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转基因水稻潮霉素标记基因PCR检测方法的建立及其在基因水平转移研究中的应用
为建立用于基因水平转移研究, 尤其是DNA经加工和消化后稳定性研究的针对转基因水稻潮霉素标记基因hpt(hygromycin phosphotransferase)的定性和实时定量PCR体系,设计针对hpt的上游通用引物多个片段定性PCR扩增体系,以植物叶绿体基因rbcl为内对照,PCR扩增产物经测序验证.将定性PCR中小片段(236 bp)连接到质粒载体pUC18-pMD T载体上,提取质粒经验证后做外标.应用TaqMan-MGB荧光探针和引物,建立定量的外标校正曲线法,并评价方法的精密度.建立的定性PCR体系能稳定扩增出236 bp～910 bp不同大小的5个hpt片段,并经测序验证.实时定量PCR的线性范围为105～10拷贝(R2=0.998),低能检出10拷贝,重复性好.本研究已成功建立了用于转基因水稻标记基因hpt基因水平转移研究的定性和定量PCR系统.
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膳食脂肪酸对脑组织脂肪酸及其相关基因表达的影响
目的 探讨长期高脂高能量饮食情况下膳食脂肪酸对子鼠脑组织脂肪酸组成及脂肪酸合成相关基因表达的影响.方法 8周龄健康雌性C57BL/6J小鼠,适应性喂养1周后,雌雄鼠以2:1比例合笼,检查阴栓确定怀孕后进入实验.按体重将24只雌鼠随机分为对照组、亚麻油组和猪油组,分别饲以基础饲料、亚麻油饲料和猪油饲料.子鼠断乳后,仍继续给予同母代的饲料喂养至第9周.脱臼处死后取子鼠脑组织,以气相色谱法检测其脑组织中不同脂肪酸水平,逆转录-聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)法检测脑组织β-actin,lxra、acc、fas和scd-1基因的表达.结果 与对照组相比,猪油组饱和脂肪酸的水平显著增加(P＜0.01),而多不饱和脂肪酸的水平尤其是DHA水平显著降低(P＜0.05);与亚麻油组相比,猪油组饱和脂肪酸水平高于亚麻油组(P＜0.01),多不饱和脂肪酸的水平尤其是DHA水平低于亚麻油组(P＜0.01);与对照组相比,亚麻油组的多不饱和脂肪酸的水平略有增加,但差异无统计学意义.与对照组相比,亚麻油组子鼠脑组织lxra、acc和scd-1基因表达明显上调(P＜0.01),而猪油组子鼠脑组织的fas基因表达明显上调(P＜0.05).结论 长期高脂高能量饮食情况下膳食脂肪酸可以影响子鼠脑组织脂肪酸组成,其机制可能与调控脂肪酸合成相关基因的表达有关.
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六种血清型沙门菌PFGE指纹图谱研究
目的 用PFGE方法绘制不同血清型的沙门菌指纹图谱,并且进行同源性分析.方法 首先将从食品中检测出6中不同血清型的沙门菌菌株制成琼脂模块,再提取菌株的DNA,用限制性内切酶Xba Ⅰ对细菌DNA进行酶切,用Bio-rad CHEP MAPPER绘制出菌株的PFGE指纹图谱,后用Quantity OneTM图像分析软件进行同源性分析.结果 所有的菌株的同源性均用相似性系数(矩阵)和百分数表示.结论 用PFGE绘制菌株的指纹图再用Quantity OneTM图像分析软件进行分析,是确定食源性致病菌沙门菌同源性的一种有效的方法.
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牛奶主要过敏原β-乳球蛋白的一基因片段的克隆、表达、纯化及抗原性鉴定
目的 克隆并表达牛奶中主要过敏原β-乳球蛋白(β-LG)的一基因片段,并检测其杭原性.方法 利用RT-PCR技术克隆β-LG蛋白基因片段,测序后将目的片段克隆入原核表达质粗pET载体,转化至大肠杆菌origami,经IPTG诱导表达,获得重组β-LG片段蛋白.用Nit~2+亲和层析柱纯化,用Western blot和ELLSA检测重组蛋白与牛奶过敏患者血清IgE的结合活性.结果 克隆获得β-LG片段蛋白,其开放阅读框基因为264 by(含终止密码子),编码87个氨基酸.获得的重组β-LG片段蛋白既以包涵体形式存在又以可溶性形式存在,用可溶性的蛋白进行纯化,经Western blot和ELISA检测具有较好的抗原性.结论 成功地克隆和表达了β-LG的--基因片段,为后续牛奶的免疫原性研究提供参考,也为研制牛奶主要过敏原的单克隆抗体和制备其主要过敏原的检测试剂奠定了基础.
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转抗菌肽基因辣椒食用安全性和营养质量评价
依据中华人民共和国卫生部<转基因食品卫生管理办法>的有关规定,对转抗菌肽基因辣椒食用安全性和营养质量进行评价,探讨建立相关的模式和方法,为我国转基因食品的卫生管理提供可资借鉴的模型和方法.以转抗菌肽基因辣椒及其对应的受体辣椒为材料,通过对其外源基因及其表达产物、主要营养成分的检测,鉴定转基因食品的特性、基因重组体的遗传稳定性、外源基因的表达忠实性、与受体辣椒的实质等同性,分析和评价其食用安全性和营养质量.抗菌肽基因辣椒其受体、外源基因供体均为传统食品,其基因重组体的主要特性的遗传是稳定的,其外源目的基因的表达是忠实的,其食用安全性和营养质量不低于对应的原有食品.
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不同来源的副溶血性弧菌生物学特性研究
为掌握浙江省不同来源的副溶血性弧菌的血清型分布及毒力基因携带情况,采用血清凝集试验对333株副溶血性弧菌进行血清型分型,采用PCR技术检测副溶血性弧菌的毒力基因TDH.临床副溶血性弧菌菌株血清型分布于7个O抗原群,以O3为主,占临床菌株数的71.81%; O4血清型与往年相比有所上升,占到了16.60%.海产品菌株的血清型分布于8个O抗原群,以O5为主,占所有海产品菌株的47.30%.临床菌株的TDH检出率为95.65%,海产品菌株的TDH检出率为6.06%.血清型相同但来源不同的菌株的TDH检出率不同.浙江省从海产品中分离出的副溶血性弧菌菌株与分离自食源性疾病患者的副溶血性弧菌菌株的主要血清型、毒力基因TDH都存在差别.该工作为预防副溶血性弧菌引起的食品中毒提供了科学依据.
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反油酸对人神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y细胞线粒体功能和细胞自噬的影响
目的 研究反油酸对人神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y细胞线粒体功能和细胞自噬的影响.方法 体外培养人神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y细胞,加入不同剂量(0、10、20、50和100 μmol/L)的反油酸,24 h后收集细胞,采用透射电镜观察细胞自噬小体;采用细胞计数试剂盒8(CCK-8)检测细胞活力;采用实时荧光定量聚合酶链式反应(PCR)和蛋白免疫印迹(western blot)方法检测细胞自噬相关的基因和蛋白表达水平.结果 透射电镜观察细胞结构发现,50和100 μmol/L反油酸可使细胞内出现自噬小体,并可以引起细胞活力下降,差异均有统计学意义(P＜0.01);100 μmol/L反油酸作用24和48 h后,细胞活力明显降低,差异均有统计学意义(P＜0.05);100 μmol/L反油酸可使SH-SY5Y细胞中细胞色素C(cytochrome c,cyt-c)基因Mrna表达水平明显降低,差异有统计学意义(P＜0.05);随着反油酸浓度的升高,细胞浆中cyt-c蛋白表达水平逐渐升高,差异均有统计学意义(P＜0.05).但是不同剂量的反油酸对SH-SY5Y细胞自噬微管相关蛋白轻链3B(LC3B)基因、Beclin1基因、p62基因、自噬相关基因5(atg5)、自噬相关基因12(atg12)Mrna水平表达差异无统计学意义(P＞0.05);但与对照组比较,50和100 μmol/L反油酸可使SH-SY5Y细胞LC3B和Beclin1蛋白表达水平逐渐上调,差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 反油酸可以引起人神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y细胞活力下降,可能与其引起细胞自噬小体形成,上调自噬相关蛋白表达水平,促进线粒体cyt-c蛋白释放入细胞浆有关.
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2000-2005年广东省食品中食源性致病菌的监测与分析
为了解广东省食品中食源性致病菌的污染状况和污染水平.按国家监测网的工作手册进行了食源性致病菌的检测和菌密度测定,应用RiboPrinter(R) Microbial Characterization System检测分离菌株的基因指纹图谱,纸片法作药敏试验.在监测的10类2 265份食品中,共分离出76株沙门菌、75株单核细胞增生性李斯特菌、161株副溶血性弧菌、2株空肠弯曲菌、2株O157:H7大肠杆菌.5种食源性致病菌的检出率为13.95%.部分分离的菌株基因指纹图谱分析的结果是:58株沙门菌分属于22个血清型,25株单核细胞增生性李斯特菌分属于11个RP基因型,55株副溶血性弧菌分属于14个RP基因型.药敏试验结果显示,沙门菌、副溶血性弧菌、O157:H7大肠杆菌均有多重耐药株,单核细胞增生性李斯特菌对抗生素产生耐药性的比例较低.沙门菌、单核细胞增生性李斯特菌和副溶血性弧菌阳性样品中的几何平均菌密度分别为265、96 CFU/g和93 MPN/100 g.5种食源性致病菌对广东省食品的污染普遍存在.肉类食品和水产品的污染尤为严重,政府相关部门应尽快对畜牧养殖业抗生素的使用进行科学指导,并制定相关的法规进行监督和约束.
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2012-2014年江西省市售婴幼儿配方食品中蜡样芽胞杆菌调查及呕吐毒素基因分析
目的 了解2012-2014年江西省市售婴幼儿配方食品中蜡样芽胞杆菌的污染情况并对呕吐毒素基因进行分析.方法 在全省市县中选取13个采样点,包括超市、百货商场、便利店、农贸市场、网店、批发市场,随机抽取婴幼儿配方食品397份,对蜡样芽胞杆菌进行检测和鉴定,同时应用叠氮溴化丙锭内参多重PCR方法检测分离株的呕吐毒素基因.结果397份食品中蜡样芽胞杆菌阳性率为13.10％ (52/397),其中2013年阳性率高.不同采样点的阳性率差异有统计学意义(P＜0.05),不同产地、不同流通环节和不同年龄段的阳性率差异无统计学意义(P＞0.05),52份阳性食品中检出呕吐型蜡样芽胞杆菌2份,呕吐毒素阳性率为3.85％.结论 江西省市售婴幼儿配方食品中存在蜡样芽胞杆菌及呕吐型蜡样芽胞杆菌的污染,存在一定的安全隐患,相关监管部门应继续加强监管,预防食源性疾病的发生.
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椰酵假单胞菌与唐菖蒲伯克霍尔德菌16S～23S rRNA基因间区序列的比较研究
目的 研究比较我国分离的椰酵假单胞菌与唐菖蒲伯克霍尔德菌不同致病型菌株的16S～23S rRNA基因间区序列,分析不同菌株基因水平的差别,并阐述其系统发育关系.方法设计2对伯克霍尔德菌属特异引物,扩增16S～23S rRNA基因间区序列.应用分子生物学软件,对3株分别代表唐菖蒲伯克霍尔德菌3种不同致病型的国际参考菌株(ATCC10248、NCPPB 947、NCPPB3580)、1株伯克霍尔德菌属B.phenazinium种代表株(LMG2247)及8株从我国不同地域、不同食物样品中分离的椰酵假单胞菌(HN2y、Co14、Co8、Co36、Sx8801、90-3、56(2)、56(2))的16S～23S rRNA基因序列进行测定,并与核酸数据库(GenBank)中相关菌株序列进行比较分析.结果通过不同菌株16S～23S rRNA间区序列的分析比较,发现分离的椰酵假单胞菌米酵菌酸产毒株存在2个序列高可变区及特异基因序列,阐述了我国椰酵假单胞菌与唐菖蒲伯克霍尔德菌的系统发育关系,将DNA测序结果在核酸数据库中注册,并绘制了系统发育进化树.结论该研究结果为进一步鉴定椰酵假单胞菌米酵菌酸产毒株,从分子水平探讨其产毒机制及系统发育关系提供了新的、可靠的理论依据和技术支撑.
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SYBR(R) GreenⅠ实时PCR快速检测沙门菌
为应用SYBR(R) Green Ⅰ实时PCR技术建立沙门菌的快速检测方法,根据沙门菌invA基因序列的特点设计特异性引物,进行SYB(R) Green Ⅰ实时PCR检测.以沙门菌及非同源性参考菌株做特异性检测;沙门菌不同群菌株做重现性检测;将沙门菌菌株稀释成不同梯度,做灵敏度检测.该方法有较好的特异性、重现性,沙门菌属5个群菌株均为阳性,而其它非同源菌株均为阴性.该方法灵敏度较高,检测低限为19 CFU/ml.该方法特异性强,重现性好,敏感性高,可以快速、准确检测食品中沙门菌.应用实时PCR技术,利用SYBR(R) Green Ⅰ染料能选择性结合双链DNA的特点,可检测到沙门菌中inv A基因特异性靶序列扩增所产生的荧光信号,且通过熔解曲线可知其熔点值约为80.4℃,而对其它非沙门菌则检测不到荧光信号.SYBR(R) Green Ⅰ实时PCR能通过熔解曲线有效地区分特异性产物、非特异性产物以及引物二聚体,是基因鉴定检测的新方法.
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中国部分水产品副溶血性弧菌毒力基因的分布特征
目的 了解中国部分水产品中副溶血性孤菌毒力基因的分布情况.方法 通过聚合酶链反应测定从中国部分水产品中分离的192株副溶血性弧菌是否携带毒力基因tdh、trh,及种特异性基因tlh、toxR.结果 192株实验菌株tdh全阴性,4株trh阳性,毒力基因携带率2.08%;而tlh、toxR的携带率均为100%.结论 中国副溶血性弧菌水产品分离株毒力基因携带率非常低.
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2种弧菌的实时荧光PCR快速检测
目的 为快速、特异、灵敏的检测致病性弧菌,建立致病性弧菌的实时荧光PCR方法.方法 针对霍乱弧菌的种特异性基因omp W、毒力基因tcp A、ctx A和副溶血性弧菌的种特异性基因tl、毒力基因tdh计引物和Taqman荧光探针,建立实时荧光PCR检测方法.结果 该方法能够特异性地检出副溶血性弧茼或霍乱弧菌,并进一步确定其是否携带tdh、tcp A或ctx A毒力基因,检测的灵敏度可达到10 CFU/ml或0.171 6 μg/ml(pg/μl)DNA模板浓度.结论 该方法特异性强、灵敏度高,适用于食品中致病性弧菌的快速检验.
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食物来源和食源性疾病来源的副溶血性弧菌的生物学特性比较研究
目的 了解温州市平阳县食物来源和食源性疾病来源的副溶血性弧菌的血清群分布特点以及耐热直接溶血素(TDH)和TDH相关溶血素(TRH)检出情况.方法 以59株副溶血性弧菌食品风险监测分离株和39株副溶血性弧菌食源性疾病监测分离株为研究对象,用标准血清进行血清学分群,应用实时荧光定量聚合酶链式反应(PCR)法检测tdh基因和trh基因.结果 食品风险监测分离株检出9个血清群,无优势菌群;食源性疾病监测分离株检出01、O3和O4;以O3和O4为主,分别占48.7％ (19/39)和46.2％(18/39).食源性疾病监测分离株的毒力基因检测结果为38株仅含有tdh基因,1株仅含有trh基因,而食品风险监测分离株仅检出1株只含有tdh基因的菌株.结论 平阳县食品风险监测中分离的副溶血性弧菌菌株与分离自食源性疾病监测的副溶血性弧菌菌株的主要血清型、毒力基因都存在差别.本研究为预防和快速检验副溶血性弧菌引起的食源性疾病提供了科学依据.
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食源性金黄色葡萄球菌肠毒素基因型分布研究
目的 采用PCR法扩增食源性金黄色葡萄球菌中肠毒素基因以了解该菌肠毒素基因携带情况,比较食物中毒和食品监测来源菌株中肠毒素基因检出率差异.方法 合成sea、seb、sec、sed和see五种肠毒素基因特异性引物,用常规PCR方法扩增食物中毒和食品监测来源菌株中各自肠毒素基因,同时采用mini-VIDAS检测食物中毒来源菌株中肠毒素.结果 110株菌株中有30株检出肠毒素基因,检出率为27.3％,肠毒素基因阳性菌株均只检出1种肠毒素基因.其中来自2起食物中毒的14株菌株均检出seb型肠毒素和相关基因,检出率为100％.来源于食品监测样本的96株菌株中有16株检出肠毒素基因,检出率为16.7％,包括sea型4株、seb型2株、sec型4株、sed型6株.结论 在宁波市食品监测中所分离的金黄色葡萄球菌所携带的肠毒素基因主要有sea、seb、sec和sed四型,而seb型肠毒素是引起金黄色葡萄球菌肠毒素所致食物中毒的主要因素.
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bax与P16在结肠癌组织中的表达及其临床意义
目的观察结肠癌组织中P16和bax基因的表达,并分析与临床病理学指标及预后的关系.方法应用LSAB法,将P16与bax单克隆抗体标记64例结肠癌组织,观察P16与bax基因的表达情况.结果 P16的表达与结肠癌的组织类型(χ2=13.12,P＜0.05)及5年生存率(χ2=4.23,P＜0.05)差异分别有显著意义;bax的阳性表达率在DukesA和B期为81.2%,在DukesC和D期为42.2%,两者相比差异有显著意义(χ2=4.16,P＜0.05).结论 P16和bax基因在结肠癌中普遍表达,检测癌组织中该基因的表达对判断预后有积极的临床意义.
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肝癌组织谷氨酰转移酶GGTmRNA-H亚型表达与肝癌早期诊断的研究
目的研究肝癌组织中谷氨酰转移酶GGTmRNA-H亚型表达,并探讨其在肝癌早期诊断中的意义.方法应用RT-PCR法,检测65例原发性肝癌病人癌组织及癌周组织、108例良性肝病肝组织、6例正常对照肝组织的GGTmRNA-H亚型,观察该基因的表达情况.结果在65例原发性肝癌中,癌组织GGTmRNA-H亚型的阳性例数为61例(93.8%),肝组织血清AFP阳性40例(61.5%)(P＜0.05);GGTmRNA-H亚型在20例小肝癌癌组织阳性表达例数为18例(阳性率为90.0%),与正常对照组比较,差异有统计学意义.急慢性肝炎组、肝硬化组与正常对照组比较,GGTmRNA-H亚型阳性表达率虽明显升高,但其差异无统计学意义(P＞0.05).结论肝癌组织中GGTmRNA-H亚型与血AFP联合分析可弥补AFP检测的不足,对提高肝癌、癌前病变的早期诊断具有重要意义.GGTmRNA-H亚型基因检测的结果比AFP的检测更敏感、特异性更高,有望成为肝癌早期诊断的理想指标.
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苯丙酮尿症质谱筛查和基因诊断分析
目的 探讨苯丙酮尿症患儿的代谢筛查情况、 基因突变特点及诊治经验.方法 2016年1月—2017年4月,通过该院DNA分型中心筛查的3593例高危儿相关实验室检查(血液氨基酸和酰基肉碱检测、尿液有机酸检测和基因诊断)结果确诊的8例PKU患者,并结合近年来国内文献资料进行复习.结果 8例患儿中男3例,女5例;发病年龄72 h～20 d;血液氨基酸和肉碱检测显示8例Phe值显著大于正常值120μM;尿液有机酸检测显示只有两例明显出现苯乙酸的积累;基因诊断结果显示8例共检测出7种突变:c.442-1G>A、c.721C>T、c.728G>A、c.781C>T、c.1238G>C、c.1256A>G和c.1301G>A.结论 遇到新生儿苯丙酮尿症和先天性甲状腺功能减低症普筛中异常的患儿,需要注意排除,避免假阳性结果,血液氨基酸和肉碱检测、尿液有机酸检测和基因诊断是其主要诊断指标;早期发现、早期诊断后饮食控制对病情十分有利.
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嗅觉基因编码和信号大脑皮层定位
2004年诺贝尔生理医学奖授予美国学者巴克和阿克塞尔(Linda Buck and Richard Axel),因为他们在研究嗅觉系统生理机制方面作出了很多突破性的工作.本文论述他们研究工作的科学背景,策略和方法及新研究成果.
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常见过敏性疾病的中医防治
人类几十万年形成的与环境相容的基因,由于面临着生存环境骤变的巨大挑战,癌症、心血管疾病、呼吸道疾病等,都呈现出了异常的增长,过敏性疾病也越来越多,现在常见的变态反应疾病已有50多种,常会侵犯中老年人.
