首页 > 文献资料
-
重组人肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白治疗类风湿关节炎65例的疗效与安全性观察
目的 研究注射用重组人肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白依那西普(Etanercept,ETA)治疗类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)的疗效及安全性.方法 65例患者以抽签方式随机分为试验组(31例)和对照组(34例).试验组每周1次口服空白模拟甲氨蝶呤10 mg或来氟米特片20 mg/a,同时每周2次皮下注射ETA 25 mg;对照组每周1次口服甲氨蝶呤10 mg或来氟米特片20mg/d,同时每周2次皮下注射空白模拟ETA 25 mg,疗程3月.疗效评价采用美国风湿病学会(ACR)疗效评定标准.结果 试验组治疗后的类风湿因子滴度(RF)、血沉(ESR)、c反应蛋白(CRP)水平及DAS28评分明显低于对照组(P<0.05),达到ACR50及ACR70的患者试验组均明显高于对照组(P=0.02,P<0.001).两组不良反应发生率差异无统计学意义.结论 ETA用于治疗RA具有良好的安全性和显著的疗效.
-
日本血吸虫tetraspanins胞外环2编码基因的克隆和表达
目的 克隆和表达日本血吸虫(中国大陆株)tetraspanins胞外环2(EC-2)编码基因(Sj-tsp-2).方法 在日本血吸虫基因组中筛选获得与曼氏血吸虫tetraspanins基因胞外环2结构域序列同源的片段,经过一定修饰,采用全基因合成方式获得目的 基因片段,构建重组质粒pET-32a-Sj-tsp-2,并转化至BL21(DE3)感受态细胞.经IPTG诱导表达,在非变性条件下亲和纯化融合蛋白.结果 通过核苷酸测序证实重组表达质粒构建成功.SDS-PAGE结果表明,融合蛋白和目的 肽段与预计大小基本一致.Western blotting结果说明,该融合蛋白具有良好的免疫原性.结论 本实验成功表达了日本血吸虫Sj-tsp-2基因,并纯化获得其融合蛋白,为进行动物保护性实验奠定了基础.
关键词： 日本血吸虫 tetraspanins 克隆 表达 融合蛋白 -
人釉原蛋白基因在大肠杆菌中的融合表达
目的 建立人釉原蛋白(AMG)成熟肽基因在大肠杆菌中融合表达和纯化的技术路线.方法 利用已构建并经鉴定的重组质粒pGEX-4T-1/AMG转化大肠杆菌BL21,分别对诱导时间、异丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)浓度和诱导温度进行优化,在佳诱导表达条件下,分别对菌液上清、周质、胞质和包涵体中的目的 蛋白表达进行分析,在可溶性蛋白中发现大量目的 蛋白,随后利用GSTrapFF亲和层析柱进行人AMG融合蛋白的过柱纯化.结果 pGEX-4T-1/AMG重组质粒的双酶切凝胶电泳鉴定结果和测序鉴定结果和预期一致.佳诱导时间为14.5 h、佳诱导剂浓度为1.0mmol/L、佳诱导温度为20℃,在此条件下目的 蛋白的表达量达到峰值.在佳诱导条件下,胞质蛋白和包涵体中都有大量的目的 蛋白.提取大量胞质蛋白,经GSTrapFF亲和层析柱纯化,收集纯化液,进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析,显示成功纯化TAMG融合蛋白,在提取液洗涤2次后,可获得高纯度的融合蛋白.结论 利用pGEX-4T-1/AMG原核表达体系成功获得纯化的人AMG融合蛋白.
-
小鼠IL-18真核表达质粒的构建及其生物学活性的鉴定
目的构建小鼠白细胞介素18(interleukin 18,IL-18)的真核表达质粒,并检测其表达的IL-18的生物学活性.方法采用RT-PCR获得小鼠IL-18基因,通过EcoRⅠ和HindⅢ双酶切及连接反应,构建pEGFP-mIL-18真核表达载体,重组载体经过限制性内切酶、PCR及DNA序列测定等证实连接片段的正确性后,转染HEK293细胞系,荧光显微镜观察GFP-mIL-18融合蛋白的表达,收集转染后72 h的上清液,MTT法检测上清液中IL-18表达产物的生物学活性.结果酶切分析、PCR鉴定、DNA测序表明成功地构建了pEGFP-mIL-18真核表达载体, MTT法证明表达产物有刺激小鼠脾细胞增殖的功能.结论所获pEGFP-mIL-18真核表达载体能在体外表达具有生物学活性的IL-18,为进一步研究IL-18的功能和运用奠定了基础.
-
P物质融合毒素的质粒构建及其原核表达
目的 构建pET-CTR-PS重组原核表达质粒,原核表达Cholix Toxin的毒性部位和P物质的融合蛋白,为探讨该融合蛋白对肿瘤细胞的靶向杀伤作用奠定基础.方法 用PCR方法扩增Cholix Toxin的催化活性部分CTR,扩增后连入T载体构建T-CTR质粒.人工合成P物质双链寡核苷酸,将其插入pET32a中得到重组质粒pET-PS.将T-CTR和pET-PS分别经EcoRI和SacI双酶切后相接,构建得到重组质粒pET-CTR-PS.将测序正确的pET-CTR-PS重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),表达融合蛋白,用12% SDS-PAGE和Western-blot方法鉴定重组蛋白CTR-PS的表达.结果 测序表明,CTR-PS 序列与预期一致.SDS-PAGE结果表明,重组蛋白在18 ℃经0.02 mmol/L IPTG 诱导20 h后,获得高效表达,Western-blot鉴定正确.结论 本研究成功构建了pET-CT R-PS原核表达重组子,并获得了可溶性高表达.
-
人血清白蛋白与促红细胞生成素融合蛋白的构建及表达
目的 构建重组人血清白蛋白促红细胞生成素融合蛋白(HAS-EPO)表达载体,用CHO细胞表达该重组蛋白.方法 PCR扩增出人血清白蛋白基因(HAS)和促红细胞生成素基因(EPO);合成编码多肽GS (GGGGS)3的DNA片段作为接头(Linker),采用重叠PCR的方法将Linker与EPO基因拼接成LEPO基因.HAS与LEPO基因通过BamH I酶切位点相连成HAS-EPO融合基因;将该融合基因插入表达载体pCI-neo构建为表达质粒pCI-HLE.脂质体转染CHO细胞,以G418抗性筛选转染细胞.用PCR及Western blot方法鉴定被转染CHO细胞,以ELISA方法检测被转染CHO细胞表达情况.结果 酶切及测序结果证实pCI-HLE构建成功.PCR检测表明融合基因已转入CHO细胞;Western blot结果表明融合基因成功表达,并具有EPO免疫原性.ELISA测活显示融合蛋白体外活性在86～637 IU/(mL·106·72 h)之间.结论 pCI-HLE真核表达载体可以在CHO细胞中成功表达具有EPO免疫原性的HAS-EPO融合蛋白,为开发长效EPO奠定基础.
-
人肠三叶肽在大肠杆菌中的表达
目的 构建三叶肽(TFF)原核重组质粒pET32a-TFF3,实现TFF3融合蛋白在大肠杆菌中的高效表达并鉴定表达产物.方法 用Trlzol试剂提取人结肠组织mRNA,逆转录后经PCR扩增得到不含信号肽的TFF3编码序列,插入原核表达载体pET32a,构建pET32a-TFF3重组质粒,转化大肠杆菌BL-21(DE3),异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组蛋白表达,用SDS-PAGE和Western blot检测表达蛋白.结果 酶切和测序证实pET32a-TFF3重组质粒构建成功.SDS-PAGE分析表明在IPTG浓度为1 mmol/L时,诱导6 h后蛋白表达量大.Western blot分析表明,TFF3融合蛋白相对分子质量约为24×10~3,其能与兔源TFF3抗体特异性结合.结论 成功构建了pET32a-TFF3重组质粒,实现了该基因在大肠杆菌中的高效表达,为后续深入研究TFF3奠定了基础.
-
多功能转录因子CTCF重组质粒构建及其表达鉴定
目的 构建人CTCF cDNA全长及N端、Zn指、C端3个片段的原核融合表达载体,纯化融合蛋白并进行鉴定.方法 以编码CTCF全长序列的质粒为PCR模板,分别构建GST融合表达重组质粒pGEX-4T-2-CTCF,pGEX-4T-2-CTCF-N,pGEX-4T-2-CTCF-Zn,pGEX-4T-2-CTCF-C,转化大肠杆菌BL21,酶切、测序鉴定;优化IPTG诱导表达条件,并对亲和层析纯化的GST融合蛋白CTCF,CTCF-N,CTCF-Zn,CTCF进行Far-West-ern blot鉴定.结果 重组质粒经双酶切和测序鉴定证实构建成功.GST融合蛋白CTCF,CTCF-N,CTCF-Zn,CTCF-C均在大肠杆菌中成功诱导表达,融合蛋白经亲和层析纯化获得纯化蛋白.各纯化蛋白经SDS-PAGE和Far-Western blot鉴定,均为诱导表达蛋白质.结论 成功构建了GST融合表达CTCF,CTCF-N,CTCF-Zn,CTCF-C的重组质粒,对融合蛋白表达条件进行了优化.获得了高效表达的GST融合蛋白.
-
日本血吸虫tetraspanins胞外环2编码基因的克隆表达及其免疫原性的初步研究
目的 克隆和表达日本血吸虫(中国大陆株)tetraspanins胞外环2编码基因(sj-tsp-2),初步研究其免疫原性.方法 通过全基因合成方式获得目的 基因片段,构建重组质粒pET32a-sj-tsp-2,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达,在非变性条件下纯化融合蛋白.结果 通过核苷酸测序证实重组表达质粒构建成功.SDS-PAGE结果表明,融合蛋白和目的 肽段与预计大小基本一致.Western Blotting和ELISA结果说明,该融合蛋白具有良好的免疫原性.免疫定位分析显示,Sj-TSP-2主要在日本血吸虫体被表达.结论 本实验成功克隆和表达了日本血吸虫Sj-tsp-2基因,并纯化获得其融合蛋白,为进行动物保护性实验莫定了基础.
关键词： 日本血吸虫 tetraspanins 克隆 融合蛋白 免疫原性 -
小鼠Rnf141多克隆抗体的制备及鉴定
目的 获得小鼠Rnf141多克隆抗体,并对其功能进行初步研究.方法 利用多聚酶链反应(PCR)扩增获得鼠Rnf141基因并且与原核表达载体pGEX-5X-3(含GST标签)进行重组,将重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3),经1 mmol/L IPTG在25 ℃条件下诱导,用SDS-PAGE检测,获得GST-Rnf141融合蛋白高效表达后,通过Glutathione Sephorase 4B纯化.纯化的融合蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,通过Western blot和免疫组织化学的方法检测抗体的特异性.结果 成功构建了重组质粒pGEX-Rnf141,该质粒能在大肠杆菌BL21(DE3)中表达融合蛋白GST-Rnf141,融合蛋白表达量约占细菌总蛋白的46%,制备的多抗效价达1∶128000,它可以与GST-Rnf141重组蛋白和小鼠不同脏器组织Rnf141蛋白发生特异的抗原抗体反应,在脾脏和脑组织中Rnf141蛋白表达量较高.结论 成功制备小鼠Rnf141多克隆抗体,该抗体为研究Rnf141的表达与功能提供了有用的工具.
-
β淀粉样肽与HbcAg/MIR融合蛋白的免疫血清在AD转基因细胞模型中的生物效应
目的 研究β淀粉样肽(Aβ)与乙肝核心抗原主要免疫优势区(HbcAg/MIR)的融合蛋白(c-Aβ-c)在BL21/pET28原核表达体系的表达并进行腹腔内注射表达的融合蛋白免疫小鼠,检测免疫血清的免疫原性以及体外的生物学效应.方法 应用分子克隆技术构建原核表达质粒pET-28a/c-Aβ-c并进行c-Aβ-c融合基因在BL21菌的IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析表达的融合蛋白,用纯化的c-Aβ-c融合蛋白腹腔注射免疫动物,ELASA检测其抗Aβ抗体效价,MTT法和流式细胞术检测它应用于Alzheimer's disease(AD)转基因细胞的生物效应.结果 表达的c-Aβ-c融合蛋白主要以包涵体形式存在于细菌的沉淀中,表达水平占细菌总蛋白量的30%以上.免疫小鼠血清中抗Aβ抗体效价达1∶16000,抗血清抑制了AD转基因细胞中Aβ的神经细胞毒性,明显降低了细胞凋亡的比率.结论 c-Aβ-c融合蛋白具有良好的Aβ免疫原性,其动物免疫血清有效抑制Aβ肽的细胞毒性.
-
人皮肤组织桥粒芯糖蛋白4片段的克隆和在寻常型天疱疮中免疫识别的初步研究
目的 扩增人皮肤组织桥粒芯糖蛋白4(desmoglein 4,Dsg4)胞外区域EC1、EC2、EC3和EC4的核酸序列,为寻常型天疱疮(pemphigus vulgaris, PV)发病机制的研究提供依据.方法 根据GenBank中的Dsg4序列(登录号为AY177664)分析,通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法从人正常皮肤组织中抽提RNA,逆转录合成cDNA,聚合酶链反应(PCR)扩增皮肤组织桥粒芯糖蛋白4胞外区域EC1、EC2、EC3和EC4目的基因;应用基因重组技术将目的基因分别与质粒pET32a在T4 DNA连接酶作用下相连接,转化E.coli DH5α感受态细菌,用含氨苄青霉素的LB培养基平板筛选转化菌,阳性重组子DNA序列测定鉴定;重组融合蛋白经ELISA法与PV患者、正常对照组血清进行反应.结果 RT-PCR扩增产物经凝胶电泳得到均约为350 bp的4条条带;质粒载体pET32a连接的目的基因经序列测定后与在GenBank登录的Dsg4胞外区域EC1、EC2、EC3和EC4核酸序列完全一致,4个Dsg4胞外区域cDNA读码框架正确;Dsg4 EC1、EC2、EC3和EC4与患者血清反应,而不与正常对照组血清反应.结论 Dsg4胞外区域多肽片断在PV发病中可能有作用.
关键词： 桥粒芯糖蛋白4天疱疮 克隆 融合蛋白 免疫识别 -
EB病毒GST-Rta融合蛋白的表达、纯化及其多克隆抗体的制备
目的表达和纯化EB病毒的重组融合蛋白谷胱氨肽S转移酶(GST)-Rta185和GST-Rta150,并制备特异性多克隆抗体.方法质粒表达载体pGEX-R185I、pGEX-R150I和 pGEX-5X-3分别转入大肠杆菌BL21(DE3)中,异丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)诱导表达,用Glutathione Sepharose 4B 亲和层析柱纯化目的蛋白.将纯化后的GST-R185、GST-R150和GST蛋白免疫新西兰大白兔制备抗血清.结果在细菌裂解液中检测到高表达量的融合蛋白,经Glutathione Sepharose 4B亲和层析柱纯化获得较高纯度的GST-Rta融合蛋白.应用Western blot和ELISA方法检测证实,用纯化的GST-Rta蛋白免疫家兔得到了特异性的多克隆抗体.结论通过上述方法制备出来的融合蛋白纯度较高,免疫家兔获得的多克隆抗体具有良好的特异性,为研究EB病毒Rta蛋白及与EB病毒相关疾病的诊断和治疗提供了重要的条件.
-
癌症转移相关基因Syntenin1多克隆抗体的制备与鉴定
目的 获得原核表达GST-Syntenin1融合蛋白,制备高效价的抗Syntenin1多克隆抗体.方法 RT-PCR扩增Syntenin1 cDNA开放阅读框(CDS)序列,亚克隆到编码GST的pGEX-4T-2原核表达载体上,将编码Syntenin1的pGEX-4T-2-Syntenin1重组质粒化学转化BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导GST-Syntenin1融合蛋白表达,对融合蛋白亲和纯化.SDS-PAGE鉴定后,将纯化的融合蛋白辅以弗氏佐剂,免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,并用Western blot检测抗体效价及特异性.结果 成功制备GST-Syntenin1融合蛋白及多克隆抗体.Western blot结果表明Syntenin1兔多克隆抗体效价可达到1∶20 000,且与Syntenin1蛋白特异结合.结论 成功制备Syntenin1多克隆抗体,为进一步研究Syntenin1基因的功能奠定了基础.
-
水痘-带状疱疹病毒糖蛋白E的纯化及鉴定
目的纯化及鉴定重组表达的水痘-带状疱疹病毒(VZV)糖蛋白E(gE).方法用IPTG诱导重组载体pGEX-VZVgE表达融合蛋白,并用亲和层析纯化融合蛋白;然后用凝血酶酶切融合蛋白,并用免疫印迹法检测酶切产物的抗原性.结果pGEX-VZVgE的IPTG诱导表达产物用亲和层析柱去除杂蛋白后,获得相对分子质量为98×103的纯化融合蛋白,经凝血酶酶切后得到了相对分子质量大约为72×103的糖蛋白E;纯化的融合蛋白和糖蛋白E均为SDS-PAGE单点纯,并用免疫印迹证明糖蛋白E具有良好的抗原性.结论采用亲和层析柱可以有效的纯化重组VZV糖蛋白E,从而为VZV糖蛋白E的应用研究打下了基础.
-
慢性粒细胞白血病对伊马替尼的耐药机制及对策研究进展
伊马替尼(Im)以Bcr-Abl融合蛋白为靶向,选择性阻断ATP结合于激酶催化中心,抑制了ABL转移ATP上的磷酸基团及基质蛋白磷酸化酪氨酸残基,从而阻止了Ahl引起的细胞增殖和凋亡的能量信号转导.
-
Rheb1基因多克隆抗体的制备
目的:在大肠杆菌BL21中表达并纯化GST-Rheb1融合蛋白,以之免疫成年新西兰大白兔,获得Rheb1多克隆抗体.方法:运用PCR,限制性内切酶酶切及T4连接酶连接的方法,构建带有Rheb1基因的真核和原核表达载体;IPTG诱导GST融合蛋白高表达,通过皮下注射免疫新西兰大白兔,并取血清进行免疫印记分析抗体效价.结果:成功的制备了高效价的Rheb1兔多克隆抗体.结论:Rheb1多克隆抗体的成功制备,将为研究Rheb1基因的功能发挥重要的作用.
-
小鼠β防御素3在大肠杆菌中的融合表达及其抗菌作用的初步研究
目的 构建小鼠β防御素3(mouse β defensin 3,mBD3)基因的原核表达载体pET-32a(+)/mBD3,诱导mBD3融合蛋白在大肠杆菌中的表达,并融合蛋白的抗菌活性.方法 运用PCR技术从质粒pcDNA3.1(+)/mBD3中扩增mBD3基因片段,将该片段插入pET-32a(+)原核表达载体,并对构建的重组质粒进行PCR、酶切和洲序鉴定.将鉴定正确的质粒转化大肠杆菌表达菌株Rosetta-gami(2),用异丙基-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导融合蛋白的表达.采用SDS-PAGE和Western Blot鉴定融合蛋白.通过镍亲和层析获得纯化的融合蛋白,用徽量液体稀释法测定融合蛋白鼠β防御素3(fmBD3)的抗菌活性.结果 mBD3的原棱表达载体pET-32a(+)/mBD3构建成功,在大肠杆菌中表达出fmBD3并提取获得纯化的融合蛋白.fmBD3对单细胞真菌具有较好的抑制和杀灭作用,可抑制革兰阳性菌的生长,而对革兰阴性菌无作用.结论 构建的原核表达载体在大肠杆菌中成功表达fmBD3,该融合蛋白显示出较强的杀真菌作用和一定的抗细菌作用,为进一步研究鼠防御素的抗徽生物活性奠定了实验基础.
-
人乳头瘤病毒16L1-E5表达质粒的构建及其蛋白表达
目的 构建人乳头瘤病毒16L1-E5的原核表达质粒,并进行表达融合蛋白,为下一步探讨该蛋白是否能作为疫苗的研究作准备.方法 以本室已构建好的阳性质粒pET32(+)/HPV16 E5为模板,PCR获得E5基因,经SalⅠ和NotⅠ双酶切插入已构建好的pGEx4T-1/HPV16L1,通过筛选获得正确的阳性克隆pGEX4T-1/HPV16L1-E5.pGEX4T-1/HPV16L1-E5转化入BL21感受态细胞,经IPTG诱导进行目的 蛋白的表达,通过测定不同时间、不同IPTG浓度和不同温度时目的 蛋白表达情况,获得蛋白表达的佳条件,SDS-PAGE和Western blot检测蛋白表达.结果 成功构建了质粒pGEX4T-1/HPV16L1-E5,在1mmol/L IPTG、34℃、4h诱导获得大量的目的 蛋白表达.结论 成功构建的pGEX4T-1/HPV16L1-E5质粒能表达出目的 蛋白,为进一步研究目的 蛋白功能打下了坚实的基础.
-
Limk1不同突变体HA融合表达载体构建及在细胞内定位
目的:构建LIM激酶(Limk)1不同突变体的HA融合表达载体,并在真核细胞中表达,观察这些突变体在细胞内定位.方法:利用聚合酶链式反应(PCR)扩增Limk1全长序列,构建HA-Limk1真核表达质粒;利用定点突变策略对HA-Limk1进行核定位信号(NLS)缺失突变,命名为Limk1-NLS(del);用合成两条互补序列退火获得目标片段插入载体的策略构建Limk1-NLS;将2表达质粒转染HepG2细胞,细胞免疫荧光方法以及核质分离后用western-blot检测其在细胞中定位.结果:经测序鉴定Limk1及其不同突变体序列正确,在HepG2细胞中高表达;其中HA-Limk1在细胞质、细胞核均有表达,Limk1-NLS (del)主要定位于细胞质,Limk1-NLS主要定位于细胞核.结论:成功构建了Limk1全长及不同突变体的HA融合表达载体,初步明确突变体在细胞内的定位.
