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利用转录因子结合位点的基因调控区序列比较
利用DNA中转录因子结合位点分布的序列比较方法对DNA序列进行聚类,并分析基因之间的联系.运用Matlab工具结合TRANSFAC数据库中的数据,对一组基因芯片共调控基因的上游序列进行比较和聚类,获得能够反映基因关系的树状聚类结果,从中确定出具有共同功能特征的基因,揭示了在大骨节病相关的诸多基因中,基因CIDEA、CYP4V2、RHBDD3、ENC1的调控区域有共同序列特征,表达模式和调控机理为相似.这为更深层次的基因功能分析提供了依据.
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冠心病患者apoE基因调控序列-219(G/T)多态性及与血脂的关系
为了研究载脂蛋白E(apoE)基因调控序列-219(G/T)多态性与人类冠心病(CHD)及其血脂水平的关系,本文采用聚合酶链反应结合限制性片段长度多态性方法, 分析了108例健康人及86例冠心病患者的-219(G/T)基因型.PCR产物直接测序验证.我们发现冠心病组 apoE -219(T/T)基因型频率(0.651)和T等位基因频率(0.767)分别显著高于对照组(0.444, 0.653; P<0.05); 冠心病组和对照组T/T基因型者血清总胆固醇高于G/G基因型者.这一结果提示apoE 调控区基因多态性可能影响冠心病的发生.推测apoE-219(T/T)基因型是冠心病的危险因子之一.
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乙肝病毒前C基因/C启动子变异与不同症状乙型肝炎患者的相关性
乙型肝炎的病情与宿主及病毒均有关.乙型肝炎病毒(HBV)C区编码HBcAg及HBeAg,其调控序列位于前C区及C基因启动子(CP) ,HBV前C/CP区变异可以通过阻止或减少HBeAg合成和分泌来影响宿主的免疫应答.我们采用聚合酶链反应(PCR)直接测序法,测定45例慢性乙型肝炎和慢性重型乙型肝炎患者血清HBV前C/CP区核苷酸序列,以探明HBV前C/CP基因区变异的临床意义.
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基因治疗在骨科中的应用
基因治疗(gene therapy)是将某种形式的核酸转入患者体细胞内以减轻疾病的过程[1].就是把由一个或几个基因及其调控序列转移(gene transfer)到靶细胞并发挥遗传物质的作用以治疗疾病.在基因治疗中,具体实施的步骤包括:目的基因的选择、载体的选择、基因转移方法的选择及靶细胞基因位点的选择等.目前常用的基因载体包括病毒和非病毒两大类,病毒载体由于对导入基因的大小有限制,其转基因的效率虽较高,但有免疫原性,运用于人体治疗有较大的危险性;常用的病毒基因载体有RNA逆转录病毒和DNA腺病毒.非病毒转基因不存在类似病毒载体的安全性问题,尤其是目前发现的多价阳离子脂质体转染效率较高,几乎无免疫排斥、毒性低和方法简单;主要的不足是基因不能长期表达;非病毒基因载体包括脂质体-DNA复合体,DNA质粒,裸DNA和基因枪.
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寡核苷酸Dbait乏氧放射双表达对人宫颈癌细胞的乏氧放射增敏效应
基因-放疗是将放射敏感性调控序列与治疗基因和药物相耦联,在肿瘤放疗同时诱导目的基因和药物在肿瘤内高效表达,从而提高肿瘤放射敏感性,它是近年来肿瘤放疗新策略[1].早期生长反应-1(early growth response-1,Egr-1)启动子在电离辐射诱导下能增强下游基因表达,并可提高放疗效果;乏氧反应元件(hypoxia response elements,HRE)在乏氧条件下可增强下游基因表达水平.
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表观遗传学及其研究进展
DNA序列所含的信息既有RNA和蛋白质编码的信息,又有控制DNA本身调控序列的信息.但是,真核细胞还含有称之为染色质的一种复杂的核苷酸蛋白载在DNA双螺旋体上的信息.
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大鼠脑皮层细胞低氧反应候选基因的研究
机体对低氧的应激反应与适应主要是通过对有关低氧反应基因(hypoxia responsive genes,HRG)的调控实现的,HRG参与低氧的感受、低氧信号的传导及生理反应等.近年来对低氧反应基因的研究主要是关于己知基因的调控序列、调控环节及生物学功能的研究,尚未有新的、有明确生物学意义的低氧反应候选基因被发现.因此,我们采用DD-PCR技术,观察低氧大鼠脑皮层细胞在低氧时基因的差异表达,以期了解中枢神经系统在低氧过程中可能参与的相关基因.
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DNA结构多态性在法医血液遗传学中的应用
法医血液遗传学是应用分子遗传学的理论及技术研究并解决司法实践中的血液及其它组织标本的司法鉴定的一门法医学分支学科.其研究范围包括遗传物质的本质、遗传物质的传递及遗传信息的实现,所采用的技术为DNA多态性分析技术,即利用遗传标记的多态性对生物检材进行种类、种属、表型的鉴别及亲子鉴定.遗传标记的发展大致可以分为限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphisms,RFLP )、可变数目串联重复(variable number tandem repeat,VNTR)(主要指小卫星DNA),短串联重复(short tandem repeat,STR)(主要指微卫星DNA)三个阶段.过去常用的遗传标记是红细胞血型、红细胞酶型、血清蛋白型、唾液蛋白型及人类白细胞抗原系统等.
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人淋巴细胞免疫反应性生长激素基因调控序列的克隆与鉴定
目的:克隆和鉴定人淋巴细胞免疫反应性生长激素(irGH)基因调控序列的核苷酸顺序.方法:通过PCR扩增出人淋巴细胞irGH基因5′近端的调控序列,然后将其与质粒PGEM7Zf(+)连接,经转化蓝白斑筛选、酶切鉴定,获得PGEM7Zf(+)-irGH DNA (-484-+2 bp)重组质粒,进行序列测定.结果:显示irGH基因5′近端的调控序列与垂体细胞GH基因的5′近端调控序列的核苷酸顺序完全相同.结论:该结果进一步证明免疫系统与神经内分泌系统的密切关系.
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重组腺相关病毒对中枢神经系统特异性转染的基础研究
中枢神经系统(CNS)疾病的基因治疗研究中,基因转染载体的选择非常重要.在现有的病毒载体中,重组腺相关病毒(recombined adeno-associated virus,rAAV)安全性好,无致突变性和免疫原性,可以重复多次使用;同腺病毒相比,rAAV的弥散性更强;同单纯疱疹病毒相比,rAAV无神经毒性;rAAV既可转染分裂期细胞,又可转染静止期细胞,可长期稳定表达目的基因.因此,被誉为"可能成为第一个安全的基因药物载体".rAAV对CNS的特异高效转染受到rAAV的类型,转染基因的调控序列以及转染方法等因素的影响.
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HBV基因变异在HBeAg阴性慢性乙型肝炎患者中的表现
乙型肝炎(乙肝)患者的病情与宿主及病毒有关.乙型肝炎病毒(HBV)C区编码HBcAg及HBeAg,其调控序列位于前C区及C基因启动子(CP).由于HBV前C/CP区变异可以通过阻止或减少HBeAg合成和分泌来影响宿主的免疫应答,因而研究HBeAg阴性乙肝HBV基因变异及其致病相关性具有较重要的临床意义.我们收集了38例浙江省HBeAg阴性慢性乙肝和慢性重型乙肝患者血清,采用聚合酶链反应(PCR)直接测序法,测定HBV前C/CP区核苷酸序列,以了解HBeAg阴性乙肝HBV前C/CP基因区变异的临床意义.
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人甲胎蛋白基因启动子siRNA表达载体的构建及效应鉴定
目的:探索基于人甲胎蛋白基因启动子构建的siRNA表达载体介导目的基因RNA干扰的可行性,为实现肝癌细胞靶向RNAi治疗作一初步研究.方法:PCR法扩增获得人甲胎蛋白基因启动子并插入pSilencer1.0-U6中以置换其U6启动子;依据hLRH-1基因RNAi靶位点设计出siRNA模板DNA,体外合成相应寡核苷酸片段后经退火形成短双链,再克隆构建成靶向人hLRH-1基因siRNA表达载体;脂质体转染法将上述重组质粒转入HepG2细胞中,实时定量PCR法初步分析所建系统在AFP表达细胞中触发靶基因hLRH-1的RNAi效应,以及hLRH-1调控下游靶基因的表达改变.结果:获得人甲胎蛋白基因启动子驱动的siRNA表达载体pSiAFP.所建的RNAi载体系统可在表达AFP的HepG2细胞中有效诱导靶基因hLRH-1表达下调,抑制率约达85%;同时调控hLRH-1下游靶基因CyclinE 1与Oct4的表达相应下调.结论:人甲胎蛋白基因启动子驱动的siRNA表达载体可在表达AFP的HepG2细胞中有效介导靶基因的RNAi效应.
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白念珠菌CDR1基因上游调控序列与氟康唑耐药的关系初探
目的探讨白念珠菌耐药基因CDR1基因上游调控序列对氟康唑耐药的影响.方法分别抽提氟康唑耐药/敏感配对菌株DNA,通过特异性合成CDR1基因上游调控序列引物,分析该序列在氟康唑耐药/敏感配对菌株中是否存在基因突变.结果白念珠菌氟康唑耐药/敏感配对菌株中的CDR1基因上游调控序列未出现任何碱基突变和缺失.结论白念珠菌氟康唑耐药与CDR1基因上游调控序列是否突变无关.
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系统性硬化病患者外周血CD4+T细胞CD40L DNA甲基化研究
[目的]探讨系统性硬化病(SSc)患者外周血CD4+T细胞中CD40L基因调控序列的甲基化状态.[方法]密度梯度离心法分离SSc患者(女16例,男10例)和健康对照组(女15例,男10例)外周血单一核细胞,磁珠分选CD4+T细胞,提取DNA,亚硫酸氢钠处理DNA,巢式PCR扩增CD40L基因调控序列片段(包括启动子和增强子),转化进入大肠杆菌,每个样本挑取8个克隆进行测序.[结果]亚硫酸盐基因组测序结果显示,健康女性CD40L基因调控序列一半为甲基化,一半为去甲基化,女性SSc患者CD40L基因启动子和增强子区域平均甲基化水平均显著低于女性健康对照(P值均< 0.01);男性SSc患者和男性健康对照CD40L基因启动子和增强子区域几乎全部为去甲基化,两组平均甲基化水平差异无统计学意义(P值均>0.05).[结论]女性SSc患者CD4+T细胞中失活的X染色体上CD40L调控序列低甲基化,可能是导致CD40L在女性SSc患者CD4+T细胞中过度表达的原因之一.
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小鼠LRP5基因负调控区分析
为研究小鼠LRP5基因-1 229 bp~-1 034 bp之间存在的负调控区,在此区域内构建了3种荧光素酶报告基因表达载体,即pGL3-1229(-1 229 bp~-914 bp),pGL3-1130(-1 130 bp~-914 bp)及pGL3-1051(-1 051 bp~-914 bp).以PRL-TK为内参照质粒,瞬时转染COS-7,48 h后收集细胞测定荧光素酶相对表达活性.结果表明pGL3-1229质粒的相对荧光素酶活性是pGL3-1130的26%,有显著性差异.在-1 229 bp~-1 130 bp之间存在负调控元件,软件分析COUP可能是小鼠LRP5基因的负调控元件,有待进一步突变分析证实.
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大肠杆菌不同SOD调控序列红色荧光蛋白报告基因载体的构建及功能鉴定
目的 通过将大肠杆菌BL21中MnSOD、FeSOD以及Cu/ZnSOD调控序列(包括启动子,-3518~+15 bp)与红色荧光蛋白(RFP)连接,构建成含SOD调控序列的红色荧光蛋白报告基因,用以研究不同SOD启动子对RFP的调控作用.方法 采用重组PCR技术,分别构建以MnSOD、FeSOD、Cu/ZnSOD启动子驱动的RFP报告基因载体,并将构建的融合基因通过T克隆转化入大肠杆菌,通过不同浓度Cd2+作用,分别诱导RFP表达.结果 正确构建了三种SOD -RFP融合基因,重组PCR结果与测序结果完全一致;该报告基因在室温静息状态下,红色荧光有微弱表达,经Cd2+诱导后,红色荧光亮度明显增强,其中MnSOD调控序列驱动的RFP表达为明显.结论 该报告基因载体的成功构建,为研究SOD的基因表达调控机制和研制检测环境中污染物的微生物传感器提供了重要基础和工具.
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p53相关长链非编码RNA在肿瘤发生发展中作用的研究
野生型p53基因是抑癌基因,作为基因表达的一个主调控因子,p53能直接或间接调控许多蛋白编码基因和非编码RNA的表达,包括微小RNA(microRNA,miRNA)和长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA).lncRNA在调控不同细胞过程,如干细胞多能性、发育、细胞生长和凋亡以及癌症转移中发挥重要作用.许多研究表明一些lncRNA可作为癌基因或抑癌基因参与了p53肿瘤抑制调控网络途径.现对p53相关lncRNA在肿瘤发生发展中作用的研究作一论述.
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maspin基因启动区的初步鉴定
目的:研究maspin基因表达的调控机制.方法:利用PCR技术扩增maspin基因5'上游启动区860 bp(-765~+95 bp)不同的缺失片段,并将它们分别与荧光素酶(LUC)报告基因相连,构建了6种maspin-LUC报告基因表达质粒,通过转染实验检测maspin启动区不同长度片段在雄激素依赖性前列腺癌细胞(LNCaP)和雄激素非依赖性前列腺癌细胞(PC-3M)中驱动荧光素酶表达的活性.并转染雄激素表达受体(AR)到PC-3M细胞,观察雄激素及其受体对不同片段表达活性的作用.结果:maspin基因启动区(-312~247 bp)之间含有与雄激素受体相关的负性调控元件,在(+14~95 bp)之间含有一个功能性的中文(Sp1)调控元件.结论:maspin基因的表达受雄激素受体及Sp1的调节.
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SIRT1在NAD保护神经轴突作用中的表达变化
目的 探讨沉默信号调控因子(SIRT1)在烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)保护神经轴突中的作用.方法 应用长春新碱毁损法制备背根神经节轴突变性细胞模型,应用透射电镜、RT-PCR、Western blot方法,观察正常背根神经节培养组、长春新碱毁损组、NAD保护组神经轴突的生长变化、超微结构变化和SIRTI mRNA及SIRTl蛋白的表达变化.结果 NAD保护组毁损8 h后轴突远端始发生轻微肿胀,断离.透射电镜结果显示,长春新碱毁损组轴突肿胀,大量髓样小体出现,微丝微管排列紊乱,聚集,溶解,被絮状沉淀物和膜性结构所代替.NAD保护组可见较多平行排列的微丝微管,轴突肿胀较轻.RT-PCR结果显示,NAD保护组的SIRT1基因表达较毁损组上调.Western blot结果显示,损伤组可见其蛋白表达量明显降低,NAD保护组中SIRT1蛋白表达较毁损组上调.结论 sIRT1参与NAD对轴突变性的保护作用.
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人干细胞因子(SCF)5’旁侧调控序列与其全长cDNA融合克隆的构建及鉴定
目的:为研究人干细胞因子(SCF)5’旁侧1.42 kb区域内不同序列对全长cDNA在真核细胞中表达的调控作用,构建了SCF5’旁侧1.42 kb的调控序列与其1.2 kb的全长cDNA融合克隆。方法:将PCR获得的SCF5’旁侧1.42 kb的调控序列与RT-PCR获得的其1.2 kb的全长cDNA克隆入pGEM-T载体,筛选正确插入方向,利用合适的限制性内切酶从中切出三个片段依次亚克隆入pUC19克隆载体中。结果:获得了SCF5’旁侧 1.42 kb的调控序列与其1.2 kb的全长cDNA并成功地构建了它们的融合克隆。结论:T-载体在克隆添加了少量具有3’→5’外切核酸酶的PCR产物中仍然有效;在稍大片段的基因克隆操作中,利用分段亚克隆的方法,避开干扰另外的酶切位点,依次分段亚克隆更为可行。