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人颗粒酶B融合蛋白基因的诱导表达导致HeLa细胞凋亡
目的观察诱导表达的颗粒酶B融合蛋白对HeLa细胞形态和生长的作用. 方法用重组PCR法将活性型颗粒酶B基因序列的5'端连接绿脓杆菌外毒素(PE)的部分转位肽编码序列.所获融合蛋白基因克隆入pIND诱导表达载体后,与辅助质粒pVgRXR共转染HeLa细胞,经G418和zeocin筛选建系.间接免疫荧光检测蜕皮激素诱导后目的蛋白的表达,并通过电镜、TUNEL染色、细胞计数等方法观察细胞的形态和生长速度的变化.结果建立了可诱导表达人颗粒酶B融合蛋白基因的HeLa细胞系.蜕皮激素诱导后检测到目的蛋白的表达,同时观察到细胞出现多核巨细胞的异常形态,细胞生长受到抑制.电镜和TUNEL分析表明,颗粒酶B融合蛋白基因的诱导表达使部分细胞呈现凋亡的典型特征.结论颗粒酶B融合蛋白基因的诱导表达导致HeLa细胞凋亡.
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TGFβ1-(78-109)-HBc融合蛋白的原核表达
目的应用基因工程技术制备TGFβ1-(78-109)-HBc融合蛋白,作为TGFβ1疫苗,用于抗纤维化研究.方法合成TGFβ1-(78-109)编码区DNA,连接于质粒载体,再在其下游连接HBc编码区,测序证实后,进行原核表达,表达产物以SDS-PAGE、ELISA等方法鉴定.结果经DNA序列分析证实融合基因序列完全正确,SDS-PAGE证实原核表达产物相对分子质量为25 kD,ELISA检测证实TGFβ1-(78-109)和HBc的抗原表位均可正确暴露.结论本研究成功构建了TGFβ1-(78-109)-HBc融合基因,进行了原核表达,并初步证实了表达产物的抗原性,为下一步进行TGFβ1疫苗抗纤维化的研究打下了基础.
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人B7.2(CD86)胞外区原核表达及其工程菌发酵培养的实验研究
目的利用原核系统表达人B7.2（IgV+C）并对工程菌发酵培养条件进行优化。方法用聚合酶链反应（PCR）技术从B7.2cDNA全长中克隆B7.2（IgV+C），将PCR产物克隆入表达载体pGEX-4T-3从而得到重组体pGEX-4T-3／hB7.2（IgV+C），SDSPAGE及Westernblot用于检测目的蛋白的表达，同时对目的蛋白诱导表达时间及诱导剂浓度进行优化，对重组质粒的遗传稳定性进行鉴定。结果Westernblot结果显示相应分子质量55?kD处有hB7.2（IgV+C）与GST融合蛋白的高效表达，表达量占菌体总蛋白的30%左右。对工程菌进行发酵培养研究的结果表明，所构建的重组质粒在工程菌DH5α中传代稳定，未见质粒丢失，目的蛋白的表达不受影响，且在37℃诱导5h、IPTG终浓度为4mmol·L-1时其表达量多。结论证明了利用原核系统表达人B7.2（IgV+C）的可行性。``
关键词： B7.2(CD86) 共刺激 融合蛋白 GST -
重组人细胞角蛋白9cDNA的原核表达及纯化
目的 克隆人细胞角蛋白CK9的cDNA,通过原核表达系统表达融合蛋白并进行纯化和鉴定.方法 从人角质形成细胞系(HaCaT)中提取RNA,以RT-PCR反转录cDNA,使用特异性引物PCR扩增出人CK9编码区全长并克隆到pET-28a载体上,再用IPTG诱导融合蛋白his-CK9的表达.表达的融合蛋白通过Ni2+亲和层析纯化后,进行SDS-PAGE和Western blot鉴定.结果 测序鉴定构建表达载体中CK9的cDNA序列正确;融合蛋白his-CK9可在大肠杆菌中诱导表达;纯化的融合蛋白his-CK9纯度较高;纯化的融合蛋白his-CK9可与商品化CK9抗体特异性结合.结论 成功构建原核表达载体pET-28a-CK9,并成功诱导及纯化融合蛋白his-CK9.
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CHD4蛋白截短体融合蛋白的表达、纯化和鉴定
目的 构建CHD4/Mi-2β基因的截短体原核表达重组质粒,在大肠杆菌中诱导表达并对GST融合蛋白进行纯化和初步鉴定.方法 采用PCR方法扩增CHD4/Mi-2β的染色质调节区(CHD4-C)、解螺旋酶模序(CHD4-H)及DNA结合区(CHD4-D)基因片段,将目的基因片段插入原核表达载体pGEX-5T构建带GST标签的重组质粒,阳性克隆行DNA序列测定.IPTG诱导GST-CHD4-C、GST-CHD4-D和GST-CHD4-H原核表达,谷胱甘肽琼脂糖珠纯化融合蛋白,并对融合蛋白Western blot鉴定.结果 构建了3个CHD4/Mi-2β基因的截短体重组质粒;IPTG诱导显示,GST-CHD4-C、GST-CHD4-D和GST-CHD4-H融合蛋白主要以可溶性蛋白形式在细胞裂解液上清中表达,表达产物的相对分子质量分别为130、110、90ku.谷胱甘肽琼脂糖珠纯化融合蛋白,纯化产物的纯度高可达94.5%.Western blot证实各融合蛋白与抗GST单克隆抗体发生特异性结合反应,分子质量与估计值相符,提示为GST融合表达的CHD4/Mi-2β截短体蛋白.结论 成功纯化了较高纯度的GST-CHD4-C、GST-CHD4-D和GST-CHD4-H融合蛋白,为进一步研究CHD4蛋白在染色质重塑中的作用奠定了实验基础.
关键词： CHD4/Mi-2β pGEX-5T 融合蛋白 蛋白表达 纯化 -
G250抗原肽与HBcAg融合基因原核表达载体的构建及表达蛋白的免疫分析
目的 构建肾癌G250抗原肽与HBcAg重组基因的原核表达质粒pET28a(+)/C-G250肽-C,并通过大肠杆菌进行原核表达并纯化,分析表达融合蛋白的免疫原性及抗原性.方法 PCR扩增编码G250抗原中249～268氨基酸的基因片段,将G250肽插入去除主要免疫优势区的重组质粒pGEMEX/HBcAg中,获得重组质粒pGEMEX/C-G250肽-C,为更换酶切位点,以pGEMEX/C-G250肽-C为模板,PCR扩增C-G250肽-C基因片段,终将目的基因亚克隆入原核表达质粒pET28a(+)中,IPTG诱导融合蛋白表达,利用Ni2+-NTA亲和层析法纯化重组融合蛋白,SDS-PAGE鉴定融合蛋白的表达,纯化后融合蛋白经腹腔注射免疫BALB/c小鼠,间接ELISA法检测小鼠血清中抗体的滴度.结果 酶切及基因测序鉴定证实融合基因正确重组于表达质粒pET28a(+)中,原核表达并纯化后,该分离纯化融合蛋白纯度达95%以上,其相对分子质量约为22.35.BALB/c小鼠经4次免疫后,所有小鼠血清中均可检测到抗体,免疫第6周其血清中抗体滴度可达到1:5.12×105,抗G250肽抗体滴度达到1:6.4×104,抗HBcAg抗体滴度不超过1:4×103.结论 成功构建肾癌G250抗原肽与HBcAg重组基因原核表达质粒pET28a(+)/C-G250肽-C,在大肠杆菌中可高效表达,纯化后融合蛋白具有较强的免疫原性,能诱导小鼠产生高滴度和高特异性的抗体.
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脑源性神经营养因子融合蛋白真核表达质粒的构建及表达
目的 构建以增强型绿色荧光蛋白(EGFP)为报告基因的脑源性神经营养因子(BDNF)融合蛋白真核表达质粒,并对其表达和定位进行研究.方法 以人血白细胞DNA为模板,利用一对删除终止密码子的引物进行PCR获得BDNF基因片段,并将其与pEGFP-N1质粒载体连接,构建BDNF-EGFP融合蛋白真核表达质粒.以脂质体Lipofectamine2000 转染Hela细胞,提取总RNA,通过RT-PCR方法检测BDNF-EGFP在转录水平的表达,Western blot 及荧光显微镜进一步观察融合蛋白的表达定位.结果 酶切和PCR鉴定证实BDNF基因片段正确克隆入载体质粒中,转染Hela细胞后,RT PCR证实BDNF EGFP融合蛋白在转录水平有表达,荧光显微镜观察显示BDNF EGFP融合蛋白主要分布于细胞质中,Western blot结果显示Hela细胞培养液中有BDNF EGFP融合蛋白存在. 结论成功构建了BDNF EGFP融合蛋白真核细胞表达质粒,BDNF EGFP融合蛋白能够在Hela细胞中表达,主要位于细胞质中并可以分泌到细胞外.
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T细胞CTLA-4、TCRVβ8基因克隆、重组及表达
目的 克隆Graves'病患者甲状腺组织T淋巴细胞的CTLA-4胞外段和TCRVβ8目的 基因,重组为CTLA-4-TCRVβ8基因并表达出融合蛋白.方法 RT-PCR从Graves'病患者甲状腺组织中克隆T淋巴细胞的CTLA-4胞外段和TCRVβ8基因,依次与表达质粒进行连接,双酶切及测序鉴定获得正确的重组子;原核表达融合蛋白,SDS-PAGE及Western-Blotting检测蛋白表达情况.结果 基因克隆扩增出CTLA-4和TCRVβ8目的 基因片段,测序结果 证实序列与已发表的一致.重组基因原核表达出与预期分子质量大小相符的目的 蛋白.结论 成功构建和表达了CTLA-4-TCRVβ8基因,为探索Graves'病免疫耐受治疗提供了基因产品.
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β淀粉样肽1～42单克隆抗体的制备
目的制备稳定分泌β-淀粉样肽1～42(Aβ1-42)单克隆抗体的杂交瘤细胞,产生高效价抗体.方法通过基因工程技术,将Aβ1-42基因融合于乙肝核心抗原(HBcAg)的主要免疫优势区(MIR),制备Aβ和HBcAg的融合蛋白,免疫BALB/c小鼠,取脾细胞与SP2/0细胞融合,筛选能稳定分泌Aβ1-42单克隆抗体的杂交瘤细胞.结果得到两株能稳定分泌Aβ1-42单克隆抗体的杂交瘤细胞,Aβ1-42单克隆抗体的Ig亚类为IgG3.结论制备得到的Aβ1-42单克隆抗体特异性强,效价高.
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融合蛋白技术的应用
融合蛋白是将两个或多个基因的编码区首尾连接,由同一调控序列控制构成的基因表达产物.融合蛋白技术因其在目的蛋白的表达、构建具有双功能的目的蛋白等研究方面有具有不可替代的作用,在医药,农业,环境等的生产、研究中有着重要的用途,在基因工程的研究中显示了广阔的前融景.
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EGF-Linker-TCSKDEL融合蛋白的构建及表达产物的纯化
目的构建EGF-Linker-TCSKDEL融合蛋白表达载体并纯化目的蛋白。方法以天花粉蛋白基因的改造产物TCSKDEL为毒素，人表皮生长因子EGFR为载体，构建重组免疫毒素EGF-Linker-TCSKDEL。PCR方法扩增EGF-Linker-TCSKDEL基因片段，插入表达载体PET28a中并诱导表达，使用Ni-NTA Agrose亲合层析纯化。结果该融合蛋白以可溶形式表达于大肠杆菌培养上清中，并获得有效纯化。结论成功构建了新型融合蛋白EGF-Linker-TCSKDEL，为其进一步的基础和临床研究奠定基础。
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噬菌体展示技术的原理及在肿瘤治疗中的应用
噬菌体展示技术初是由美国Missouri大学的Smith创建的，是一种噬菌体表面表达及筛选技术[1]。噬菌体展示技术的原理是以噬菌体为载体将外源蛋白的核酸片段克隆至噬菌体衣壳蛋白基因中，以融合蛋白的形式表达于噬菌体表面，用固定化的靶分子筛选与外源蛋白亲和的噬菌体分子,不能结合的噬菌体被洗掉，而能结合的噬菌体被保留下来并通过感染大肠杆菌得以扩增、富集和筛选[2，3]。本文将概述噬菌体展示技术的基本原理与类型及其在肿瘤治疗中的应用。
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基于融合蛋白的呼吸道合胞病毒疫苗的研究进展
呼吸道合胞病毒( respiratory syncytial virus,RSV) 是一种引起严重下呼吸道感染的病原体,易感人群为婴幼儿、老年人及免疫功能低下者.目前尚无有效的抗病毒药物和预防疫苗.RSV融合蛋白( fusion protein,F蛋白) 具有高度保守性,其诱导的抗体可同时抑制A型和B型两个亚型的RSV感染.因此,以F蛋白作为靶抗原的RSV亚单位疫苗、颗粒样疫苗和病毒载体疫苗是目前研究的主要策略.现就基于F蛋白的RSV疫苗研究进展作一综述.
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特异性抗原融合蛋白结核病疫苗研究进展
结核病是一种严重危害人类健康的重大传染病，由于BCG预防效果不佳，研制新型结核病疫苗迫在眉睫。研究开发新型结核病疫苗应根据机体抗结核杆菌感染的免疫应答特点、结合BCG的不足来开展。新型结核病疫苗主要分为三类：重组BCG或重组结核菌；重组痘病毒或重组腺病毒载体疫苗；蛋白抗原亚单位或重组融合蛋白抗原亚单位疫苗。由于蛋白亚单位疫苗可以不受机体已被分枝杆菌刺激的影响，能特异性地诱导CD4＋Th1细胞和CD8＋细胞毒性T细胞活化，并且使用安全性好，而备受研究者的青睐。目前主要是以BCG或重组BCG初次免疫，然后选择亚单位疫苗加强免疫作为结核病疫苗序贯免疫策略。然而，单个蛋白制成亚单位疫苗，其免疫效果有限，因此将多个具有保护效果的抗原或多肽表达成融合蛋白，联合适当的佐剂，制成融合蛋白亚单位疫苗。目前，已有一些融合蛋白亚单位疫苗进入临床试验阶段，更多的融合蛋白正处于研究阶段。
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新型结核杆菌抗原的免疫原性和保护效力
鉴于结核病仍然是全球人类发病和死亡的主要原因，故迫切需求一种新的疫苗。结核亚单位疫苗已经显示出在人类能诱导强有力的免疫应答，并在HIV地方流行区可作为一种BCG的替代疫苗加以使用。在这项研究中，作者研究了16种不同的新的结核分枝杆菌抗原的保护效力，作者采用肺部结核病小鼠模型进行此项研究。这些抗原被用来作为亚单位疫苗而与双十八烷基溴化铵（ DDA ）-D （＋）同海藻糖6．6 dibenenate（TDB）（DDA／TDB）佐剂配制成制剂，作为单价疫苗接种小鼠或者多价联合疫苗接种小鼠，这些抗原中有6种（ Rv1626、Rv1753、Rv1789、Rv2032、Rv2220及Rv3478）抗原同未接种的对照小鼠比较，能够降低小鼠肺部的细菌负荷。这6种抗原中有3种（ Rv1789、Rv2220和Rv3478）能够诱导具有保护水平的免疫，而这种免疫与具有高度免疫原性的抗原85 B所诱导的保护相当（相对于幼鼠在肺部产生＞0．5 log10 CFU降低）。重要的是当这3种抗原联合应用时，所产生的保护作用基本上与 BCG 所介导的保护作用相当。当或者是Rv1626或者是Rv2032与具有高度保护性的E6-85融合蛋白（抗原85 B 与ESAT-6相融合）联合应用时，观察到的保护作用与BCG疫苗诱导的在气溶胶感染后1个月和3个月的保护水平相当，并且明显地比单独给予E6-85疫苗接种于感染后3个月时的保护水平要高一些，使用多参数流式细胞仪检测，单功能性IFN-γCD4 T细胞和不同的多功能性CD4 T细胞亚类能够分泌多种细胞因子（ IFN-γ、TNF-α和／或IL-2），显示这是由3种重要的保护性抗原诱导的，并伴有脾细胞CD4 T细胞的频率要比仔鼠对照组中观察到的结果明显的高。这些具高度免疫原性的TB抗原的鉴定以及抗原联合应用将会使人们改进抗结核策略成为可能。
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重组HIV-1抗原的应用及评价
将纯化的基因重组HIV-1 P24和融合蛋白P24-gp41包被微孔板,用ELISA分别检测正常人血清和HIV-Ab国家参比品(Panel).rP24对20份HIV-Ab阳性Panel的检出率为95%(19/20),对20份HIV-Ab阳性Panel通过率为90%(18/20),P24-gp41对20份HIV-Ab阳性Panel检出率为90%(18/20),对20份HIV-Ab阴性Panel的通过率为60%(12/20);rP24和P24-gP41对正常人血清的检测结果均为阴性.结果表明研制的P24具有较高的敏感性和特异性,可作为组份抗原用于HIV抗体诊断试剂盒的生产.
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利用工程树突细胞定向的纳米颗粒增强免疫应答的简单策略
在这项研究中，作者证实了一种简单的能够增强免疫应答的策略，这种策略是使用两组分树突细胞定向抗原投递系统。一种组分是由用于树突细胞导向的双功能性融合蛋白所构成，另一组分是由生物素化的PLGA纳米颗粒（ NPs）制备而成，用来包裹抗原。由截短的与抗-DEC-205单链抗体（ scFv ）相融合的核心链霉抗生物素蛋白构成的融合蛋白与荷载卵白蛋白的生物素化的NP s相混合（这种生物素化的NPs是使用生物素-PEG （2000）-PLGA配制而成）。融合蛋白功能化NP s被用于树突细胞定向性抗原投递。在体外树突细胞摄取研究中结果表明，当与非定向的NP s进行比较时，显示出高2倍的受体介导性融合蛋白功能化 NPs 的摄取结果。用融合蛋白功能化NPs 免疫并受树突细胞成熟刺激（抗CD40单抗）的小鼠增强了卵白蛋白特异性IgG和IgG亚类应答。这些小鼠的脾细胞当在体内用卵白蛋白再行刺激时则产生了更高水平的Th1型（γ干扰素和IL-2）细胞因子应答。融合蛋白功能化树突细胞定向系统的这种令人振奋的结果支持了可以将其作为一种通用的疫苗投递系统加以应用，以期用来设计单价或多价疫苗。
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在2剂MMR疫苗接种个体中测定麻疹特异性细胞免疫持续期
测定直接针对麻疹病毒表面血凝素和融合蛋白的麻疹特异性中和抗体被认为是麻疹血清学上的金标准.作者在包含763名健康年青人的不同种族队列中于接受2剂麻腮风(MMR)疫苗后,测定其功能性麻疹特异性中和抗体水平,使用一种自动式空斑减少微量中和(PRMN)测定法进行检测.
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结核分枝杆菌ESAT-6抗原和HSP70截短后C端片段融合蛋白的克隆、表达及免疫原性研究
结核病(TB)仍是一个主要的威胁世界公共健康的问题.选定结核分枝杆菌(MTB)的免疫原,以期能有效诱导保护性免疫应答是开发研究TB疫苗的终目的.
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戊型肝炎病毒基因 ORF3编码蛋白在大肠杆菌中的表达及鉴定
实验以两种不同的表达策略构建了两个以大肠杆菌DE3为宿主的原核表达载体,由T7启动子启动外源基因的转录,在诱导剂IPTG诱导下成功地进行了戊肝病毒ORF3蛋白的原核表达.并通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、免疫印迹、竞争抑制法酶联免疫等一系列实验对两种表达产物进行了鉴定和分析.综合分析两种表达结果发现,在融合型表达中ORF3蛋白与其融合标签蛋白(谷胱甘肽S-转移酶)之间存在免疫交叉反应,而且这种融合标签蛋白在空间结构上可能对ORF3蛋白中的抗体结合位点有掩盖作用.
