4种肿瘤细胞48 h后,细胞愈合率均有不同程度的下降(P＜0.05).结论 纳米山药多糖剂量的升高,促进肿瘤细胞凋亡蛋白caspase-3和caspase-8蛋白酶原的活化,酶原降解增多,抑制肿瘤细胞生长,促进肿瘤细胞凋亡,降低细胞划痕愈合率,具有抗肿瘤活性.

孕晚期吗啡暴露子代鼠NR2 B亚基与吗啡条件位置偏爱易感性的关系

目的：探讨吗啡条件性位置偏爱（ CPP）不同易感性的孕晚期吗啡暴露的子代鼠脑伏隔核（ NAc）中N－甲基－D－天冬氨酸（ NMDA）受体NR2B亚基水平。方法：孕晚期SD大鼠48只随机分为吗啡组（ M组）和生理盐水组（ N组）。首剂量为2 mg／kg，逐日递增1 mg／kg，至6 mg／kg维持，头颈部皮下注射。 N组孕鼠以同样的方式注射等体积的生理盐水。取上述2组体质量接近的子代鼠各70只，正常喂养至8周龄。每组子代鼠采用恒量法（3 mg／kg）连续颈背部皮下注射吗啡7 d 进行条件位置偏爱（ CPP）训练，训练结束24 h后对CPP效应进行检测。根据吗啡条件化训练后CPP分值（ CPP测试值－CPP基数值）的大小将M组子代鼠分为高偏爱组（n＝10）、中偏爱组（n＝30）、低偏爱组（n＝10）。采用Western blotting 方法检测高，低偏爱组和N组子代鼠伏隔核区NR2B亚基的表达。结果：①预测试时，各组的CPP基数值的差异无统计学意义（P＞0．05）；吗啡高偏爱组CPP分值（552．6±132．6）s明显高于低偏爱组（223．4±55．14）s和N组子代鼠（42．93±31．78）s（P＜0．01），差异有统计学意义。②Western blotting结果示高偏爱组子代鼠的NR2B亚基表达量（0．81±0．01）均明显高于低偏爱组（0．64±0．01）和N组子代鼠（0．55±0．01，P＜0．01）。结论：产前吗啡暴露的子代鼠吗啡CPP易感性高可能与伏隔核的NR2B亚基水平上调有关。

乙酰葛根素对Aβ25-35诱导BV-2小胶质细胞Caspase-3表达的影响

目的 探究乙酰葛根素对β淀粉样蛋白(Aβ25-35)诱导BV-2小胶质细胞形态及含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3(Caspase-3)表达的影响.方法 用凝聚态Aβ25-35诱导体外培养的BV-2小胶质细胞作为阿尔茨海默病炎症细胞模型,将细胞分为对照组、模型组、Caspase-3抑制剂(Z-DEVD-fmk)组以及乙酰葛根素低(0.1 μmol/L)、中(0.4 μmol/L)、高(1.6 μmoL/L)剂量共6组,采用倒置相差显微镜观察小胶质细胞形态变化,应用Western blotting检测Caspase-3蛋白表达水平.结果 形态学结果显示,Aβ25-35可激活小胶质细胞使其由静息态变为阿米巴样,Caspase-3抑制剂、乙酰葛根素可改善Aβ25-35诱导的小胶质细胞形态改变.Western blotting结果显示,与对照组相比,模型组Caspase-3表达显著升高,差异有统计学意义(P＜0.01);与模型组比较,Caspase-3抑制剂、乙酰葛根素各剂量组Caspase-3表达均显著降低(P＜0.01);与Caspase-3抑制剂组相比,乙酰葛根素低、中剂量组Caspase-3表达均显著升高(P＜0.01),高剂量组则无统计学意义.结论 乙酰葛根素可抑制Aβ诱导BV-2小胶质细胞激活,其机制可能与降低Caspase-3表达有关,且以高剂量组效果较好.

Notch1与Jagged1蛋白在大肠腺癌组织中的表达及临床病理意义

目的 探讨Notch1和Jagged1蛋白在大肠腺癌发生发展的作用.方法 采用免疫组织化学PV -9000法和Western blotting法检测78份大肠腺癌组织(大肠癌组),40份大肠腺瘤组织(腺瘤组)及40份正常大肠组织(距大肠腺癌组织远端5 cm,正常组)Notch1与Jagged1蛋白表达情况,分析其与大肠癌临床病理参数的关系.结果 大肠癌组Notch1、Jagged1蛋白阳性率明显高于腺瘤组及正常组,P＜0.05；Notch1和Jagged1蛋白表达强度与大肠癌组织学分级、Dukes分期和淋巴结转移密切相关,P均＜0.05.大肠癌组Notch1与Jagged1蛋白表达关系呈正相关(r =0.407,P＜0.01).结论 Notch1和Jagged1蛋白在大肠腺癌的发生与发展中起重要作用.

建立快速体外肉毒毒素检验方法研究

[目的]建立一种新的快速鉴定检出污染食品中肉毒毒素的简单方法并应用于食物中毒中肉毒毒素的检验.[方法]利用Western blotting结合化学发光技术以及密度分析方法,对污染食品中肉毒毒素及其型别、含量进行分析.[结果]建立的方法能快速检出污染食品中所含肉毒毒素并能对毒素型别、含量进行分析,检出灵敏度可达1pg/ml,在6h内能检出4pg/g食品的B型肉毒毒素.三种肉毒毒素与其各自抗体之间也未发现交叉免疫印迹反应.[结论]本法完全可用于食物中毒肉毒毒素的快速检验,灵敏度高,特异性好.

功能未知基因C6orf120对大鼠肝脏功能的影响

目的 观察功能未知基因C6orf120敲除后对大鼠表型变化的影响,初步探究该基因的功能.方法 将雄性野生型( wild type,WT)大鼠作为对照组,C6orf120基因敲除(C6orf120 --)大鼠作为实验组,称量子代大鼠20 d体质量及观察子代生长情况.利用逆转录聚合酶链式反应(reverse transcription PCR, RT-PCR)技术检测大鼠肝组织TNF-α的转录水平.利用Western blotting技术分析6~8周WT大鼠和C6orf120 -/-大鼠肝脏组织 TNF-α和Cleaved caspase-3的表达情况.结果 与WT大鼠相比,C6orf120 -/-子代大鼠出生20 d体质量显著降低(t=5. 292,P<0. 0001).成年C6orf120 -/-大鼠TNF-α、Cleaved caspase-3在肝组织中的表达水平显著高于WT大鼠(P=0. 0172、0. 0301).结论 基因C6orf120可能对大鼠肝功能具有一定的保护作用,其保护机制可能与抗炎和抗凋亡有关.

糖尿病大鼠视网膜组织突触核蛋白家族的表达

目的 观察突触核蛋白( synuclein)家族三种同源蛋白基因α-synuclein、β-synuclein和γ-synuclein在8周糖尿病大鼠视网膜组织中的表达情况,初步探讨其在糖尿病视网膜病变( diabetic retinopathy,DR)中的作用.方法 采用限制性片段差异显示聚合酶链反应技术,建立正常和8周糖尿病大鼠视网膜基因表达谱,经生物信息学分析两者差异,初步确定α-synuclein、β-synuclein和γ-synuclein为DR相关基因,并以实时定量PCR和Western blotting方法分别从mRNA和蛋白水平上对三个基因的表达进行验证.结果 限制性片段差异显示聚合酶链反应结果显示,糖尿病大鼠α-synuclein、β-synuclein和γ-synuclein表达明显强于正常大鼠；实时定量PCR结果显示,α-synuclein、β-synuclein和γ-synuclein在糖尿病大鼠(1.41±0.14、1.30±0.18、1.47±0.15)的表达(相对Ct比值)高于正常大鼠(1.67±0.12、1.62±0.20、1.86±0.26),差异均有显著统计学意义(均为P＜0.01)；Western blotting显示,糖尿病大鼠三种蛋白的表达(相对A值比值)分别为0.31±0.06、0.60±0.11、0.39±0.09,显著高于正常大鼠(0.19±0.07、0.44±0.09、0.29±0.08),差异均有显著统计学意义(均为P＜0.01).结论 α-synuclein、β-synuclein和γ-synuclein在糖尿病大鼠视网膜组织中表达显著升高,α-synuclein的表达升高可能在DR中起到神经毒性作用,而β-synuclein和γ-synuclein的高表达则可能对神经细胞起到保护作用.

视网膜色素变性组织内脑源性神经营养因子动态变化的实验研究

目的 观察视网膜变性组织内脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)的mRNA和蛋白的表达情况,研究视网膜早期的生长发育规律,进而探讨BDNF在视网膜生长发育以及变性过程中的可能作用.方法 出生后0～4周龄的rd小鼠(病变组)和C57BL小鼠(正常对照组)在每个时间点各取10只处死后,即刻摘除眼球,显微手术操作取出视网膜组织,提取mRNA及蛋白,采取RT-PCR和Western blotting方法分别对不同时间点、不同组别的视网膜组织内BDNF mRNA和蛋白质的表达水平进行测定.结果 BDNF mRNA表达在病变组呈现明显高于正常组的趋势(PN 0周、2周、3周、4周时,2组相比P=0.000),但蛋白质表达低于正常组(PN 0周、1周、2周、3周、4周时,2组相比P=0.000).结论 BDNF在视网膜变性过程中有保护视网膜感光细胞的作用.

同源异型盒基因HOXB7在乳腺癌组织中的表达及其意义

目的:探讨同源异型盒基因B7 (HOXB7)在乳腺癌组织中的表达及其临床意义.方法:分别应用West-ern blotting和RT-PCR方法检测48例乳腺癌组织、20例乳腺纤维腺瘤组织、20例正常乳腺组织中HOXB7蛋白和HOXB7 mRNA的表达水平,并分析HOXB7 mRNA的表达量与乳腺癌患者年龄、临床分期以及病理分级、淋巴结转移等特征的关系.结果:与乳腺纤维腺瘤组织和正常乳腺组织相比,HOXB7蛋白及HOXB7 mRNA在乳腺癌组织中的表达水平均显著增高(P＜0.05),且HOXB7蛋白及HOXB7 mRNA在乳腺纤维腺瘤组织中的表达水平显著高于正常乳腺组织(P＜0.05).临床分期Ⅲ期组、浸润性乳腺癌病理分级Ⅲ级组的乳腺癌病例中HOXB7mRNA的表达水平均显著高于Ⅰ期组(P＜0.05),淋巴结转移阳性组HOXB7 mRNA的表达明显高于淋巴结转移阴性者(P＜0.05).结论:HOXB7在乳腺癌组织中高表达,且与乳腺癌恶性程度、分期、分级密切相关.