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广西性病门诊泌尿生殖道沙眼衣原体感染状况及基因分型研究
泌尿生殖道沙眼衣原体(chlamydia trachbomatis,CT)的感染是世界范围内常见的性传播疾病(sexually transmitted diseases,STD)之一.CT感染后会产生一些严重的后遗症,在女性中会出现输卵管源性的不孕、异位妊娠和盆腔炎,并且还是宫颈鳞状细胞癌的潜在危险因素[1];在男性中会发生附睾炎等[2-3 ].目前沙眼衣原体有19种血清型:A、B、Ba和C型引起沙眼;D、Da、E、F、G、Ga、H、I、Ia、J和K型主要为泌尿生殖道感染;L1、L2、L2a和L3型引起性病性淋巴肉芽肿[4].对沙眼衣原体的分离株进行分型研究,将有助于监测特定型别的流行动态,也有助于临床上判定治疗失败与再感染的原因.本研究应用PCR和限制性片段长度多态性分析(PCR-RFLP),对广西地区性病高危人群的泌尿生殖道CT感染状况和CT基因分型进行研究.
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基因多态性分析在凝固酶阴性葡萄球菌菌种鉴定中的应用
目的建立快速凝固酶阴性葡萄球( CNS)菌种的基因鉴定方法.方法对培养获得的、经Auto Scan-4微生物分析仪和API Staph鉴定系统鉴定为CNS的100株临床分离菌株和质控菌株应用tRNA基因间长度多态性PCR分析(tDNA-PCR)和肠杆菌基因间相同序列(ERIC)两种分子生物学方法进行常见的CNS菌种鉴定,同时改良实验条件,并将tDNA-PCR及ERIC-PCR两种分子生物学方法的鉴定结果与传统的Auto Scan-4微生物分析仪和API Staph鉴定系统进行比较.结果 tDNA-PCR及ERIC-PCR两种分子生物学方法对质控菌株及经Auto Scan-4微生物分析仪和API Staph系统鉴定的12种临床分离CNS菌株均可以得到各自不同的电泳图谱,它们可以快速、准确地对常见12种CNS,包括表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌、人葡萄球菌、华纳葡萄球菌、模仿葡萄球菌、孔氏葡萄球菌、心耳葡萄球菌、松鼠葡萄球菌、头状葡萄球菌、施氏葡萄球菌、木糖葡萄球菌和里昂葡萄球菌进行菌种鉴定.从图谱的肉眼观察看,12种CNS均可以很好地鉴别开.tDNA-PCR及ERIC-PCR与Auto Scan-4和API Staph鉴定系统的一致率为95%.经Taq酶聚合后进行电泳,tDNA-PCR在100～600bp产生6～10条DNA片段;ERIC-PCR在100～1200 bp仅产生1～8条DNA 片段.结论 tDNA-PCR及ERIC-PCR是快速、敏感的CNS菌种鉴定的方法,具有高度的特异性.
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新生和格特隐球菌种、变种、基因型和交配型的分子鉴定
目的 评价限制性片段长度多态性(Restriction fragment length polymorphism,RFLP)方法检测α和a交配型位点内GEF1α/a基因片段在鉴定新生和格特隐球菌种、变种、基因型和交配型中的作用.方法 筛选交配型位点内的GEF1α/a基因进行PCR-RFLP分析.根据各基因型和交配型参考株的GEF1α/a基因保守序列设计引物,扩增受试新生和格特隐球菌GEF1α/a基因部分片段.利用DNAMAN和Vector NTI软件进行序列比对、限制性图谱分析、限制性内切酶的筛选和模拟电泳.选择EcoTl4 Ⅰ和Hap Ⅱ限制性内切酶分别对125株新生和格特隐球菌的GEF1α/a基因扩增片段进行RFLP分型.结果 所有受试的82株新生隐球菌和43株格特隐球菌均扩增出1 300 bp大小片段,而罗伦隐球菌、白念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌、克柔念珠菌、光滑念珠菌、阿萨希毛孢子菌、烟曲霉和黄曲霉参考株均扩增阴性.RFLP分型准确鉴定所有125株新生和格特隐球菌的种、变种、基因型和交配型.结论 针对GEF1α/a基因片段的PCR-RFLP方法特异性高、稳定性好,适用于新生和格特隐球菌种、变种、基因型和交配型的同步和快速鉴定以及进一步的分子流行病学分析.
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自动化细菌鉴定仪和碳青霉烯酶基因OXA-51扩增在不动杆菌属细菌鉴定中的价值
目的 评价自动化细菌鉴定仪Phoenix和Vitek2 Compact以及碳青霉烯酶基因OXA-51(blaOXA-51-like扩增在不动杆菌属细菌鉴定中的价值.方法 收集2006-2007年北京协和医院临床标本中分离的非重复不动杆菌属细菌50株,以扩增性核糖体DNA限制性酶切片段分析(amplified ribosomal DNA restriction analysis,ARDRA)为参考方法,分别采用blaOXA-51-like基因扩增和Phoenix、Vitek2 Compact细菌鉴定仪进行鉴定.结果 与ARDRA分子鉴定结果进行对比,blaOXA-51-like基因扩增鉴定方法敏感度为100%,特异度为100%;细菌鉴定仪Phoenix和Vitek2 Compact鉴定到种的准确率分别为44%和56%.结论 不动杆菌属仪器表型鉴定准确率不高;对于鲍曼不动杆菌,blaOXA-51-like基因扩增为一种快速可靠的鉴定方法.在研究不动杆菌的耐药机制或同源性分析时,可采用ARDRA方法进行鉴定.
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不同分子生物学方法快速鉴别非结核分枝杆菌的应用评价
目的 评价3种分子生物学方法快速鉴定非结核分枝杆菌的优缺点.方法 收集41株临床分离的非结核分枝杆菌,以16S rRNA基因测序方法为标准,同时以hsp65基因测序方法及PCR-RFLP方法鉴定菌株,与16S rRNA基因测序结果进行比较.结果 41株非结核分枝杆菌16SrRNA基因测序结果:9株龟分枝杆菌复合群,7株偶发分枝杆菌,7株胞内分枝杆菌,3株鸟分枝杆菌,3株堪萨斯分枝杆菌复合群,3株耻垢分枝杆菌,3株土分枝杆菌,2株草分枝杆菌,2株无色分枝杆菌,1株瘰疬分枝杆菌,1株M.arupense.与16S rRNA基因测序相比较,hs65 PCR-RFLP能鉴定9株龟分枝杆菌复合群至亚种脓肿分枝杆菌,3株堪萨斯分枝杆菌复合群鉴定至亚种堪萨斯分枝杆菌;1株偶发分枝杆菌及1株无色分枝杆菌与其不符;其余菌株鉴定结果一致,符合率为95.1%(39/41).hsp65基因测序结果显示,1株爱尔兰分枝杆菌与16S rRNA测序结果不符,其余菌株鉴定结果与其一致,符合率为97.6%(40/41),并且能进一步将9株龟分枝杆菌复合群鉴定至亚种脓肿分枝杆菌,3株堪萨斯分枝杆菌复合群鉴定至亚种堪萨斯分枝杆菌.结论 3种方法均能快速鉴定非结核分枝杆菌.与16S rRNA基因测序相比,hsp65基因测序及hsp65 PCR-RFLP更容易鉴定临床常见非结核分枝杆菌(如堪萨斯分枝杆菌和脓肿分枝杆菌),可在临床推广使用.
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PCR-RFLP技术用于脓肿分枝杆菌群鉴定的初步研究
目的 探讨PCR-RFLP分子鉴定技术对脓肿分枝杆菌群鉴定的应用价值.方法 收集2009-2010年在福建省肺科医院、北京市朝阳区疾病预防控制中心、北京解放军总医院抗酸染色阳性菌株46株.根据2004年分枝杆菌检验手册临床检验常分离菌鉴定程序,用DNA直接测序方法为对照,以hsp65(441 bp)和rpoB(380 bp)基因的特异片段为分子标识,采用PCR-RFLP对脓肿分枝杆菌群临床分离菌株进行菌种鉴定.结果 接种L-J、PNB和TCH培养基,鉴定为结核分枝杆菌30株,非结核分枝杆菌16株.其中10株非结核分枝杆菌的培养特性和主要生化反应同脓肿分枝杆菌( ATCC 19977)结果一致.经hsp65 PCR-RFLP鉴定,9株菌株的指纹图谱为235和200 bp( BstEⅡ)/145、70、60、55、50和40 bp(HaeⅢ),1株菌株的指纹图谱为235和200 bp(BstEⅡ)/200、70、60和50 bp(HaeⅢ).经rpoB PCR-RFLP鉴定,10株临床菌株的指纹图谱是105、95和80 bp(MspⅠ)/130、100 bp和90 bp( HaeⅢ).DNA测序分析,9株分离株与脓肿分枝杆菌群脓肿亚种hsp65和rpoB基因序列匹配度均为100％；1株分离株与脓肿分枝杆菌群马赛分枝杆菌亚种hsp65和rpoB基因序列匹配度均为100％.结论 PCR-RFLP是一种快速、有效鉴定脓肿分枝杆菌的方法,且hsp65 PCR-RFLP的鉴定效果优于rpoB PCR-RFLP.
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肺炎链球菌青霉素结合蛋白基因多态性与其青霉素敏感性的关系
目的 探讨肺炎链球菌青霉素结合蛋白基因(pbps)多态性与青霉素敏感性的关系.方法 以包括63株青霉素不敏感肺炎链球菌(PNSP)和69株青霉素敏感菌(PSSP)共132株菌为研究对象,浓度梯度(E-test)法检测青霉素低抑菌浓度(MIC),PCR法扩增pbp2b、pbp2x和pbp1a,分析其限制性片段长度多态性(RFLP).结果 pbp1a有9种型,其中两种见于PSSP和部分PNSP菌株,其他7种主要见于青霉素MIC值≥0.25μg/ml的菌株(21/22).pbp2b有10种型,其中3种型见于PSSP和部分PNSP菌株,其他7种主要见于青霉素MIC≥0.25μg/ml的菌株(20/22).pbp2x谱型31个,PSSP菌株中有17种,其中13种仅见于PSSP菌株;余下14种只存在于PNSP(35株).pbp1a、pbp2b和pbp2x组合的pbps型共47种,PSSP菌株中23种,其中17种仅存在于PSSP;其他24种仅见于PNSP(36株).根据pbp1a或pbp2b基因型判断青霉素敏感,虽然敏感度高,但特异度较低(＜50%),准确性也较低;根据pbp2x或pbps基因型判断,敏感度、特异度和准确性均在85%以上.结论 肺炎链球菌青霉素耐药主要与PBP1a、PBP2b和PBP2x变异有关;根据肺炎链球菌pbps基因多态性,可快速准确地判断其青霉素敏感性.
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IS6110限制性片段长度多态性和间隔区寡核苷酸分型技术在结核分枝杆菌菌株鉴定中的应用
目的评价IS6110-限制性片段长度多态性(IS6110-RFLP)和间隔区寡核苷酸分型技术(spoligotyping)两种方法在结核病流行病学上的应用,探讨我国各地区的结核分枝杆菌菌株特点.方法收集158株结核分枝杆菌临床分离株,分别应用IS6110-RFLP 和Spoligotyping两种方法进行鉴定.结果 (1)IS6110-RFLP的分辨力大于spoligotyping分型. (2)将本次试验结果与国际spoligotype 数据库进行比较.结果有14个类型属于共有类型,其中类型1为流行的类型,分布广泛,即所说的北京基因型.(3)广东地区与其他地区成簇率和北京基因型所占比例差异有统计学意义(P<0.05).广东地区成簇率和北京基因型所占比例均显著低于其他地区.结论同时应用IS6110-RFLP分型和Spoligotyping两种方法进行结核病流行病学调查研究非常有效,在中国不同地区的菌株具有不同的特点.
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裂解酶片段长度多态性在沙眼衣原体主要外膜蛋白基因分型中的应用研究
目的建立沙眼衣原体(Ct)主要外膜蛋白基因(omp1)上游引物5′末端地高辛标记裂解酶片段长度多态性(CFLP)分型方法,并对Ct临床分离株进行分型.方法取临产孕妇宫颈刮片及其新生儿鼻咽拭子组成母婴配对标本300对605份,用套式聚合酶链反应扩增Ct omp1第四可变区;用建立的CFLP方法对其进行基因分型.结果孕妇宫颈Ct检出率11%(33/300),母婴传播率24.2%(8/33); 8对Ct阳性母婴配对标本CFLP图谱呈四类,经测序证实分别为E、F、H、D型(各3、2、2、1对),各占37.5%、25%、25%和 12.5%,且每对母子CFLP图谱完全一致;同一标本不同批次和相同基因型不同标本的CFLP图谱一致.结论上游引物5′末端地高辛标记Ct omp1 CFLP分型方法灵敏度高、重复性好、操作简便、快速、费用相对低廉,无放射污染,是一种极具潜力的Ct基因分型方法.
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限制性片段长度多态性分析法在CXCL10G-201A位点变异检测中的应用
目的 通过检测慢性乙型肝炎重型(chronic severe hepatitis B,CSHB)患者趋化因子CXCL10[干扰素γ诱导蛋白(IFNγ-inducible protein,IP-10)]基因启动子区G-201A位点的变异率,探讨PCR-限制性片段长度多态性(restriction fragment length polvmorphism,RFLP)法用于批量单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)分型鉴定的应用价值.方法 选取解放军第三4○二医院的200例CSHB患者(CSHB组)为研究对象,300例健康体检者作为正常对照(normal control,NC)组.收集患者EDTA-K2抗凝全血,提取白细胞DNA,采用PCR-RFLP法进行检测,对其中185例[CSHB组93例(46.5%),NC组92例(30.7%)]样本(占总样品的37%)用DNA测序法进行验证.结果 185例样本用DNA测序法进行验证,经Kappa检验k=0.937,P＜0.05,说明二种检测结果 之间的一致性具有统计学意义,二种方法 的一致率为97.84%,符合体外诊断试剂临床试验指导方案中关于二种方法 一致性的专业要求(一致率≥95%).CSHB组趋化因子IP-10相关的G-201A的突变率为21.28%、NC组为13.82%,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 CSHB组患者的趋化因子IP-10基因启动子区G-201A位点的突变率明显高于NC组.本实验结果 表明,PCR-RFLP法经过直接测序法验证结果 可靠,可以用于标本的SNP分型.
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乙型肝炎病毒DNA YMDD变异的检测技术
拉米夫定治疗乙型肝炎耐药性的产生主要与HBV P基因突变有关,耐药株中多见P基因变异且相对集中于YMDD基序.YMDD变异的检测技术包括核苷酸序列测定法、聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析、基因芯片技术、聚合酶链反应微板核酸杂交-酶联免疫黏附法等.本文就乙型肝炎病毒DNA YMDD变异的检测技术作一综述.
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血管紧张素Ⅱ1型受体A1166C多态性与唐山地区原发性高血压
目的:探讨血管紧张素Ⅱ1型受体(AT1R)A1166C多态性与唐山地区原发性高血压(EH)的关系.方法:入选研究对象581例,其中正常对照人群291例,EH患者290例.所有研究对象用常规方法提取白细胞DNA,采用多聚酶链反应结合限制性内切酶(DdeI)方法检测AT1R基因A1166C多态性.结果:对照组和EH组CC、AC和AA基因型频率为0.4%,18.2%,81.4%;0%,12.1%,87.9%.对照组和EH组A等位基因频率分别90.5%和94.0%.EH组AT1R基因A1166C多态性AA基因型和A等位基因频率均较对照组增多,差异有统计学意义(P均=0.04).结论:AT1R基因A1166C多态性与唐山地区EH有关,可能是EH的一个遗传标志.
关键词： 高血压 原发性 血管紧张素Ⅱ1型受体 多态性 限制性片段长度 -
α-内收蛋白基因多态性与大动脉弹性相关性研究
目的 探讨α-内收蛋白基因变异(Gly460Trp)与大动脉弹性相关性研究.方法 (1)采用Complior SP脉搏波速度测定仪测量股-颈动脉PWV(C-FPWV),共319例,其中C-FPWV异常组204例,对照组115例;(2)采用聚合酶链反应和限制性酶切的片段长度多态分析方法检测α-内收蛋白基因变异(Gly460Trp).结果 (1)C-FPWV升高组收缩压(SBP)、舒张压(DBP)均显著高于对照组(P＜0.05);(2)C-FPWV升高组WW、W等位基因频率显著高于对照组(P＜0.05);(3)WW基因型与WG+GG基因型比较C-FPWV、收缩压、舒张压差异有显著性(P＜0.05);(4)Logistic回归结果显示:α-内收蛋白460WW基因型与大动脉弹性有密切相关性(P=0.001,OR=3.234,95% CI1.655-6.320).结论 α-内收蛋白基因变异(Gly460Trp)与大动脉弹性有密切相关性,WW型是大动脉弹性减退的敏感基因型.
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α-内收蛋白基因及内皮型一氧化氮合酶基因多态性与大动脉弹性相关性研究
目的 探讨α-内收蛋白基因变异(Gly460Trp)及内皮型一氧化氮合酶基因(G894T、T786C)变异与大动脉弹性相关性研究.方法 (1)采用Complior SP脉搏波速度测定仪测量股-颈动脉PWV(C-FPWV),共319例,其中C-FPWV异常组204例,对照组115例;(2)采用聚合酶链反应和限制性酶切的片段长度多态分析方法检测α-内收蛋白基因变异(Gly460Trp)及一氧化氮合酶(eNOS)基因变异(G894T、T786C).结果 (1)C-FPWV升高组收缩压(SBP)、舒张压(DBP)均显著高于对照组(P＜0.05);(2)C-FPWV异常组WW、TG+TT基因型、W、T等位基因频率显著高于对照组(P＜0.05).C-FPWV异常组T786C(CT、CC)基因型及C等位基因频率与对照组比较差异无显著性(P＞0.05);(3)ww和TG+TT基因型与WG+GG、TT基因型比较C-FPWV、收缩压、舒张压差异有显著性(P＜0.05);(4)Logistic回归结果显示:α-内收蛋白460WW基因型(P=0.001,OR=3.234,95% CI 1.655～6.320)及内皮型一氧化氮合酶(eNOS)基因G894T多态性TT、TG基因型是动脉弹性减退的危险因素(P=0.025,OR=0.477,95%CI 0.249～0.911) 结论 α-内收蛋白基因变异(Gly460Trp)及一氧化氮合酶基因变异(G894T)与大动脉弹性有密切相关性,WW、TT、TG型是大动脉弹性减退的敏感基因型.
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白介素-1受体拮抗剂基因多态性与2型糖尿病肾病的关系
目的探讨白介素-1受体拮抗剂(IL-Ra)基因多态性分布与2型糖尿病肾病的相关性. 方法应用聚合酶链反应-产物长度多态性检测87例2型糖尿病无肾病患者,78例2型糖尿病合并肾病患者和148名健康对照者的IL-1Rα第二内含子的86个碱基(bp)数目可变重复片段(VNTR)多态性. 结果 2型糖尿病无肾病患者等位基因A2及含A2基因型频率高于2型糖尿病合并肾病患者(P＜0.05). 结论 A2等位基因可能是糖尿病肾病发病的遗传因素之一.
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维生素D受体基因多态性与糖尿病的相关性
目的 研究维生素D受体(VDR)基因BsmⅠ酶切位点多态性是否与糖尿病(DM)的易感性相关.方法 采用PCR-RFLP方法分型并用X2检验比较各组间基因型及等位基因频率的分布.结果 全部研究对象中共见BB、bb、Bb三种基因型.1型糖尿病(T1DM)BB基因型频率为2%,Bb基因型频率为47%,分别明显高于对照组的0.5%和9.2%,而2型糖尿病(T2DM)的BB基因型频率为0.6%,Bb基因型频率为10.8%,与对照组分别相似.结论 VDR基因BsmI位点多态性与T2DM的易感性可能无关(P＞0.05),但与T1DM的易感性密切相关(P＜0.05).
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TGF-β1基因T29→C多态性与2型糖尿病肾病的相关性
应用PCR-RFLP技术检测福建地区167例2型糖尿病患者(其中80例合并糖尿病肾病)和62名健康对照者TGF-β1基因T29→C多态性,结果显示,C等位基因可能与糖尿病肾病发病相关.
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载脂蛋白A5-1131T＞C基因多态性与冠心病的关系
目的:探讨载脂蛋白(APO)A5-1131T＞C基因多态性与冠心病的关系.方法:采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性结合聚丙烯酰胺凝胶电泳技术,对186例冠心病患者(冠心病组)及268名健康对照者(对照组)的APOA5-1131T＞C基因多态性进行检测,同时采用酶法测定研究对象的血脂水平.结果:冠心病组与对照组的APOA5-1131T＞C基因型分布有显著性差异,冠心病组的C等位基因频率明显高于对照组(0.422比0.321,P＜0.05).不同APOA5-1131T＞C基因型的血清TG水平有明显差异,TC型和CC型的TG水平高于TT型(P均＜0.01),但TC型与CC型之间无显著性差异(P＞0.05);在冠心病组患者中,C等位基因携带者(TC+CC型)的TG水平也明显高于非C携带者(TT型1.73±0.95 mmol/L比1.46±0.86 mmol/L,P＜0.05);而其他血脂指标各基因型之间无统计学差异(P＞0.05).单因素logistic回归分析显示APOA5 TC+CC基因型是冠心病的危险因素[风险比值(OR)=1.520,95%可信区间(95%CI)1.044～2.215,P=0.029],但多因素logistic回归分析校正体重指数、高血压、糖尿病和高密度脂蛋白胆固醇等影响因素之后,APOA5 TC+CC基因型不是冠心病的独立危险因素(OR=1.331,95%CI 0.634～2.794,P=0.449).结论:冠心病患者的APOA5-1131C等位基因频率显著高于健康人群,APOA5-1131T＞C基因变异与血清TG水平增高密切相关,APOA5-1131T＞C基因变异可能与冠心病危险性增加有关,但作为冠心病的独立危险因素尚需更大样本人群研究证实.
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心肌梗死患者ALOX5AP基因SG13 S114T/A和SG13589G/A多态性研究
目的 探讨中国汉族人群中的ALOXSAP基因SG135114T/A和SG13589G/A多态性与心肌梗死的关系.方法 应用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法对95例急性心肌梗死(AMI)患者和114名健康对照者外周血提取的DNA样本,进行SG135114T/A和SG13S89G/A点突变分析,对突变型进行DNA测序验证.结果 SG13S114T/A及SG13S89G/A单核苷酸多态位点基因频率在AMI组和对照组与HapMap报道数据差异无统计学意义.基因多态性与心肌梗死发病情况的相关情况:SG13S114A/A(OR=1.264,95%可信区间:0.637～2.510,P=0.45);SG13S114A/T(OR=1.127,95%可信区间:0.670～1.897,P=0.20);SG13S114T/T(OR=0.745,95%可信区间:0.424-1.311,P=1.04).结论 无显著证据表明ALOXSAP基因SG13S114T/A和SG13S89G/A多态性与心肌梗死发病风险有密切相关性.
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内皮型一氧化氮合酶基因rs3918181位点多态性与原发性高血压的关系研究
目的 探讨天津市汉族人群内皮型一氧化氮合酶(eNOS)基因第14内含子rs3918181位点多态性与原发性高血压(EH)的关系.方法 采用聚合酶链反应-限制性内切酶片段长度多态分析法(PCR-RFLP)对290例EH患者和161名健康对照者的eNOS基因rs3918181位点进行基因多态性分型,同时检测所有研究对象的血脂等危险因素,分析不同基因型与EH发病的关系.结果 两组年龄、体质指数的差异有统计学意义(均为P＜0.05).EH组患者的AA、AG和GG基因型分布频率分别为0.293、0.393和0.314,对照组分别为0.180、0.472和0.348,两组相比差异有统计学意义(均为P ＜0.05)；EH组A与G等位基因频率分别为0.490和0.510,对照组分别为0.416和0.584,两组相比差异有统计学意义(均为P ＜0.05).影响EH的危险因素有年龄、体质指数.结论 eNOS基因rs3918181位点多态性与EH相关.
