首页 > 文献资料
-
野生型PTEN基因对人多发性骨髓瘤细胞株RPMI8226增殖、凋亡和侵袭活性的影响
目的 探讨外源性野生型PTEN基因对人多发性骨髓瘤(MM)细胞株RPMI8226增殖、凋亡、侵袭活性的影响以及PTEN/FAK信号传导通路在细胞侵袭活性中的作用.方法 将携带人野生型PTEN及绿色荧光蛋白的腺病毒(Ad-PTEN-GFP)及空载体腺病毒(Ad-GFP)体外转染至RPMI8226细胞.通过MTT法检测细胞生长曲线,Hoechst33342染色检测细胞凋亡,荧光定量PCR(FQ-PCR)检测PTEN及FAK mRNA水平变化,Western印迹检测PTEN、FAK及p-FAK蛋白变化,Transwell小室检测RPMI8226细胞侵袭能力.结果 Ad-PTEN-GFP以感染复数为100转染RPMI8226细胞后,第4天达到大生长抑制率为42.01%,Ad-PTEN-GFP转染RPMI 8226细胞72 h后细胞凋亡率为(35.02±6.80)%,PTEN mRNA及蛋白表达升高,FAK mRNA以及FAK、p-FAK蛋白表达下调,与Ad-GFP组相比差异显著(P<0.01,P<0.05);Transwell小室结果显示,转染Ad-PTEN-GFP组漏入下室内及黏附于下室面细胞数量较Ad-GFP组显著减少(P<0.01).结论 转染野生型PTEN基因的RPMI8226细胞增殖受抑,凋亡增加,细胞侵袭力明显减弱,其作用可能与下调FAK、p-FAK表达有关.
-
缺氧所致海马神经元N-甲基-D-天冬氨酸2B受体和PTEN基因的表达
目的 探讨OGD缺氧损伤后大鼠海马神经元NR2B受体和抑癌基因PTEN的表达量,以及NR2B与PTEN是否有生理性相互作用关系,为研究PTEN基因在脑缺血中的保护作用机制奠定基础.方法 建立海马神经元体外OGD损伤模型,采用细胞比色分析(colorimetric assay)法和Western blotting检测神经元NR2B含量,RT-PCR和Western blotting测定PTEN基因的mRNA和蛋白表达水平,免疫沉淀和Western blotting研究NR2B与PTEN的相互作用.结果 细胞比色分析和Western blotting结果显示神经元有大量NR2B表达,OGD损伤72h后NR2B含量表达量明显减少(P<0.05);Western blotting和RT-PCR结果显示OGD损伤后PTEN表达量略有下降但尚无统计学意义(P>0.05),免疫沉淀显示mN与NR2B在物理上连接形成复合物.结论 海马神经元膜表面NR2B含量丰富,PTEN基因在海马神经元里有表达,OGD缺氧损伤再灌注引起NR2B受体和PTEN基因表达量下降,PTEN与NR2B有生理性相互作用.
-
PTEN基因真核荧光表达载体的构建及其在喉癌细胞株中的表达
目的:构建人PTEN基因的真核荧光表达载体并在Hep-2喉癌细胞中高效表达,阐明PTEN基因在喉癌细胞株中的抑癌效果并为喉癌的基因治疗奠定基础.方法:从人喉黏膜组织中提取总RNA,经逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)得到PTEN全基因.克隆入PGEM-T easy载体上,经过PCR和酶切鉴定为阳性的克隆,进行测序分析.将所获得的基因定向克隆入Pegfp-C1载体中构建PTEN真核荧光表达载体,并将其转入Hep-2细胞中进行表达,Western blotting检测其表达.结果:反转录PCR扩增后的产物,在约1 400 bp处可观察到特异性条带,序列分析表明与GenBank中的PTEN基因序列相同.PCI-PTEN真核载体转染Hep-2细胞后的Western Blotting表明表达产物与抗人PTEN单克隆抗体有特异性免疫反应.结论:成功构建出PTEN真核荧光表达载体,诱导产生蛋白经检测证实为PTEN蛋白.
-
亚细胞定位PTEN基因真核表达载体的构建与鉴定
目的:构建人野生型亚细胞定位PTEN基因真核表达载体,为进一步研究其抗肿瘤作用奠定基础.方法:以胎盘组织RNA为模板,利用RT-PCR技术扩增H的基因片段.PCR产物与T载体连接,转化大肠杆菌,获得T-PTEN质粒,进行酶切鉴定和测序.以T-PTEN质粒为模板,利用PCR技术将核定位信号(NSL)加入PTEN序列.PCR产物与T载体连接,转化大肠杆菌,获得T-NSL-PTEN质粒.真核表达载体pcDNA3.1及T-NSL-PTEN质粒经EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切后连接,转化大肠杆菌,获得重组载体pcDNA3.1-NSL-PTEN,进行酶切和测序鉴定.结果:重组质粒PUM-PTEN酶切在1 200 bp处见目的片段,与预期结果符合.测序结果显示基因序列与目的基因完全一致;重组质粒PUM-NSL-PTEN酶切在1 200 bp处见目的片段,测序结果显示基因序列与设计一致,核定位信号成功加入;重组质粒pcDNA3.1-PTEN酶切在1 200 bp处见目的片段,测序结果显示基因序列与目的基因相同;重组载体pcDNA3.1-NSL-PTEN经双酶切和测序证实了其正确性EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切在1 200 bp处见目的片段,与预期结果一致.测序结果显示,核定位信号成功加入,其后是阅读框架正确的PTEN基因序列.结论:成功构建可表达亚细胞定位PTEN的真核表达载体pcDNA3.1-NSL-PTEN.
-
抑癌基因PTEN真核表达载体的构建及其在人舌鳞癌SCC-4细胞系中的表达
目的:构建抑癌基因PTEN真核表达载体pEGFP-PTEN,并观察其在人舌鳞癌scc-4细胞系中的表达,为舌鳞癌的基因治疗提供理论依据.方法:提取人HeLa细胞总RNA,采用RT-PCR法获取PTEN全基因,克隆至pMD18-T载体,经EcoR Ⅰ和XhoⅠ双酶切后与真核表达载体pEGFP-N1连接,构建pEGFP-PTEN重组质粒.双酶切及测序鉴定后,经脂质体介导转染至体外培养的人舌鳞癌SCC-4细胞系,荧光显微镜观察绿色荧光蛋白在细胞内的表达；Western blotting法检测细胞内PTEN蛋白的表达.结果:pEGFP-PTEN重组质粒双酶切,克隆的目的基因片段约为1 200 bp,测序结果与GenBank上PTEN序列完全一致；荧光显微镜下观察到pEGFP-PTEN在SCC-4细胞系中成功表达；Western blotting结果,转染组PTEN蛋白表达强度为1.07±0.15,与空转染组(0.62±0.11)和未转染组(0.57±0.08)比较差异有统计学意义(P＜0.05).结论:成功构建pEGFP-PTEN重组真核表达载体,该载体能在人舌鳞癌SCC-4细胞系中表达.
-
脑胶质瘤组织PTEN mRNA表达及其基因突变SSCP分析
目的:探讨PTEN基因表达水平及其基因突变与脑胶质瘤的发生及恶性进展的关联性.方法:选取脑胶质瘤组织15例,以4例非胶质瘤脑组织为对照,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测脑胶质瘤组织PTEN mRNA表达水平,采用单链构象多态性分析法(SSCP analysis)快速筛查脑胶质瘤组织PTEN基因突变状况.结果:RT-PCR结果,脑胶质瘤组织PTEN mRNA表达水平(0.063±0.006)较对照组(0.126±0.015)明显降低(P<0.05).经单链构象多态性分析,脑胶质瘤组织PTEN基因外显子8、9未检测到突变,但其中1例PTEN基因外显子5的聚丙烯酰胺凝胶电泳结果显示电泳带飘移,考虑可能为杂合子突变.结论:PTEN基因低表达及基因突变可能对胶质瘤发生、发展有促进作用.
-
抑癌基因PTEN对人结肠癌LoVo细胞生长的影响
目的:探讨PTEN基因转染对结肠癌LoVo细胞的抑制作用.方法:将人野生型及突变型PTEN cDNA通过脂质体导入结肠癌细胞LoVo中,并用RT-PCR、流式细胞术检测细胞的PTEN mRNA和蛋白质表达.用流式细胞仪和MTT法分析5-Fu对转染前后LoVo细胞抑制周期和诱导凋亡的能力.结果:转染野生型PTEN基因可明显增强结肠癌LoVo细胞的PTEN表达,5-Fu对转染后的LoVo细胞抑制细胞周期和诱导凋亡的作用明显增强.突变型在结肠癌细胞LoVo中有表达但无明显抑制作用.结论:转染的PTEN基因可显著上调结肠癌LoVo细胞的PTEN表达,促进细胞凋亡;联合应用PTEN基因转染和5-Fu可获得协同的细胞毒作用.
-
miRNA-21对肺癌A549细胞抑癌基因PTEN表达的调控
目的 探讨miRNA-21对肺癌A549细胞抑癌基因PTEN表达的调控作用.方法 人工合成miRNA-21序列,插入到质粒pGenesil-1中,构建重组真核表达质粒,并转染至肺癌A549细胞,采用RT-PCR和Western blot分别检测细胞PTEN基因mRNA转录水平和蛋白的表达水平.结果 经酶切和测序鉴定,表明重组真核表达质粒构建正确.转染重组真核表达质粒的A549细胞PTEN基因mRNA转录水平与未转染组相比,差异无统计学意义,蛋白表达水平较未转染组明显降低.结论 miRNA21可能主要在翻译水平调控PTEN基因的表达.
-
真核重组表达质粒pTT5-CTP-PTEN的构建及其在HEK293-6E细胞中的表达
目的 构建真核重组表达质粒pTT5-CTP-PTEN,并在HEK 293-6E细胞中进行表达.方法 合成融合基因CTP-PTEN,定向克隆至真核表达载体pTT5中,构建重组表达质粒pTT5-CTP-PTEN,转化感受态E.coli DH5α,提取质粒,进行双酶切及测序鉴定.在Lipofectamine 2000的介导下,将鉴定正确的重组表达质粒转染至HEK 293-6E细胞,Western blot法检测细胞中融合蛋白CTP-PTEN的表达.结果 经双酶切及测序鉴定,证明重组表达质粒pTT5-CTP-PTEN构建正确.转染48 h后,HEK 293-6E细胞中可见相对分子质量约49 700的CTP-PTEN融合蛋白条带.结论 成功构建了重组质粒pTT5-CTP-PTEN,并于HEK 293-6E细胞中表达了CTP-PTEN融合蛋白.
关键词： PTEN基因 胞浆转导肽 基因表达 真核细胞 HEK 293-6E细胞 -
PTEN基因及其与胶质瘤关系的研究进展
PTEN基因是近年来新发现的一种抑癌基因,具有磷酸脂酶活性,可作用于脂类底物PIP3及蛋白底物FAK,使其去磷酸化,从而诱导肿瘤细胞凋亡,介导肿瘤细胞的G1期阻滞,抑制肿瘤细胞的侵袭播散,促进细胞分化.PTEN在GBM中有较高的突变率,是判断GBM患者预后的良好指标,同时为基因治疗胶质瘤提供一种新途径.
-
PTEN基因与脑胶质瘤
PTEN基因是肿瘤抑制基因家庭的新成员.它具有蛋白质酪氨酸磷酸酶催化区域,并与张力蛋白、辅助蛋白同源.在高级别胶质瘤中PTEN基因发生突变而失活,但经复制缺陷型腺病毒转染野生型PTEN基因的瘤细胞增殖可受到抑制.
-
抑癌基因PTEN在胃癌组织中的表达及意义
目的 探讨抑癌基因PTEN在胃癌组织中的表达水平及与其生物学行为的关系.方法 应用免疫组织化学SP法检测56例胃癌组织,10例正常粘膜组织中的PTEN蛋白表达情况.结果 胃癌组织中PTEN阳性率为51.8%(29/56),显著低于正常胃粘膜组织中的阳性率100.0%(10/10).在各组织学类型中,高分化腺癌PTEN蛋白阳性表达率高72.2%(13/18)显著高于低分化腺癌27.8%(5/18).PTEN蛋白的表达与淋巴结转移有关(P＜0.05).结论 PTEN基因的异常改变与胃癌的发生发展密切相关,可能是胃癌进一步恶化的标志之一,可作为胃癌生物学行为的参考指标,为胃癌的基因治疗提供参考依据.
-
PTEN基因及其在甲状腺癌中的研究
大约有4%~7%的人口在他们的一生中会形成临床上明显的甲状腺结节,大多数情况下术前诊断通过针吸活组织检查(Needle Biopsy)是不确定的.因此,对甲状腺良恶性肿瘤的诊断检测的改进成为迫切的需求.PTEN基因是新发现的抑癌基因,在大量的实验研究中已经证实.它的失活或突变与人类多种肿瘤的发生、发展及预后有关.对于PTEN基因在甲状腺肿瘤中的研究,成为目前研究的焦点.
-
PTEN基因与子宫内膜癌的研究现状
子宫内膜癌是女性生殖系统常见的恶性肿瘤,在其发生发展过程中,抑癌基因的失活、突变与癌基因的异常激活可能发挥了重要作用.研究发现,在一些家族性癌症综合征以及许多散发性肿瘤的分子病理形成中,均存在PTEN基因的突变与丢失,然而,在子宫内膜癌中PTEN基因的突变发生率高,而且在已被认为与子宫内膜癌发生、发展有关的基因中,也以PTEN基因的突变发生率高.由此可见,PTEN基因的突变、丢失与子宫内膜癌发生、发展关系甚为密切.
-
探究PTEN基因在肝癌组织中的表达
目的：探究PTEN基因在肝癌组织中的表达意义。方法：笔者所在医院2012年1月-2013年3月共收治了24例肝癌患者，对患者的组织切片进行分析。结果：肝癌组织中PTEN的表达率是37.5%，癌旁组织中PTEN蛋白的表达率是100%，癌旁组织中的PTEN蛋白表达率明显高于肝癌组织(P<0.01)；肝癌组织分化程度与PTEN的表达呈现正相关，其中高分化癌细胞的阳性表达率要明显比低分化的高(P<0.05)。结论：PTEN基因与肝癌的发生和发展以及进展有着紧密的联系，并且组织的分化程度越高，PTEN的表达率也就越高，肝癌的发生机制之一可能就是PTEN失活。
-
胃癌中抑癌基因PTEN研究进展
本文综述了抑癌基因PTEN在胃癌中的新研究进展.阐述了其与抑癌功能相关的主要结构特点,胃癌中PTEN的基因改变和蛋白异常表达情况及胃癌中PTEN基因的启动子异常甲基化情况.
-
胃癌中PTEN突变在其蛋白异常表达中的作用
背景与目的:胃癌组织中PTEN蛋白表达缺失率较高,本文旨在探讨胃癌组织中PTEN基因突变在其蛋白异常表达中的作用.方法:应用PCR-SSCP-DNA测序和免疫组织化学技术检测53例胃癌组织中PTEN基因突变及其蛋白表达水平的改变.结果:53例胃癌组织中共检测到5例PTEN基因突变,突变率仅为9.4%,低于PTEN蛋白表达缺失率(34.0%).此5例突变阳性胃癌组织中的PTEN蛋白表达情况为4例阴性、1例弱阳性.结论:基因突变是胃癌组织中PTEN蛋白异常表达的原因之一,突变以外的其他异常改变可能在这一过程中发挥了更为重要的作用.
-
PTEN抑制人脐静脉内皮细胞ECV304的增殖和VEGF的表达
目的:探讨与张力蛋白同源的10号染色体缺失的磷酸酶基因(phosphatase and tetsin hemology deleted on chromosome ten gene,PTEN)对人脐静脉内皮细胞ECV304细胞增殖、凋亡,及血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)及其受体1(VEGF receptor 1,VEGFR1)的影响.方法:将携带有野生型PTEN及绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)基因的腺病毒Ad-PTEN-GFP及空载体腺病毒Ad-GFP感染ECV304细胞,MTT实验、Hoechst3342染色法及流式细胞术检测ECV304细胞的增殖和凋亡.实时荧光定量PCR法检测Ad-PTEN -GFP感染后ECV304细胞中PTEN、VEGF和VEGFRI mRNA表达水平,ELISA检测ECV304细胞培养上清中VEGF的水平.鸡胚尿囊膜(chick chorioallantoic membrane,CAM)血管生长实验检测PTEN对鸡胚血管生长的影响.结果:与Ad-GFP相比,Ad-PTEN-GFP感染能明显抑制ECV304细胞的增殖,诱导细胞凋亡,5d时增殖抑制率可达(50.38±5.42)%、细胞凋亡率达(73.3±5.3)%.当感染复数为100时,Ad-PTENGFP组ECV304细胞的VEGF及VEGFR1 mRNA表达水平分别为未感染组的(13.40±1.32)%及(46.12±5.20)%.同时,Ad-PTEN-GFP感染能够明显抑制CAM体内血管生长[血管指数(57.6±3.37)% vs (92.2±4.37)%,P＜0.05].结论:PTEN能显著抑制人脐静脉内皮细胞ECV304的增殖、促进其凋亡,其机制可能与抑制VEGF和VEGFRI表达,抑制血管新生有关.
-
PTEN基因转染联合奥沙利对胆管癌细胞生长的影响
目的:观察脂质体介导PTEN基因转染人胆管癌细胞(QBC939),联合化疗药物奥沙利铂(L-OHP)对胆管癌细胞生长的影响,探索人类胆管癌的生物治疗方法.方法:将携带PTEN基因的真核表达载体pBP-PTEN和不含该基因的空载体转染胆管癌QBC939细胞,嘌呤霉素抗性筛选克隆、扩增培养,S-P免疫组化法检测转染前后PTEN阳性表达率.实验分组为QBC939、QBC+L-OHP、PTEN-QBC和PTEN+L-OHP 4组,以MTT法检测癌细胞生长活性,透射电镜扫描观察转染前后及联合奥沙利铂后细胞的超微结构变化,流式细胞仪分析转染前后细胞周期变化和凋亡情况,体外细胞侵袭力抑制试验观察转染及用药前后细胞侵袭力的变化.结果:PTEN基因转染后QBC939细胞稳定表达、PTEN阳性表达率升高(P＜0.05);基因转染后肿瘤细胞活性下降(P＜0.05);细胞周期G1～S期抑制、细胞凋亡率增加(P＜0.01);透射电镜下显示细胞较成熟、分化好、线粒体增多;细胞侵袭力明显抑制(P＜0.05),其中以PTEN+L-OHP抑制作用强,L-OHP抑制作用次之.结论:PTEN基因转染生物治疗联合奥沙利铂化疗对人胆管癌细胞生长具有显著的抑制作用.
-
PTEN基因第5、7、8外显子的克隆、探针制备及其在子宫内膜癌中的应用
子宫内膜癌是女性生殖系统常见的三大恶性肿瘤之一,近年来发病率明显上升.其中Ⅰ型子宫内膜癌为雌激素依赖型,占子宫内膜癌的80%以上.研究表明,PTEN基因与Ⅰ型子宫内膜癌密切相关,在所有目前已明确的子宫内膜癌相关基因中PTEN基因突变率高,其突变位点多集中在第5、7、8外显子.从遗传学角度探讨PTEN基因多态性与Ⅰ型子宫内膜癌的相关性国内外对此研究较少.因此,本研究选择PTEN第5、7、8外显子作为检测对象,应用自行制备的PTEN第5、7、8外显子特异性探针检测Ⅰ型子宫内膜癌组织中这3种外显子的基因型,研究抑癌基因PTEN多态性与Ⅰ型子宫内膜癌组织的相关性,以期为早期筛查内膜癌易感人群及为内膜癌的早诊断、早治疗及其个体化的诊治方案提供一个平台.
