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大鼠骨髓干细胞种植于豚鼠脱细胞动脉移植后局部IgG和补体C3沉积研究
目的 探讨大鼠骨髓干细胞种植于豚鼠脱细胞血管支架方法构建组织工程血管的免疫原性.方法 选取健康纯系雄性SD大鼠80只,体质量200 ～ 250 g,随机分为4组,皮下包埋不同移植物:骨髓干细胞种植组(A组,种植大鼠骨髓干细胞的脱细胞豚鼠血管,n =20)、单纯脱细胞组(B组,单纯脱细胞的豚鼠血管,n=20)、新鲜异种血管组(C组,新鲜豚鼠血管,n=20)、假手术组(D组,不包埋任何标本,n=20).术后第3、7、15、30、60天每组处死4只大鼠,获取大鼠血清并取出移植物.苏木素-伊红(HE)染色观察豚鼠血管脱细胞处理效果及移植物表面炎性反应强度,免疫组织化学方法检测移植物表面抗豚鼠血管IgG和补体C3沉积.结果 (1)HE染色显示每组移植物中均可见明显炎性细胞浸润,A组及B组的炎症浸润程度明显低于C组.(2)免疫组织化学法检测:各组移植物表面有明显的抗豚鼠血管IgG沉积.术后3d各组平均吸光度(IA)值差异无统计学意义(A组0.1506 ±0.0394,B组0.1632±0.0340,C组0.1668±0.0510,P＞0.05).术后7、15、30、60dC组平均IA值(0.2157±0.0452、0.2563±0.0442、0.2752±0.0579、0.2545 ±0.0466)高于A组(0.1633±0.0388、0.1787±0.0532、0.1692±0.0406、0.1633±0.0282)、B组(0.1555±0.0348、0.1740±0.0364、0.1698±0.0330、0.1621±0.0349,P＜0.05).术后各时间点A组较B组均差异无统计学意义(P＞0.05).(3)免疫组织化学法检测显示移植物表面有明显的大鼠补体C3沉积.术后3、7、15 d各组平均IA值差异无统计学意义(A组0.1304±0.0313、0.1552±0.0425；B组0.1316±0.0254、0.1535±0.0396；C组0.1671±0.0422、0.1766±0.0493,P＞ 0.05).术后30、60dC组平均IA值(0.2401±0.0706、0.2674±0.0788、0.2044±0.0494)高于A组(0.1612±0.0358、0.1597±0.0439、0.1382±0.0299)、B组(0.1603±0.0591、0.1517±0.0404、0.1407±0.0288,P＜0.05).术后各时间点A组较B组差异无统计学意义(P＞0.05).结论 骨髓干细胞种植组织工程血管及脱细胞处理血管的免疫排斥反应强度明显低于新鲜异种血管；同种骨髓干细胞种植于异种脱细胞血管支架方法构建的组织工程血管,具有较低的免疫原性.
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大鼠干细胞种植血管的免疫原性研究
目的 观察大鼠骨髓干细胞种植于豚鼠脱细胞血管支架方法构建组织工程血管的免疫原性.方法 选取健康纯系雄性SD大鼠160只,体质量200 ～ 250 g,随机均分为4组,皮下包埋不同移植物:骨髓干细胞种植组(A组,种植大鼠骨髓干细胞的脱细胞豚鼠血管)、单纯脱细胞组(B组,单纯脱细胞的豚鼠血管)、新鲜异种血管组(C组,新鲜豚鼠血管)、假手术组(D组,不包埋任何标本).术后第3、7、15、30、60天每组处死8只大鼠,获取大鼠血清.酶联免疫吸附试验( ELISA)法检测各组大鼠血清中抗豚鼠血管IgG和补体C3浓度.结果 血清中抗豚鼠血管IgG:A、B、C组大鼠血清中抗豚鼠血管IgG浓度升高.术后3d各组之间差异无统计学意义(P＞0.05).术后7、15、30 dA组[(116.63 ±9.72)、(123.79 ±9.12)、(110.76±12.44) mg/L]、B组[(112.77 ±9.63)、(122.54±17.15)、( 116.23±16.49) mg/L]高于D组[(98.41±16.49)、(102.54±10.61)、(97.73 ±9.71) mg/L](P＜0.05),术后60dA、B与D组差异无统计学意义(P＞0.05),术后7、15、30、60dC组[(121.14±6.75)、(138.03±17.70)、(141.09±18.93)、(133.28±16.13) mg/L]高于A、B、D组(P＜0.05).术后各时间点A组与B组差异无统计学意义(P＞0.05).ELISA法检测血清中补体C3:A、B、C组大鼠血清中补体C3浓度降低.术后3d各组差异无统计学意义(P＞0.05).术后7、15、30、60d C组[ (130.38±16.85)、(106.58±11.62)、(105.25±10.71)、(113.84±11.05) mg/L]低于A组[(152.61 ±21.84)、(130.94±16.55)、(127.71±15.10)、(134.79±16.20) mg/L]、B组[(153.10±15.81)、(135.24 ±24.56)、(125.18±11.88)、(137.25±21.17) mg/L]、D组[(154.45 ±19.69)、(161.74±23.78)、(153.33 ±24.41)、( 156.90±22.20) mg/L] (P ＜0.05).术后15、30、60dA、B组低于D组(P＜0.05).术后各时间点A组与B组差异无统计学意义(P＞0.05).结论 实验组大鼠在进行皮下包埋手术之后,体内抗豚鼠血管IgG及补体C3浓度均有明显变化,骨髓干细胞种植组及脱细胞处理组标本的免疫排斥反应强度明显低于新鲜异种血管组；同种骨髓干细胞种植于异种脱细胞血管支架方法构建的组织工程血管,具有较低的免疫原性,可作为较好的血管移植材料构建方法.
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分层共同培养诱导骨髓间充质干细胞向表皮细胞分化的研究
目的 探讨体外联合HaCaT细胞共同培养诱导骨髓间充质干细胞(MSCs)向表皮细胞分化的可行性.方法 用聚碳酸酯细胞插入板分层后联合共同培养HaCaT细胞与MSCs,观察培养3、6、9d后的细胞形态,进行角蛋白(CK-19、CK-10)、整合素(α6、β1)染色并用流式细胞仪统计细胞阳性率.结果 共同培养后细胞形态变化明显,共培养3、6d后表皮细胞标志物CK-19、α6整合素、β1整合素免疫荧光染色阳性,细胞阳性率分别为9.3％、8.2％、11.5％和21.7％、34.1％、39.6％,CK10表达呈阴性；共培养9d后CK-19、α6整合素、β1整合素、表达较前减少,阳性率为12.2％、18.6％、16.3％,CK1O出现阳性表达,细胞阳性率为10.7％.结论 分层联合HaCaT细胞共同培养可以诱导骨髓干细胞向表皮细胞进行分化.
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血管内皮生长因子转染内皮祖细胞治疗大鼠缺血后肢的研究
目的 使用血管内皮生长因子(VEGF)转染内皮祖细胞(EPC)治疗大鼠缺血后肢,观察EPC、VEGF转染EPC对大鼠缺血后肢的新生血管和肢体成活的影响.方法 制作SD大鼠后肢缺血模型,将动物随机分为3组,每组6只.将构建的VEGF基因真核表达载体转染入骨髓来源的EPCs后通过尾静脉注射人大鼠体内,并与使用磷酸盐缓冲液(PBS)或EPC的动物进行比较,观察转染VEGF的EPCs在缺血部位的聚集和形成新生血管的情况.结果 (1)动物总残肢率比较,CELL组、VEGF组较PBS组明显增加的肢体恢复率(P<0.05),CELL组肢体恢复率较VEGF组差(P<0.05).(2)毛细血管密度与PBS组比较,各时间点中CELL、VEGF组MVD均明显增多(P<0.05).(3)缺血肢体VEGFa的表达:VEGF组的VEGF蛋白表达较PBS组、CELL组、明显增多(P<0.05);(4)手术后7、14、28 d,与PBS对照组比较,CELL、VEGF组细胞的血流灌注有较大程度的恢复(P<0.01).结论 VEGFa基因转染EPCs对缺血部位的血管新生有重要影响,联合应用VEGFa基因和EPCs治疗缺血后肢有较好的协同作用.
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体外诱导小鼠骨髓干细胞转化为肝细胞的实验研究
目的模拟体内肝脏发生发育的环境和条件,建立以细胞因子为主的体外诱导培养体系,探讨骨髓干细胞体外转化肝细胞的可行性.方法获取小鼠骨髓干细胞,建立以细胞因子为细胞诱导的培养体系.在细胞培养过程中,观察细胞形态和数量,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测肝细胞特异性基因的表达,Western blot和流式细胞仪检测ALB和CK18在蛋白水平的表达情况.糖元染色法行细胞糖原染色、尿素合成试验检测细胞的合成和代谢功能.结果在诱导培养12 d,可以观察到多极性的肝细胞样细胞,且细胞逐渐增多、集落不断增大.诱导细胞在培养7 d开始表达AFP mRNA并维持到第21天,此后表达逐渐减弱;培养7天开始表达ALB mRNA和CK18mRNA,随着培养时间的延长表达不断增强;培养14 d开始表达TTR mRNA,随着培养时间的延长表达不断增强.通过Western blot检测,诱导21 d的细胞表达ALB和CK18蛋白,流式细胞术分析ALB阳性细胞的比例为60.45%,CK18阳性细胞的比例为67%.诱导培养21 d,细胞胞浆内可见红染的糖原颗粒;诱导培养6 d,细胞开始合成尿素,尿素合成功能随诱导时间的延长而增强,于第15天达到高峰.结论我们建立的以细胞因子FGF、HGF、OSM、EGF为主的细胞诱导培养体系能促使骨髓干细胞定向转化为肝细胞.
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肝细胞极化标志分子在骨髓基质干细胞向肝细胞分化过程中的表达
目的 观察在体外诱导成人骨髓基质干细胞向肝细胞分化过程中肝细胞极化标志分子的表达和分布.方法 从成人骨髓中分离基质干细胞,在体外诱导分化为成熟肝细胞.应用半定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法比较肝细胞极化标志蛋白二肽酰基肽酶Ⅳ(DPPIV)和低密度脂蛋白受体(LDLr)mRNA在诱导分化(实验组)和非诱导分化(对照组)条件下的表达情况.应用免疫荧光方法在共聚焦显微镜下观察DPPIV和LDLr在细胞膜上的分布情况.结果 成人骨髓来源的基质干细胞经诱导后分化表达白蛋白,实验组DPPIV和LDLr mRNA的表达高于对照组(P＜0.05).DPPIV和LDLr在肝细胞膜上呈特征性分布.结论 成人骨髓基质干细胞在向肝细胞分化过程中表达肝细胞极化标志分子,进一步表明骨髓基质干细胞具有向肝细胞分化的潜能.同时,肝细胞体外分化可以做为研究肝细胞极化形成机制的良好模型.
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骨髓源性肝干细胞定向分化及脾内移植研究
目的寻找骨髓源性肝干细胞的表面标记,进行定向分化及脾内移植研究.方法 流式细胞仪检测淤胆大鼠骨髓中干细胞群体的数量变化,寻找肝干细胞标记,免疫磁珠分离,进行体外诱导分化和肝再生模型的脾内移植,观察细胞形态的变化,免疫组织化学和免疫荧光技术检测白蛋白、AFP、CK8/18等肝细胞标记的表达.结果淤胆鼠β2微球蛋白阴性(β2m-)细胞数量较对照组数量明显增高,分别为(6.17±2.70)%和(0.79±0.61)%(P＜0.01),β2m-细胞体外培养及脾内移植均可出现肝细胞样细胞,白蛋白、AFP、CK8/18表达阳性.结论β2m-细胞在体内外具有向肝细胞分化的能力,脾内移植是肝干细胞移植可供选择的部位之一.
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自体骨髓干细胞移植在肢体动脉缺血时的作用
目的探索一种简便安全有效的治疗下肢动脉缺血性疾病的方法.方法建立鼠后肢缺血动物模型,将取于自体的骨髓干细胞(BMSC)制成悬液注射于缺血部位肌肉内共7点,每点间隔0.2cm,4周后行动脉造影,并取肌肉标本测定毛细血管密度.结果动脉造影显示治疗组缺血肢体侧枝动脉明显增多;毛细血管密度增加,每高倍镜视野达到5个,与缺血组(2个/高倍镜)相比,差异有显著性 (P< 0.05).结论自体骨髓干细胞移植是一种新的、简单有效的治疗下肢缺血的方法.
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自体骨髓干细胞联合不同支架材料移植治疗四肢长骨骨不连
自体骨髓干细胞(BMSCs)是组织工程中重要的种子细胞.种子细胞与支架材料的黏附是细胞种植的关键,目前尚无大规模临床实验应用骨髓干细胞及不同支架材料移植治疗骨不连.我院子2006年6月至2011年3月以经体外成骨诱导的自体骨髓干细胞为种子细胞,联合不同支架材料移植治疗骨不连,观察骨髓干细胞及不同支架材料移植的治疗效果.
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转化生长因子-β1对骨髓干细胞分化过程中Wnt信号通路相关基因表达的影响
目的 观察转化生长因子(TGF)-β1对骨髓干细胞向软骨细胞分化过程中Wnt信号通路相关基因表达的影响.方法 TGF-β1软骨诱导液培养骨髓干细胞(BMSCs),倒置相差显微镜进行形态学观察,甲苯胺蓝染色、鉴定.酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测不同浓度TGF-β1对糖胺聚糖(GAG)表达量的影响,实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)检测目的基因Wnt1、Wnt3a、β-连环蛋白(β-catenin)、Sox9和胶原蛋白Ⅱ(Collagen Ⅱ) mRNA表达.结果 TGF-β1诱导培养第21天,甲苯胺蓝染色显示,95％以上细胞为软骨细胞；2μg/L TGF-β1诱导液组细胞培养液中GAG表达量为(69.16±1.18) mg/L,明显高于其余各组(P＜0.05)；FQ-PCR结果表明,与对照组比较,2μg/LTGF-β1诱导液组的Wnt1、Wnt3a mRNA的表达量分别为0.0266±0.0047、0.0154±0.0033,其表达受到了抑制(P＜0.05),β-catenin mRNA的表达量为0.0187 ±0.0021,明显低于对照组(P＜0.01)；相反,Sox9、Collagen Ⅱ mRNA表达量分别为0.0682±0.0024、0.1134±0.0048,表达有所升高(P＜0.05).结论 TGF-β1促进BMSCs向软骨细胞分化,Wnt/β-catenin信号通路相关基因表达受到抑制,而软骨细胞特异基因表达增加.
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骨髓基质干细胞在口腔颌面组织修复中的研究进展
骨髓干细胞有两个亚群,即骨髓造血干细胞和骨髓基质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC).骨髓基质干细胞有很大的可塑性[1],具有易获取、扩增潜力大、遗传稳定性高、能迁移到组织损伤部位和免疫抑制强等特性,已广泛用于自体或异体移植[2].本文对骨髓基质干细胞在口腔颌面组织中的临床应用作一综述.
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新型骨髓干细胞富集材料的制备及其表征研究
目的 制备一种新型骨髓干细胞富集材料,并观察其表征.方法 用预先制备的人脱钙骨基质(DBM)与多聚左旋赖氨酸(PLL)复合制备富集材料.参照Zhang 氏液体置换法测定其密度与孔隙率;三维视频显微镜、扫描电镜观察其孔径、表面及横断面超微结构;拉曼光谱分析鉴定材料成分,并进行组织学观察.结果 经PLL修饰的DBM富集材料(PLL-DBM)密度为(0.27±0.02)g/ml,孔隙率为(73±11)%,孔径为(412.73±160.29)μm.孔隙内部有大量孔隙相互连通,PLL在材料内外表面形成均匀的乳白色涂层,并在天然孔隙内形成更小、孔径较均匀的网孔结构.结论 制备的PLL-DBM具有自体骨三维空间结构和促进细胞粘附的PLL,是一种较理想的骨髓干细胞富集材料.
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磁标记干细胞肝移植的MR活体示踪研究进展
肝脏干细胞移植不但可以替代坏死的组织,还可刺激受体组织再生以达自身修复;此外,通过体外基因修饰肝脏干细胞,再移植给相应基因缺陷的受体肝脏以分化为具有正常功能的肝细胞,可以治疗肝脏代谢疾病.目前人骨髓干细胞自体移植技术已应用于临床终末期肝病的治疗,而且取得了较好的疗效.
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中药干预骨髓干细胞治疗缺血性心脏病研究进展
近年来细胞治疗技术利用骨髓干细胞介导血管及心肌的再生，为缺血性心脏病的治疗带来了新的前景，中医药对干细胞的作用成为研究的热点，现针对几味中药干预骨髓干细胞治疗缺血性心脏病的研究进展作一综述。
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MELD-Na模型评价自体骨髓干细胞移植治疗失代偿期肝硬化的疗效
目的:评价自体骨髓干细胞移植对肝硬化失代偿的作用,探讨干细胞移植治疗终末期肝病的合适时机.方法:将79例符合肝硬化失代偿期的患者分为治疗组36例和对照组43例,两组均给予内科综合治疗,治疗组在内科综合治疗的基础上行经门静自体骨髓干细胞移植术治疗,通过各项临床检验数据,建立MELD-Na评分,并统计两组短期(3个月)预后,比较两组的MELD-Na评分及ROC曲线下的面积及其预后.结果:治疗3个月后,治疗组平均MELD-Na分值明显低于对照组,在MELD-Na分值的分布上,治疗组MELD-Na分值在20以下者分布多.同时发现治疗组AOC曲线下的面积明显小于对照组.统计治疗组和对照组短期死亡率,发现治疗组死亡4例,对照组为16例,两者比较有明显差异.结论:自体骨髓干细胞经门静脉移植治疗失代偿期肝硬化可以使MELD-Na分值下降,影响患者短期预后,减少近期死亡率.其起效时间大概需要12周.本研究还提示自体骨髓干细胞移植对于MELD-Na分值大于20的患者效果不显著.
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大鼠骨髓Thy-1.1+干细胞的分选与表型研究
目的采用免疫磁珠分选系统(MACS)分离大鼠骨髓Thy-1.1+干细胞群,研究Thy-1.1+干细胞与肝脏分化潜能相关的表型特征.方法收集大鼠胫骨、股骨骨髓细胞,Percoll密度梯度离心分离单个核细胞,Thy-1.1单抗标记,间接免疫磁珠系统分离纯化Thy-1.1+干细胞群,流式细胞仪检测其纯度,锥虫蓝拒染法检测细胞活力,计算回收率.同时流式检测分选前细胞及分选后Thy-1.1+干细胞的表型. 结果经MACS分选后Thy-1.1+细胞比例由56.65%升至94.20%;分选后的细胞活力为99.62%,与分选前的99.79%无明显差异;MACS分选Thy-1.1+细胞的回收率为64.65%.Thy-1.1+细胞不表达CD34和c-kit;高表达β2微球蛋白(β2M)和CD45;部分表达Flt-3.分选前后CD34+和c-kit+比例无显著差异;β2M+的比例由93.38%下降至86.39%(P＜0.05);CD45+和Flt-3+的比例则由67.18%、14.36%升高至分选后的81.12%和58.72%(均P＜0.01).结论 MACS方法能有效分选大鼠骨髓Thy-1.1+干细胞群,所得细胞纯度高,细胞活力保持好.大鼠Thy-1.1抗原与CD34、c-kit分子无明显相关性;而与CD45、Flt-3有一定的正相关性;与β2M呈一定的负相关性.
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自体骨髓干细胞动员对急性心肌梗死患者心功能的影响
目的 研究动员自体骨髓干细胞疗法对合并心力衰竭的急性心肌梗死(AMI)患者心功能的影响.方法 30例合并心衰的AMI患者随机分为2组 .干细胞动员组15例,于入院后在常规治疗基础上加用粒细胞集落刺激因子(G-CSF)动员自体骨髓干细胞修复心肌梗死部位心肌并促进血管再生;对照组15例按AMI常规治疗.入院后第1天及第4、12周通过心脏超声(UCG)以及核素显像(SPECT)全面评价心功能.结果 入院后4周,动员组心肌梗死面积缩小(P<0.05),对照组心肌梗死面积较治疗前无显著改善(P>0.05);与对照组相比,动员组4周时UCG提示左室射血分数及心输出量显著提高,SPECT显示心肌梗死面积缩小(P<0.05);第12周时这些改善进一步加强(P<0.01).结论 骨髓干细胞动员疗法可以提高AMI患者的心功能.
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自体骨髓干细胞移植诱导血管生成的作用
目的为临床探索一种更简便安全的下肢动脉缺血性疾病的治疗途径.方法建立鼠后肢缺血动物模型,将取于自体的骨髓细胞制成悬液注射于缺血部位,2周后行动脉造影,测定毛细血管生成情况.结果动脉造影显示缺血肢体侧支动脉明显增多.结论自体骨髓干细胞移植可望成为一种简单的、有效的治疗下肢缺血的方法.
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经门静脉骨髓间充质干细胞移植治疗肝硬化的研究
肝硬化和肝功能衰竭一直以来是人类健康所面临的一大难题,也是难以攻克的医学高峰.目前的方案均难以完全的修复受损的肝脏和使其功能得到长期的恢复.骨髓中包括造血干细胞和骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cell).MSC作为成体干细胞的一种,发现它具有的横向分化(trans-differentiation)的特点,MSC可以跨胚层分化,具有强大的分化可塑性.1998年Petersen早发现骨髓干细胞可以横向分化为肝细胞.MSC是再生治疗医学非常有潜力的一种细胞.本实验希望通过动物体内MSC的移植找到一条治疗肝病的新的途径.
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髓内钻孔减压自体骨髓干细胞移植治疗股骨头坏死的护理
总结了14例自体骨髓干细胞移植治疗股骨头坏死的护理体会. 包括术前心理护理、术前评估和准备;术后体位、引流管及伤口护理、病情观察及术后饮食护理、功能锻炼指导等. 认为加强术前、术后临床护理对患者早日康复具有重要意义.
