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血浆同型半胱氨酸测定的临床应用
同型半胱氨酸(Hcy)是一种含硫氨基酸,是蛋氨酸和半胱氨酸代谢的重要产物.Wilken等[1]通过流行病调查提出Hcy是心血管疾病的一个独立危险因素.本文应用荧光偏振免疫分析技术(Fluorescence Polarization Immunoassay,FPIA)测定了健康正常人和冠状动脉粥样硬化性心脏病病人,对实验方法和结果分析评价如下.
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心痛宁对大鼠缺血心肌细胞膜流动性的调节
目的:观察心痛宁煎剂对大鼠缺血心肌细胞膜流动性的影响.方法:肾上腺素皮下注射加冰水刺激造成大鼠急性心肌缺血模型,用荧光偏振法检测心痛宁对大鼠缺血心肌细胞膜流动性的影响.结果:大鼠心肌细胞膜荧光偏振度模型对照组大于其余四组(P＜0.05),三个用药组与正常对照组间差异无显著性(P＞0.05).结论:心痛宁对大鼠缺血心肌细胞膜流动性有调节作用,从而能有效保护缺血心肌细胞.
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反向荧光偏振(FP)检测血清中HBV多聚酶基因突变
目的:建立简便的HBV多聚酶基因序列中拉米呋啶耐药性相关的基因突变的检测方法.方法:利用pfu酶的3'-5'外切校正功能和荧光偏振光检测技术进行点突变的检测.首先PCR扩增HBV多聚酶基因,然后用3'标记荧光分子FAM的探针与扩增产物中待测核苷酸的下游序列杂交,使探针3'第一个碱基与靶序列中待测点的碱基配对.若碱基配对正确,pfu酶可以沿探针的3'端延伸;若碱基配对错误,pfu酶须将探针3'标有荧光分子的核苷酸切掉,然后再沿探针3'端延伸.由于第一种情况,荧光分子与DNA链相连,分子量增加,则荧光偏振光值增大;而第二种情况,荧光分子与探针分离,荧光分子的整体分子量减小,则荧光的偏振光值减小,这样可以通过荧光偏振光值的大小判断待测点核苷酸的改变.结果:该方法可以检测出HBV多聚酶基因序列中特定位置的核苷酸类型,可以检测1×10~1个拷贝的模板量.对30例经过6个月以上拉米呋啶治疗的患者血清进行检测,检测出其中有3例是甲硫氨酸(M)密码子ATG中的A→G变异;2例是ATG中的G→C变异;1例是ATG中的C→T.结论:该技术可以对血清中HBV多聚酶基因序列中点突变以及其他基因突变进行检测.
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生物碱类中药组分荧光标记方法的建立及评价
目的 建立生物碱类中药组分的荧光标记方法,并对标记效果进行评价.方法 以异硫氰酸荧光素和盐酸麻黄碱组成研究体系.使用带有偏振镜的荧光分光光度计测量出荧光各向异性值,以FITC荧光各项异性值对麻黄碱浓度的对数作图,得到荧光偏振曲线,计算出样品的标记比,进行标记效果的评价.结果 生物碱类中药组分的较优标记条件为:100mmol·L-1,pH 9.0的碳酸盐缓冲溶液中,盐酸麻黄碱溶液浓度在1×10-6～1 ×10-3mol·L-1,FITC浓度0.5 mmol·L-1,室温避光反应、过夜.绘制荧光偏振曲线,计算得到rB=0.327.通过测量计算可得盐酸麻黄碱浓度为2.0×10-5mol·L-1、FITC浓度为3×10-5 mol·L-1时标记液的标记比为1.23,与理论符合.结论 建立了生物碱类中药组分的荧光标记方法,基于荧光各向异性测量标记比的新方法具有简便快速和灵敏度高的特点,可用于标记效果的评价.
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HPV 58在宫颈癌组织中的感染分析及其转化基因的克隆
目的 分析中国陕西宫颈癌组织中HPV58的感染情况并克隆其E6、E7主要转化基因.方法 采用HPV GP5+/GP6+通用引物PCR 扩增58例宫颈癌组织DNA粗提物,继之将荧光偏振技术与模板指导的末端延伸反应(TDI-FP)结合,应用探针杂交延伸反应检测HPV58.用特异性引物随机从1例 HPV58 阳性标本中PCK 扩增HPV58 E6、E7基因,将其分别与pGEM-T Easy载体连接,所获得的重组质粒经内切酶消化和测序鉴定.结果 58例宫颈癌标本中10例(17.24%)为HPV 58阳性,克隆获得的HPV 58 E6、E7重组质粒经BLAST分析证实分别含有HPV 58完整的E6、E7基因,与GenBank收录的标准株比较,E6、E7基因分别有5个和2个硷基发生变异,可导致相应的蛋白质氨基酸序列中分别有4个和1个氨基酸替换.结论 中国陕西人宫颈癌组织中HPV 58感染较为多见,且HPV 58 E6和E7转化基因的硷基序列与标准株有所差异.本研究为下一步HPV 58相关肿瘤诊断试剂及疫苗的研制奠定了基础.
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B型流感亚系单碱基延伸终止荧光偏振快速检测的研究
目的 建立一种利用单碱基延伸终止结合荧光偏振技术(Fluorescence polarization,FP)快速检测B型流感By(B/Yamagata)和By(B/Victoria)亚系的新方法. 方法 从GenBank下载By和Bv血凝素(HA)基因各50条序列,通过MEGA软件进行分析,利用Primer Premier 5.0设计B型流感病毒亚系特异性引物和单标记延伸引物,建立单碱基延伸终止法与荧光偏振检测方法. 结果 40株By和40株By病毒用单碱基延伸终止法与荧光偏振检测,与传统的基因测序结果一致性达100％. 结论 本方法操作简便、敏感性及特异性高、判读结果直观明确、检测费用低,适合于流感监测实验室对流感病毒的快速分子诊断.
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B型流感单碱基延伸终止荧光偏振法分型分析
目的 了解2010～2012年深圳市B型流感的流行状况,应用单碱基延伸终止荧光偏振法快速诊断,为制定预防控制措施提供依据. 方法 从GenBank随机下载By和Bv HA基因,通过MEGA分析,利用Primer Premier软件设计特异引物和通用探针,应用单碱基延伸终止法与荧光偏振技术对流感哨点监测医院随机采集流感样病例的咽拭子或咽漱液标本进行快速检测,用HAI(Hemagglutination inhibition)实验确认的B型流感病毒亚系分离毒株进行特异性验证. 结果 2010～2012年共采集并检测流感样病例咽拭子4 630份,快速诊断B型流感病毒阳性189例,与HAI分离并鉴定结果一致,总阳性率为4.08％；以2012年第7周阳性率高,达51.61％；病毒阳性者平均年龄为(13±15)岁,其中小于10岁组的阳性率高,达4.70％. 结论 2010～2012年深圳市B型流感病毒的监测中,Victoria亚型为主要流行株.深圳B型流感病毒主要累及青少年和老年人群.应继续加强监测工作,并在流行季节及时采取预防控制措施以保护公众的身体健康.
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罗氏Cobas Integra 400 Plus 全自动生化分析仪常见故障分析
Cobas Integra 400 Plus全自动生化分析仪是罗氏诊断产品有限公司生产的一款多功能分析仪,其创新性在于聚集了分光光度、免疫比浊、离子选择电极、荧光偏振等四种检测技术,检测项目齐全,结果可靠.现将我院使用该仪器遇到的常见故障及解决方法总结如下,供大家参考.
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荧光偏振技术在单核苷酸多态性及基因型检测中的应用
单核苷酸多态性及基因型检测在多种疾病的诊断、病原体检测、组织配型、疾病预警及指导药物应用中具重要的临床价值.荧光偏振检测技术因不需特制探针、简单、敏感、成本与芯片等DNA高通量检测技术相比较为低廉,有在临床推广应用的价值.
关键词： 单核苷酸多态性及基因型 荧光偏振 PCR FP -
21-羟化酶缺陷症基因诊断方法的建立及应用
目的：建立一种荧光偏振检测技术联合直接测序法诊断先天性肾上腺皮质增生症中21‐羟化酶缺陷症的新方法，并对中国人群中常见的2种基因缺失和8种点突变进行检测。方法收集40例健康者及2例患者外周血，提取基因组DNA。设计通用引物，同时扩增CYP21A2和CYP21A1P等位基因片段，然后用序列特异的TAMRA荧光标记探针对扩增产物进行杂交检测，利用荧光偏振仪检测扩增杂交的荧光偏振值，确定是否存在该基因的缺失，同时用直接测序法验证检测结果；对Exon3 Del 8 bp（GAGACTAC）缺失进行检测时，将缺失的8个碱基设计在引物上，确保引物的特异性。同时根据CYP21A2基因与其假基因序列差异，设计5对特异性引物扩增CYP21A2基因，PCR后直接测序检测中国人群中常见的8种点突变，包括P30L、i2g、I172N、E6Cluster、V281L、920‐921insT、Q218X、R356W。结果荧光偏振法未检测到CYP21A2基因大片段缺失，检测结果与直接测序法结果对比差异无统计学意义（P＞0．05），一致率达100％，40例健康者未检测到点突变，1例患者检测出Exon1 G56R ， Exon7c ．920‐921InsT插入杂合突变，1例患者检测出 Exon4I172N、Exon8Q318X杂合突变。结论荧光偏振检测法联合直接测序法诊断21‐O HD是一种高效的检测手段，可以广泛用于临床，不仅能对患者基因突变类型进行分析，在指导遗传咨询及产前诊断方面亦发挥重要作用。
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Plk1PBD蛋白原核表达、分离纯化与活性鉴定
目的:原核表达保罗样激酶1底物结合域(Polo-like kinase 1 Polo-box domain,Plk1 PBD)蛋白,经分离纯化后进行生物学活性鉴定.方法:以HeLa eDNA为模板经PCR反应扩增Plk1 PBD基因,利用DNA重组技术与pET-28a载体连接构建重组质粒.将重组质粒转化到E.coli Rosetta(DE3),经诱导培养后进行Plk1 PBD蛋白原核表达.采用亲和层析方法分离纯化Plk1PBD蛋白后,以酶联免疫吸附测定实验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)和荧光偏振实验(fluorescence polarization,FP)进行生物学活性鉴定.结果:测序与重组质粒酶切结果表明,成功构建了pET-28a-Plk1 PBD原核表达质粒.SDS-PAGE电泳和Western blot实验证实了Plk1 PBD蛋白的原核表达.ELISA实验和FP实验表明Plk1 PBD蛋白具有良好的生物学活性.结论:成功进行了Plk1 PBD蛋白的原核表达、分离纯化与活性鉴定,为其生物学功能研究及以Plk1 PBD蛋白为靶标的新型抗肿瘤药物发现奠定了基础.
关键词： Plk1 PBD蛋白 原核表达 亲和层析 荧光偏振 -
高通量apoE基因分型技术的建立及应用
目的建立一种准确、快速、高通量的apoE基因分型技术.方法从外周血样品提取基因组DNA,PCR扩增覆盖第112和158密码子的apoE基因片段;构建apoE基因片段重组质粒,并进行定点诱变,以得到3种等位基因型的对照样品;PCR产物消化处理,以除去残余的引物和dNTPs;进行模板指导的荧光染料标记终止碱基的掺入反应,应用荧光偏振检测仪分析荧光偏振值的变化;检测79例阿尔茨海默病(Alzheimer's disease, AD)患者和63名健康老年人的apoE基因型,分析基因型与AD易感性之间的关系.结果对分析结果进行测序验证,表明模板指导的荧光染料标记终止碱基掺入-荧光偏振检测技术分析结果与测序结果完全相符.AD组和健康对照组样品的基因分型结果提示apoE ε4等位基因是迟发型AD的危险因素.结论应用此技术进行apoE基因多态性的基因分型分析,具有准确、简易和高通量等优势,可以作为AD风险分析的一种新技术,也适于apoE基因与其他疾病相关性研究时的大规模基因筛查分析.
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大肠杆菌丝状热敏蛋白Z相互作用蛋白A(Ec-ZipA)原核表达、纯化与大鼠多克隆抗体的制备
目的 制备大肠杆菌丝状热敏蛋白Z相互作用蛋白A (Ec-ZipA)第185至328位氨基酸功能蛋白及其特异性大鼠多克隆抗体.方法 以基因合成法合成Ec-ZipA第185至328位氨基酸功能蛋白的基因序列,利用DNA重组技术与pET-30a(+)载体连接构建重组质粒.将重组质粒转化到E.coli BL21(DF3)中进行Ec-ZipA原核表达与表达优化.采用亲和层析方法分离纯化Ec-ZipA后,以荧光偏振(FP)实验进行生物学活性鉴定.以重组Ec-ZipA为抗原免疫大鼠制备多克隆抗体,采用ELISA和Western blot法检测抗体滴度和抗原特异性.结果 SDS-PAGE分析和Western blot实验证实大肠杆菌成功表达Ec-ZipA蛋白.FP实验表明纯化的Ec-ZipA具有良好的生物学活性.ELISA结果表明多克隆抗体具有较高的抗体滴度,效价可达1∶512 000.Western blot实验证实多克隆抗体具有良好的抗原特异性.结论 成功进行了Ec-ZipA原核表达、分离纯化并制备了大鼠抗Ec-ZipA多克隆抗体.
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用单表位合成肽抗原荧光偏振免疫法检测抗幽门螺旋杆菌尿素酶的抗体
目的:应用单表位合成肽抗原,建立一种新的基于荧光偏振技术(fluorescence polarization,FP)的抗体检测方法.方法:用幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori,Hp)尿素酶B(UreB)的单表位合成分支肽抗原免疫小鼠,以ELISA法分析免疫的效果.分析FITC标记的合成肽抗原在不同浓度时的FP值,用FP技术分析抗原表位的抗原性以及不同稀释比例的血清样品对FP检测的影响.分别应用FPIA法和ELISA法,对126例样品进行Hp感染检测,对FPIA的检测数据进行受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic curve,ROC)分析.结果:UreB的单表位抗原肽具有较强的抗原性和免疫原性;1.0nmoL/L的FITC标记肽可用于FPIA检测,血清样品做1:25稀释时可明显区分阳性和阴性检测结果.与ELISA方法检测的结果相比较,用基于UreB单表位合成肽抗原的FPIA法检测Hp感染的灵敏度为85.7%,特异度为98%.结论:应用UreB单表位合成肽抗原,可对抗UreB的抗体进行快速FPIA检测,用此法检测抗体在疾病的临床诊断中具有广阔的应用前景.
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荧光偏振法检测高危HPV16型E6基因350位(T→G)突变
目的:检测宫颈癌人类乳头瘤病毒(HPV)16 E6基因350位(T→G)点突变情况.方法:应用TDI -FP方法检测宫颈癌患者HPV16F6基因350位(T→G)点突变情况.TDI - FP技术是一种在聚合酶链反应的基础上具备液相探针杂交和碱基掺入三重特异反应的检测新方法,具有极高的特异性和敏感性.结果:应用TDI - FP法检测宫颈癌组织中HPV16型E6基因350位(T→G)突变率为6.06％,HPV16 E6基因350位突变与对照组相比无统计学差异(P=0.603.P＞0.05).结论:本地区宫颈癌患者中HPV16型E6 350位(T→G)很少发生突变,有别于欧洲的HPVI6型E6 350位(T→G)高突变.
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荧光偏振和多重聚合酶链技术在肺炎支原体、肺炎衣原体检测中的应用
目的:应用多重聚合酶链反应和荧光偏振检测技术建立一种方便可靠、简单经济的肺炎支原体、肺炎衣原体DNA同步检测方法.方法:以与肺炎衣原体、肺炎支原体16SRNA序列互补的特异、无交叉反应的两对引物在同一反应体系中行多重聚合酶链反应扩增阴阳性对照及521例患儿咽喉分泌物,将荧光偏振检测技术与模板指导的DNA末端延伸反应(TDI -FP)结合,对样本PCR扩增产物进行进一步检测,并与测序方法结果比较.结果:应用多重聚合酶链反应和TDI -FP技术检测患者521例,肺炎衣原体感染阳性121例,肺炎支原体感染阳性113例,与测序检测方法符合率100%,其中肺炎衣原体、肺炎支原体双重感染阳性10例.结论:建立了基于荧光偏振技术检测肺炎衣原体、肺炎支原体的新方法,具有良好的特异性,方便简单,无需标记探针,可用于临床检测.
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荧光偏振方法快速检测HPV16 E7第29位密码子点突变
目的:通过TDI-FP方法检测宫颈病变组织中HPV16 E7基因第29位密码子突变(A→G)并探讨其与宫颈癌的相关性,同时建立一种HPV点突变检测的新方法. 方法:以53例HPV16阳性宫颈组织为研究对象.首先PCR扩增含待检测位点的靶基因片段,然后用TDI-FP方法检测荧光素碱基的掺入情况,判断所研究位点的基因型. 结果:宫颈浸润癌组织中HPV16 E7第29位密码子的突变率为43.48%(10/23),对照组为10.00%(2/20),病例组为39.39%(13/33),组间突变率差异有显著性(P<0.05).该法与随机抽查标本测序结果一致率为100%. 结论:本研究中HPV16病毒发生E7第29位密码子突变的情况与其他地区相比存在差异;HPV点突变TDI-FP检测方法是一种快速简便、高通量的基因突变检测技术.
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快速、高通量MTHFR基因C677T多态性检测方法的建立
目的:建立亚甲基四氢叶酸还原酶(Methylenetetrahydrofolate reductase,MTHFR)基因C677T多态性的快速检测方法.方法:提取健康人外周血基因组DNA,采用PCR扩增含677位点的MTHFR基因片段.对PCR产物中残余的dNTPs和游离单链引物消化处理后进行TDI反应,测定荧光偏振值并分析C677T基因型.同时采用PCR-RFLP方法分析C677T基因型进行比较.结果:100例标本中,TDI-FP分析MTHFR C677T基因型:C/C 40例、T/T 14例、C/T 46例;PCR-RFLP分析MTHFR C677T基因型:C/C 40例、T/T 12例、C/T 48例;其中两种方法检测结果不一致的两例标本经焦磷酸微测序证实为T/T纯合子.结论:建立了一种新的基于TDI-FP的MTHFR C677T基因分型方法,该方法较RFLP方法更为准确,且快速、简便、通量高,适用于临床大批量标本的筛查.
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荧光偏振检测HBV DNA C区BCP双突变
目的: 建立简便、灵敏的HBV DNA序列中BCP双突变点的检测方法. 方法: 采用终点终止法和偏振光检测技术进行点突变的检测. 首先对HBVC区基因进行PCR扩增,然后用特异探针与扩增产物中待测核苷酸的下游序列杂交,使探针的3′端可以在DNA聚合酶的催化下,依据其互补链上的待测核苷酸连接上一个标有特定荧光素的ddNTP,然后检测该3′端带有荧光素的探针,根据检测到的荧光素种类和偏振光的强度可以判定待测点是何种核苷酸. 结果: 该方法可以检测出HBV 基因序列中BCP双突变核苷酸类型以及检测1个拷贝的模板,并且可以从BCP野性株DNA序列中检出5%BCP双突变DNA序列. 结论: 该技术可以检测血清中HBV DNA C区BCP双突变.
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天狼猩红-偏振光法检测子宫内膜异位症中Ⅰ, Ⅲ型胶原
目的探讨子宫内膜异位症中Ⅰ, Ⅲ型胶原的含量和作用. 方法对20例子宫内膜异位症(EM)患者的异位内膜组织(红色病变组和黑色病变组)和11例非子宫内膜异位症患者的在位内膜组织(对照组)用天狼猩红染色,偏振光观察,photoshop分析,半定量研究Ⅰ, Ⅲ型胶原的含量. 结果Ⅰ, Ⅲ型胶原在对照组中含量低(P<0.0 5, P<0.05),Ⅲ胶原在红色病变组中含量高(P<0.05),Ⅰ型胶原在黑色病变组中含量高(P<0.0 5). Ⅰ, Ⅲ型胶原在增生期和分泌期无明显差异(P>0.05). 结论子宫内膜异位症患者的异位组织中有Ⅰ, Ⅲ型胶原的表达. Ⅰ, Ⅲ型胶原的异常表达可能在EM的发病机制和病程进展方面有重要作用.
