首页 > 文献资料
-
脊髓小脑共济失调3型诱导多能干细胞系的建立和神经分化
背景：脊髓小脑共济失调3型(spinocerebel ar ataxia type 3，SCA3)是一种典型的遗传相关的神经退行性疾病。建立患者遗传背景的特异的疾病模型有利于研究疾病的发病机制，探讨针对疾病的治疗手段。
目的：观察脊髓小脑共济失调3型诱导多能干细胞系的神经分化效率以及CAG拷贝数的稳定性。
方法：临床获取脊髓小脑共济失调3型患者皮肤组织，分离培养患者特异的皮肤成纤维细胞，重编程成纤维细胞获得诱导多能干细胞。对患者特异的诱导多能干细胞和正常人的诱导多能干细胞(NHF)和胚胎干细胞(ES-10)进行神经诱导分化，通过流式细胞术比较分化效率，Western Blot检测神经元中ataxin-3的聚集，PCR检测培养过程SCA3/ATXN3基因CAG重复数目。
结果与结论：成功获得与成纤维细胞相同遗传背景的诱导多能干细胞，具有与人胚干细胞相似的形态学及多向分化潜能，各细胞系都能定向分化为神经干细胞，重编程前后和诱导神经分化前后的CAG数目无明显改变。来源于脊髓小脑共济失调3型患者的诱导多能干细胞分化为神经干细胞的效率低于正常人诱导多能干细胞(NHF)和胚胎干细胞(ES-10)。这些结果说明通过重编程技术可以成功建立人诱导多能干细胞并将其定向诱导分化为神经干细胞，整个实验过程CAG数目无明显改变，与患者的体细胞相一致。 -
转化生长因子-β信号通路抑制剂对胚胎干细胞定向分化的影响
目的 探讨转化生长因子(TGF)-β信号通路抑制剂在胚胎干细胞(ESCs)向神经分化过程中的作用.方法 以单层贴壁方法诱导ESCs向神经干细胞(NSCs)分化.实验组加TGF-β抑制剂,对照组不加.9 d后进行免疫荧光染色和qRT-PCR,统计Nestin阳性细胞比例,并检测NSCs标志物Nestin表达量.对实验组和对照组来源的NSCs分别进行神经元诱导分化和多巴胺(DA)能神经元诱导分化.免疫荧光染色后进行细胞计数,统计各类阳性细胞(包括β-tubulinⅢ+和TH+/MAP2+阳性细胞)比例,qRT-PCR检测神经元早期标志物β-tubulinⅢ、成熟神经元标志物MAP2及DA能神经元标志物TH的表达情况.结果 实验组ESCs能更多地分化为NSCs,并且分化为未成熟神经元及DA能神经元的比例显著高于对照组(P<0.05).结论 TGF-β信号通路抑制剂能促进ESCs定向分化.
-
db-cAMP对胚胎干细胞来源的神经细胞酪氨酸羟化酶mRNA水平的影响
目的体外诱导胚胎干细胞(ES细胞)定向分化为多巴胺能神经元并促进其长期存活和特性维持.方法以全反式维甲酸(ATRA)诱导ES细胞定向分化为神经细胞,培养液中加入双丁酰基环腺苷磷酸(db-cAMP)继续培养,RT-PCR方法检测酪氨酸羟化酶基因(TH基因)和survivin基因的mRNA水平变化.结果db-cAMP可上调ES细胞来源的神经细胞中TH基因的mRNA水平,在实验早期还可上调survivin基因的mRNA水平.结论db-cAMP可以促进ES细胞来源的多巴胺能神经元的存活和特性维持,抗凋亡可能是其作用机制之一.
-
大鼠骨髓间质多能成体祖细胞系统移植治疗脑缺血性损伤的研究
目的 探讨骨髓间质分离的多能成体祖细胞(MAPCs),通过系统移植方式(尾静脉注入)进入大鼠脑组织内及修复受损的神经功能.方法 采用改良Nagasaway与Zea Longa等线栓法建立大鼠脑缺血再灌注模型,并将大鼠随机分为对照组(n=40)和MAPCs组(n=40).将在体外纯化、增殖和已用5-溴脱氧尿苷(BrdU)处理过的MAPCs经尾静脉注射入大鼠体内.采用行为学评定、免疫荧光技术、RT-PCR和免疫电镜等方法识别移行入大鼠脑组织内的MAPCs分化的神经元样细胞及其功能表达.结果 (1)MAPCs能移行入大鼠脑组织内并在大脑中动脉阻断(MCAO)的同侧海马区分化为神经元样细胞,免疫荧光双重标记染色显示BrdU、神经元特异性烯醇化酶(NSE)表达阳性;(2)与对照组比较,在MAPCs移植组(MAPCs组),MCAO所致的大鼠行为损伤明显恢复,神经生长因子(NGF)表达水平明显升高(P＜0.05);(3)电镜下观察到MAPCs所分化的神经样细胞与其它神经细胞形成突触联系.结论 MAPCs能经血液途径进入脑缺血灶微环境中,分化为神经样细胞并有效地修复大鼠MCAO所致的神经功能缺失症状.因此,MAPCs有望成为中枢神经系统疾病自体移植治疗的佳候选干细胞之一.
-
冻存和复苏对人脐带间充质干细胞神经分化潜能的影响
目的 探讨冻存和复苏对人脐带间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)的形态、表型和向神经细胞分化的潜能的影响.方法 在无菌条件下采集脐带组织,以酶消化和贴壁培养法获得人脐带MSCs.对不同代人脐带MSCs进行冻存和复苏,以相差显微镜观察期形态学变化,以流式细胞仪检测表型变化,以神经分化方案进行诱导并以免疫荧光法检测各种神经标志物的表达.结果 不同代冻存后复苏的人脐带MSCs仍呈均匀一致的长梭形贴壁生长,表达MSCs标志物CD13、CD29、CD44和CD90,但不表达造血细胞标志物CD14、CD31、CD34和CD45.经神经分化诱导后,仍可分化为NSE阳性的神经元样细胞、GFAP阳性的星形胶质细胞样细胞和MBP阳性的少突胶质细胞样细胞.结论 冻存和复苏后人脐带MSCs的形态、表型和神经分化潜能均保持稳定,可作为快速获得人脐带MSCs的方法.
-
骨髓基质多能成体祖细胞在帕金森病大鼠体内移植与多巴胺能神经元分化的研究
目的探讨骨髓基质分离的多能成体祖细胞(MAPCs)通过系统移植(即尾静脉注射)方式进入大鼠脑组织内并修复受损的神经功能.方法制作实验性帕金森病大鼠模型,将在体外纯化、增殖和已用5-溴-2脱氧尿苷(BrdUrd)处理过的MAPCs通过尾静脉注入帕金森病大鼠体内.3个月后,对移植大鼠采用免疫组化技术、RT-PCR、免疫电镜、行为学评定等方法鉴定移行入大鼠脑组织内的MAPCs、其分化的神经元样细胞以及神经功能的修复.结果MAPCs能移行入大鼠脑组织内并在中脑黑质和纹状体区分化为神经元样细胞;6-羟多巴诱导的大鼠行为损伤有明显恢复;多巴胺-β-羟化酶、神经生长因子和多巴胺转运体mRNA的表达水平明显升高;电镜下观察到MAPCs所分化的神经细胞与其它神经细胞形成突触联系;这些资料表明MAPCs能在大鼠脑组织内分化为多巴胺能神经细胞并发挥相应的神经功能.结论骨髓基质分离的MAPCs能通过系统移植方式进入大鼠脑组织内,在中脑微环境中可自主分化为多巴胺能神经细胞并有效地修复6-羟多巴诱导的神经功能缺损.因此,MAPCs有望成为中枢神经系统疾病自体移植治疗的佳候选干细胞之一.
-
诱导成人骨髓基质细胞成为神经干细胞及其分化的实验研究
目的体外诱导成人骨髓基质细胞 (BMSCs)转化为神经干细胞(NSCs)进而分化为神经元和胶质细胞.方法以含有碱性成纤维细胞生长因子 ( bFGF)或表皮生长因子(EGF)加 bFGF或 bFGF、 EGF 加全反式维甲酸 (ATRA)的培养液培养 BMSCs ,进行显微镜观察,纤维连接蛋白 (fibronectin)、I型胶原(collagen Ⅰ)和神经上皮干细胞蛋白 (nestin)免疫组织化学染色和神经元特异烯醇化酶 (NSE), 胶质纤维酸性蛋白 (GFAP)免疫荧光染色.结果经诱导物诱导72h后,fibronectin和 collagen I免疫阳性细胞减少. nestin免疫阳性细胞增多.7d后,其又减少.同时 NSE和 GFAP免疫阳性细胞增多.细胞分化后, NSE阳性细胞多占细胞总数的 24.76%±2.72% ,同时GFAP阳性细胞占细胞总数的36.58%±3.26%.结论 EGF、bFGF、ATRA及适宜的培养液可使 BMSCs定向,转化为 NSCs,进而分化为神经元和胶质细胞.
-
SOX2对牙髓干细胞神经分化的促进作用及其意义
目的：探讨转录因子 SOX2对牙髓干细胞（DPSCs）神经分化的影响，为研究 DPSCs神经分化的机制提供依据。方法：从人源第三磨牙牙髓中分离 DPSCs （DPSCs 组），通过逆转录病毒感染方法构建过表达SOX2的DPSCs （DPSCs-SOX2组），以空白载体感染的 DPSCs 作为对照组（DPSCs-vector组），采用神经分化培养基诱导各组DPSCs分化为神经前体细胞（NPCs）。采用 CCK-8法分析各组 NPCs的增殖指数（PI）；采用qPCR和流式细胞术检测各组 NPCs 中 Nestin和 Pax6基因的表达水平；采用免疫荧光和流式细胞术分析各组NPCs在神经元分化方面的能力和分化后β3-Tubulin的表达效率。结果：通过神经分化培养基的定向诱导，正常DPSCs、DPSCs-vector和DPSCs-SOX2均可通过分化形成 NPCs，但 DPSCs-SOX2组 NPCs 的 PI 和 NPCs 中Nestin和Pax6表达水平明显高于 DPSCs组和 DPSCs-vector组（P＜0.05）；DPSCs-SOX2组 NPCs 在神经元分化方面也具有一定的优势，分化后细胞的β3-Tubulin表达效率明显高于其他2组（P＜0.05）。结论：SOX2对DPSCs的神经分化具有一定的促进作用。
-
p19细胞神经分化研究进展
神经细胞的分化、发育及成熟是现代生命科学研究的热点之一,目前认为p19胚胎癌细胞系是一个研究神经发机制的理想细胞模型,本文对p19细胞、其所分化来的神经元以及参与该细胞神经分化的相关因素作一综述.
-
适宜电刺激促进脂肪干细胞向神经方向分化
目的:研究不同强度电刺激对脂肪干细胞(adipose tissue-derived stem cells,ADSC)向神经元方向分化的作用.方法:在细胞电刺激室内对ADSCs进行电刺激(10Hz,1h),强度选用五个强度,分别为0V/cm、0.5 V/cm、1.0 V/cm、3.0 V/cm、5.0 V/cm;电刺激后,对细胞进行流式凋亡检测及CCK-8活性检测,明确不同电刺激对ADSCs的影响;同时,应用免疫荧光染色、Western Blotting评估各组细胞神经特异性标志物microtubule-associated protein 2 (MAP-2)与β-tubulin的表达情况.应用RT-PCR检测MAP-2、β-tubulin和neurofilaments 200(NF-200)的mRNA水平,评价不同强度电刺激对ADSCs其向神经方向分化的影响.结果:1V/cm的电刺激,未引起明显的细胞凋亡,同时促进了细胞增殖.此外,1V/cm电刺激后,细胞中的MAP-2和β-tubulin的免疫荧光染色强度及蛋白含量显著提高;MAP-2、β-tubulin和NF-200的mRNA及蛋白量显著提高.3V/cm及更高强度的电刺激可导致凋亡细胞数目显著增加.结论:强度为1V/cm的电刺激可促进脂肪干细胞的增殖,并促进其向神经方向分化,为神经损伤的治疗提供了新的可行方法.
-
Nurr-1基因转染促进脂肪干细胞的神经分化
目的:研究孤儿核受体相关基因1(Nurr-1)对脂肪干细胞(adipose tissue-derived stem cells,ADSC)向神经元方向分化的潜在作用.方法:流式细胞术与成骨、成脂诱导技术鉴定脂肪干细胞;Nurrr-1基因转染脂肪干细胞后,应用神经特异性标志物MAP-2,β-tubulin的免疫荧光染色评估其向神经方向分化的能力.结果:流式细胞术结果表明培养的细胞CD29,CD44表达90％以上,CD45,CD90表达均低于1.5％,经过诱导后,油红O、茜素红S染色均呈阳性,表明所培养的细胞为脂肪干细胞;慢病毒转染Nurr-1基因后,免疫荧光染色检测MAP-2,β-tubulin的免疫荧光强度显著增加;RT-PCR结果显示Nurr-1转染的脂肪干细胞的MAP-2、β-tubulin、NF200的表达量显著提高.结论:Nurr-1基因转染能促进脂肪干细胞向神经方向分化,为神经损伤和神经退行性病变的治疗提供了新途径.
关键词： 脂肪干细胞 孤儿核受体相关基因1 神经分化 慢病毒 -
巨大胃平滑肌肉瘤一例报告
病例女，62岁，反复上腹部胀痛2月伴体重减轻5kg入院。查体：消瘦，轻度贫血貌，腹部膨隆呈球形，从剑突下至耻骨联合上可扪及一巨大肿块，质地中等，表面不平，边界不清，活动度小，全腹轻压痛。血白细胞8.7×109/L，血红蛋白87g/L。B超示：腹腔内有巨大的实质性不均质占位，伴局部坏死液化。CT示：腹腔巨大软组织肿块伴坏死。X线钡餐检查示：胃大弯侧巨大压迹。择期剖腹探查见：肿块占据整个腹腔，36cm×34cm×15cm大小，呈球形，触之坚韧，表面呈结节及分叶状，有被膜，呈鱼肉样，肿块与胃大弯侧胃体近半处带蒂状相连，周围无浸润，周围淋巴结无肿大，未侵及胃粘膜。即予行肿块切除及胃局部切除术。切下的肿瘤称重为7kg。病理诊断：胃壁巨大间质/平滑肌肉瘤(部分肿瘤细胞向神经分化)。周围网膜组织中未见肿瘤组织。
-
快速聚集无血清悬浮培养法诱导BALB/c小鼠胚胎干细胞分化为大脑皮质椎体神经元
目的 以往的研究多集中于胚胎干细胞(ESCs)经外部因素的诱导而转化为神经元,本研究拟探讨一种新的诱导ESCs定向分化方法——快速聚集无血清悬浮培养法(SFEBq).方法 BALB/c小鼠囊胚内细胞团(ICM)消化成单个细胞,培养传代并鉴定后,应用改进的SFEBq诱导小鼠胚胎干细胞(mESCs)向神经细胞选择分化,并应用免疫荧光染色和流式细胞仪检测Bfl+和Emxl+神经前体细胞的比例,RT-PCR检测不同分化阶段的细胞标志基因表达.结果 ①分离培养得到的mESCs生长状态良好;②SFEBq使mESCs自主发生神经细胞,无需外部诱因,细胞种植量为3 000个/孔时,细胞Bfl+和Emxl+相对表达量高;③mESCs按照一个先神经元-后胶质细胞的顺序有效分化,与体内胚胎神经组织发育先后顺序一致,且诱导的神经前体细胞可分化为皮质椎体神经元.结论 建立了一种改良的高效ESCs诱导转化的神经元的SFEBq.
关键词： 胚胎干细胞 快速聚集无血清悬浮培养法 神经分化 大脑 皮质椎体神经元 -
苯丙氨酸及其代谢物对P19细胞神经分化的影响
探讨苯丙氨酸及其代谢物对P19细胞分化的影响及机制.实验各组从P19细胞神经分化诱导期开始分别加入苯丙氨酸、苯乙酸和苯乳酸,观察神经分化期细胞形态,MTT法检测神经分化期细胞存活率和LDH漏出量的变化,并通过流式细胞仪检测诱导后细胞周期有无变化.结果显示:苯丙氨酸及其代谢物可使P19神经元肿胀、崩解,神经突起纤细且突起数少,可降低P19细胞存活率,但对LDH漏出量并无影响,对诱导后的P19细胞周期也无影响.以上结果提示,苯丙氨酸及其代谢物可干扰P19细胞的神经诱导过程,母源性苯丙酮尿症中枢神经系统损伤可能与其在脑发育早期阶段神经诱导及分化过程中受到高苯丙氨酸及其代谢物影响有关.
-
拓扑异构酶Ⅱβ在神经发育中的作用
Ⅱ型DNA拓扑异构酶是一类ATP依赖性酶,能引导双链DNA绕过另一个双链上的缺口来催化基因组DNA拓扑结构的改变.在哺乳动物中,Ⅱ型DNA拓扑异构酶又分为α和β两个亚型.β亚型高表达于已完成终末分裂并能分化为神经细胞的一类细胞中.近年来,越来越多的研究表明拓扑异构酶Ⅱβ在神经发育中有至关重要的作用.细胞进行终末分裂以后,拓扑异构酶Ⅱβ能够调控决定神经命运的一些特定基因的表达.这些基因主要与神经分化、迁移以及轴突导向等过程相关.本文就近几十年内关于拓扑异构酶Ⅱβ在神经发育中作用的研究进展进行综述.
-
Wnt信号通路关键基因β-catenin在RA诱导的P19胚胎性癌细胞神经分化过程中的亚细胞分布
Wnt信号参与了小鼠早期神经发育.我们以往的实验结果表明,Wnt信号可引起P19胚胎性癌细胞的神经分化.为了进一步了解Wnt信号在P19神经分化过程中行使功能的时间,我们以Wnt信号通路关键成员β-catenin是否定位在细胞核中作为考察Wnt信号是否能传递到细胞核内调控下游基因活性的指标,分析了Wnt信号在P19细胞神经分化过程中的活性.我们观察到,β-catenin在RA诱导的P19细胞分化的第2到第4天存在核定位.在此期间,Wnt下游基因En-2的表达量也有明显增加.因此,在P19神经分化过程中,Wnt活性可能发生在这一阶段.同时,在神经突的形成、伸长及神经纤维集束过程中,β-catenin在神经突起及神经纤维上也存在特异性分布,提示在此过程中β-catenin可能也行使了功能.
-
过量表达Wnt-1基因诱导P19细胞的神经分化
Wnt-1基因在小鼠神经发育过程中起着重要作用.该基因在胚胎性癌细胞P19向神经分化过程中存在瞬时性表达.利用克隆到的Wnt-1基因转染P19细胞(Wnt-1/P19),可使细胞不经视黄酸(RA)诱导,自发向神经细胞方向分化.早期神经分化关键基因MASH-1在Wnt-1/P19细胞的神经分化过程中的表达,晚于RA诱导引起的P19细胞的分化过程.
-
去分化肌肉干细胞神经分化潜能的探讨
目的 探讨去分化肌肉干细胞经条件培养诱导,具有神经干细胞性质并分化为终末神经细胞的潜能.方法 依次用神经干细胞增殖及神经细胞分化条件培养基,对去分化肌肉干细胞进行体外诱导,促使其向神经干细胞转变以及向终末神经细胞分化,并通过形态学、免疫细胞化学、RT-PCR等实验手段研究其性质并加以鉴定.结果(1)去分化肌肉干细胞在神经干细胞增殖条件培养基诱导下,可形成神经球,EdU标记阳性,抗Nestin、Neurofilament-m(NFm)、GFAP、CNPase阳性；Myogenin表达水平下调,而Nestin、Sca-1表达上调；(2)经神经细胞分化条件培养基诱导,神经球细胞可分化为形态学上典型的、抗NFm阳性神经元,以及抗GFAP、CNPase阳性神经胶质细胞.结论 去分化肌肉干细胞具有神经系的多分化潜能.
-
人羊膜细胞与创伤性脑组织提取液共培养的实验研究
目的 探究将人羊膜细胞(HACs)置于创伤性脑组织提取液的条件培养基中,模拟HACs在创伤性脑损伤微环境下的分化和增殖情况,为HACs脑内移植提供基础研究.方法 取无并发症剖官产羊膜,用0.25%胰酶反复消化3次提取HACs,接种后48h去除未贴壁的HACs.采用改进的Feeney法制作大鼠创伤性脑损伤(TBI)模型,TBI 24 h后制备创伤性脑组织提取液.将HACs分别接种于RPMI 1640培养基(1640)、RPMI 1640培养基与正常脑组织提取液(1640+NB)、RPMI 1640培养基与创伤件脑组织提取液(1640+TBI)3组.共培养7 d后HE染色显微镜下检测各组细胞形态.培养前后分别行Nestin和MAP-2单抗免疫组化检测.将HACs以104/ml密度分别接种上述3种培养基,培养后1、4和7 d经酶联免疫检测仪行四氮唑盐(MTT)比色法检测各组HACs活性.结果 1640组HACs呈圆形或椭圆形,核大居中;1640+TBI组部分HACs形态出现锥形、三角形等神经元样改变.HACs培养前可见Nestin阳性细胞,培养后1640+TBI组可见MAP-2阳性表达.各组HACs增殖性均不佳.结论 HACs与创伤性脑组织提取液共培养后可转化为神经元样细胞.HACs增殖性不佳.
-
建立经优化的促P19鼠胚胎癌细胞神经分化模型
目的:建立P19胚胎癌细胞(embryonal carcinoma cells,EC)定向分化为神经样细胞体外模型,用于快速初步确定小分子化合物促神经发生活性.方法:采用单因素变量法进行培养条件探索,考察全反式维甲酸(all-trans retinoic acid,RA)浓度、悬浮天数、贴壁细胞密度和贴壁后培养液选择对分化的影响.4d后形成的拟胚体经胰蛋白酶消化为单细胞,并建立分阶段确定评价指标,适用于不同时相评价.光镜观察细胞表型,神经元特异蛋白β-tubulinⅢ免疫荧光染色加以确认.结果:P19细胞悬浮培养4d,加入RA(终浓度1μmol/L).以单细胞悬液在1.2×106/ml密度贴壁培养为佳条件.光镜观察在第8天即有神经元样细胞表型,在第16天可形成神经元样网状结构,两个评价时间点免疫荧光染色均呈β-tubulinⅢ阳性,并与光镜表型相一致.结论:P19细胞分化为神经元样表型,为小分子促神经分化初级筛选提供模型.
