逆转录病毒载体ex vivo途径表达TH和GDNF基因

为了通过逆转录病毒载体ex vivo途径高效表达TH和GDNF基因.本实验构建有TH和GDNF基因的重组逆转录病毒载体pLHCX/TH和pLNCX2/(DNF,分别转染包装细胞PA317和PT67中;经筛选、RT-PCR、免疫组化等鉴定得到产毒细胞PA317/TH和PT67/GDNF.培养COS 7细胞,以两种产毒细胞的上清分别感染COS-7细胞,筛选后,免疫组化、原位杂交检测基因的表达量,将基因改造的细胞移植到大鼠纹状体内,免疫组化检测体内移植的TH、GDNF基因的表达.结果表明:TH和GDNF基因可在靶细胞表达,且筛选后基因表达阳性细胞显著增加;TH阳性率达50%,GDNF阳性率达70%.在体内实验中,可以观察到这两种外源基因可同时在大鼠脑内移植区表达.以上结果提示,TH和GDNF基因改造细胞,可通过ex vivo途径在脑内移植区高效表达.这一实验结果将对Parkinson病复合性基因治疗提供依据.

艾滋病和口腔

口腔科医生需要具有以下有关艾滋病的知识和概念:1有关艾滋病的基础知识1.1艾滋病的全称为获得性免疫缺陷综合征(aquired immunodeficiency syndrom,AIDS)简称艾滋病.1.2艾滋病是艾滋病病毒感染所致艾滋病病毒的全称为人类免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus,HIV).艾滋病病毒是一种逆转录病毒,在体内的主要靶细胞是CD4淋巴细胞.随着CD4淋巴细胞的减少,人体的免疫功能将受到破坏,直至丧失.

重组酶Cre在体外对LoxP标记的基因组进行重组的初步研究

目的:研究逆转录病毒体系转导的重组酶Cre在体外对LoxP标记的基因组进行重组的能力.方法:用逆转录病毒表达Cre,体外感染条件性基因剔除(即LoxP标记的基因)小鼠来源的原代培养的牙乳头间充质细胞.从被感染的牙乳头间充质细胞中提取基因组DNA,用PCR的方法显示LoxP标记的基因组长度的变化,从而反映Cre在体外的重组能力.结果:被表达Cre的逆转录病毒感染的牙乳头间充质细胞,其标记的基因组长度发生了预期的变化,被标记的部分发生缺失.结论:用逆转录病毒体系转导重组酶Cre能够有效地对LoxP标记的基因组进行重组.为用这一方法在体外研究特异基因对细胞生物学行为的影响奠定基础.

重组酶Cre的逆转录病毒载体的构建及鉴定

目的构建表达重组酶Cre的逆转录病毒载体并进行初步的体外感染研究. 方法将Cre基因片段插入到逆转录病毒载体pMx-IRES-GFP中,转染包装细胞系获得表达Cre的病毒颗粒,体外感染NIH-3T3细胞,通过绿色荧光蛋白GFP 测定病毒滴度. 结果构建了表达Cre的逆转录病毒载体pMx-IRES-GFP-Cre. 通过包装细胞系得到的含有病毒颗粒的培养上清,这种培养上清具有体外感染细胞的能力,病毒滴度为105 cfu*mL-1. 结论用逆转录病毒体系表达重组酶Cre并能有效地进行体外感染. 为用这一方法在体外研究特异基因对细胞生物学行为的影响奠定基础.

逆转录病毒转导的重组酶Cre在体外对LoxP标记的小鼠骨髓细胞DNA重组

目的: 研究逆转录病毒体系转导的重组酶Cre在体外对LoxP标记的基因组进行重组的能力. 方法: 用逆转录病毒表达Cre,体外感染条件性基因剔除(即LoxP标记的基因)小鼠来源的原代培养的骨髓细胞. 从被感染的骨髓细胞中提取基因组DNA,利用PCR的方法显示LoxP标记的基因组长度的剪切前后改变,从而反映Cre在体外对LoxP标记的基因组的重组力. 结果: 被表达有Cre的逆转录病毒感染后的骨髓细胞,其特定的基因组长度发生了预期的变化,被标记的片段部分发生缺失. 结论: 在体外,用逆转录病毒体系转导重组酶Cre能够有效地对LoxP标记的基因组进行重组. 为用这一方法在体外研究特异基因对细胞生物学行为的影响奠定基础.

逆转录病毒转染法建立兔VX-2多药耐药株

目的: 建立VX-2多药耐药(MDR)细胞(VX-2 mdr1). 方法:利用逆转录病毒转染法将带有mdr1 cDNA全序列的逆转录病毒载体pHaMDR1转入到兔VX-2细胞中,MTT法检测细胞在不同化疗药物作用下的存活率;免疫组化检测细胞的P-糖蛋白(P-gp)表达,RT-PCR检测细胞内mdr1 mRNA的表达量. 结果:转基因的细胞对吡柔比星、秋水仙素的耐药性分别提高10和25倍,免疫组化见转基因细胞中P-gp表达增加,RT-PCR示细胞内mdr1 mRNA的表达量增加. 结论:利用逆转录病毒转染法构建了兔VX-2 MDR细胞.

白细胞介素-2基因转染人骨肉瘤细胞的体外生物学特性

目的:研究白细胞介素-2基因转染人骨肉瘤细胞体外生物学特性. 方法:应用逆转录病毒载体pDOR-neo将人的IL-2 cDNA插入人骨肉瘤细胞,经G418筛选及PCR分析获得阳性细胞,并测定其上清液中IL-2含量. 结果:PCR可从阳性细胞基因组中扩增出IL-2基因片段,并从其上清液中测得每24 h 105细胞IL-2 活性为50 U～800 U. 结论:逆转录病毒介导的IL-2 cDNA可以在人骨肉瘤细胞系中获得有效表达,且转基因后的细胞较原野生型细胞体外生物学特性有明显差别.

改良去细胞方法对猪源性逆转录病毒的影响

逆转录病毒介导CXCR4-siRNA 对前列腺癌细胞体外侵袭能力的影响

目的 设计构建趋化因子受体4(CXCR4)的RNA干扰逆转录病毒载体,探讨干扰CXCR4表达对前列腺癌细胞侵袭能力的影响.方法 用PCR扩增CXCR4特异性小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA),转入带有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)和启动子U6的Pgensil-1质粒中,再将重组基因片段导入到逆转录病毒真核表达载体PLXSN中,行限制性酶切及测序鉴定.重组逆转录病毒载体转染包装细胞PA317,获取病毒上清转染前列腺癌细胞,RT-PCR检测CXCR4 mRNA表达.Transwell小室侵袭实验检测前列腺癌细胞体外侵袭能力的变化.结果 通过酶切及测序鉴定,成功构建了PLXSN/EGFP-U6-siCXCR4.干扰质粒抑制CXCR4 mRNA的表达,与空载体组比较,PC-3m、LNCaP siRNA对CXCR4 mRNA的抑制率分别为(84.26±10.20)%和(88.17±11.23)%.Transwell侵袭实验结果显示,干扰组微膜下孔细胞数PC-3m、LNCaP分别为(14.7±3.1)和(18.9±4.2)个,空载体组分别为(46.9±5.3)和(66.7±6.0)个,两者差异显著(P＜0.05).结论 PLXSN/EGFP-U6-siCXCR4可以有效地抑制前列腺癌细胞CXCR4 mRNA的表达,干扰CXCR4可以显著抑制前列腺癌细胞体外侵袭转移能力.

大骨节病差异表达基因PAPSS2对成骨细胞矿化及碱性磷酸酶活性的影响

目的 探讨大骨节病差异表达基因PAPSS2在MC3T3-E1细胞成骨样分化过程中的表达及其对碱性磷酸酶(ALP)活性和细胞矿化的影响.方法培养MC3T3-E1细胞并诱导成骨分化,观察PAPSS2在成骨细胞分化过程中的基因及蛋白表达情况;用慢病毒介导的RNA干扰(RNAi)技术或逆转录病毒转染高表达载体,分别构建PAPSS2低表达慢病毒及逆转录病毒高表达载体包装,滴度测定,验证细胞转染效率;分别转染MC3T3-E1细胞并设空白对照组,观察PAPSS2沉默或高表达后ALP活性的变化及细胞成骨矿化的影响.结果 PAPSS2在成骨细胞分化过程中mRNA及蛋白均随着矿化过程表达增加.用慢病毒介导的RNAi技术,成功降低了MC3T3-E1成骨细胞中PAPSS2的表达,使用逆转录病毒转染高表达载体显著增加PAPSS2基因的表达.PAPSS2沉默表达时,ALP活性和细胞矿化作用显著降低,高表达后其作用相反.结论 PAPSS2可调节成骨细胞ALP活性和细胞矿化作用,其异常表达可能与大骨节病骨骼病变相关.

双靶向诱导超抗原TSST-1基因重组逆转录病毒的包装及鉴定

目的 包装出携5拷贝缺氧反应元件(5HRE)增强子和癌胚抗原启动子(CEAp)联合调控的超抗原中毒性休克综合征毒素-1 (TSST-1)基因的逆转录病毒,并建立稳定表达TSST-1的人结肠癌Lovo细胞株.方法 应用已构建好的逆转录病毒载体pLEGFP N1 5HRE-CEAp TSST-1 linker-CD80TM,与辅助质粒pMB-MLV、pMB-G共转染入293T细胞,LaSRT法检测病毒滴度.包装出的逆转录病毒感染CEA阳性的人结肠癌细胞株Lovo和CEA阴性的人宫颈癌细胞株Hela.应用RT-PCR和免疫组化方法鉴定TSST-1的表达.结果 获得重组逆转录病毒滴度约为1×106 CFU/mL.RT-PCR及免疫组化证实经病毒感染的Lovo细胞在mRNA和蛋白水平均有TSST-1表达,缺氧环境中的mRNA表达量更高,且细胞传代20次后依然有TSST-lmRNA表达；经病毒感染的Hela细胞在常氧或缺氧状态下均无TSST-1mRNA及蛋白表达.结论 包装出较高滴度重组逆转录病毒,并能靶向性在CEA阳性肿瘤内稳定表达TSST-1,为后续检验TSST-1对肿瘤的杀伤效应奠定了基础.

宿主抗病毒因子与HIV-1的相互作用

人类免疫缺陷病毒1（HIV-1）的感染会引发艾滋病。HIV-1是一种逆转录病毒，由于其具有侵染不分裂细胞的能力，在逆转录病毒的分类上属于慢病毒家族。病毒颗粒的外层是来自宿主细胞的细胞膜，上面含有病毒自身编码的膜蛋白。病毒颗粒内部由一层病毒衣壳蛋白（CA）包裹着一对基因组RNA（gRNA）。gRNA长约9.1kb，在病毒编码的逆转录酶的作用下，逆转录为基因组DNA。病毒DNA病毒编码的整合酶的作用下，整合进宿主细胞的染色质DNA中，利用宿主细胞的转录因子完成病毒 mRNA 的转录。病毒的mRNA经过可变剪切的机制，产生多种病毒蛋白。通过单剪切产生的病毒mRNA,可以翻译出病毒膜蛋白，在细胞膜上分布。由全长mRNA（gRNA）翻译出的结构蛋白Gag在细胞膜上完成多聚化，并特异性的结合gRNA，组成新的病毒颗粒。新组装的病毒颗粒通过出芽的方式，夺取含有病毒膜蛋白的细胞膜，离开细胞。HIV-1的感染会造成细胞损伤，如病毒膜蛋白与细胞的受体CD4的结合而引起的细胞凋亡、病毒蛋白Vpr对细胞周期的干扰作用[1]等。通过长期的进化，宿主细胞发展出了抑制病毒复制的机制，而HIV也进化出了拮抗或逃逸宿主细胞抑制的方法，病毒与细胞的相互作用，成为了人们研究的焦点，为人们认识病毒的复制提供了新的视野。

XMRV感染与前列腺癌

前列腺癌是男性中常见的肿瘤之一,生活方式、遗传因素、病毒感染等都与前列腺癌的的发生和发展密切相关.嗜异性鼠白血病病毒相关病毒(Xenotropic murine leukemia virus-related virus,XMRV)是Anatoly Urisman等在RNASEL基因变异的家族性前列腺癌患者组织中发现的一种新逆转录病毒.我们将围绕XMRV在不同地区的前列腺癌患者中的流行情况以及可能的原因进行论述.

逆转录病毒及对生物制品污染的安全问题

自80年代发现引起人类淋巴细胞白血病和艾滋病等疾病的病源体都属于逆转录病毒以来,大量文献对逆转录病毒及其逆转录酶的研究进行了报道.随着人们越来越重视生物制品的外来因子污染问题[1],而对于生物制品如疫苗等的生产用动物源细胞基质逆转录病毒的安全检测一直是WHO以及药品监管部门关注的重点.本文就这方面的研究进展作一综述.

逆转录病毒介导v-myc基因转染神经干细胞的实验研究

目的体外通过逆转录病毒将v-myc基因转染从胎龄10～12周人工流产胚胎脑皮层分离的神经干细胞(NSCs)后,观察其生物学特性的改变. 方法分离、鉴定孕10～12周人工流产的人胚胎脑皮层来源的NSCs,并在体外培养增殖.使用构建了v-myc基因的逆转录病毒转染NSCs后,对其进行光镜及电镜观察、生长情况的测定、染色体分析以及裸鼠移植. 结果转染v-myc基因的NSCs仍然保持着未分化状态,能够自我更新以及具有多向分化潜能,并且生长速率明显加快,分裂增殖能力明显增强.然而这种细胞的染色体存在结构异常与数目异常,将其植入裸鼠皮下短期内能形成肿瘤. 结论转染v-myc基因的NSCs具有正常NSCs的基本特性,但同时也存在染色体异常与致瘤性,目前暂不适合于移植的研究及应用.

大鼠神经干细胞的荧光标记及脑内移植

增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)是绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的人工改造型,在蓝色光(波长488 nm)激发下可以稳定地发出绿色荧光,以EGFP示踪是目前细胞生物学示踪剂研究中的一种重要手段[1].笔者分离培养了胚胎大鼠神经干细胞(neural stem cells,NSCs),以逆转录病毒介导EGFP进行标记,探索标记方法的可行性以及EGFP对NSCs正常功能有无影响.并做标记细胞脑内移植实验,探讨EGFP在NSCs脑内移植中的示踪作用.

不同转染方法对逆转录病毒转染效率影响的研究

目的 探讨不同加样方法对逆转录病毒转染软骨细胞效率的影响.方法 将构建并包装好的逆转录病毒重组基因PLNCX2-IL-1Ra-GFP分别采用以下加样转染方法进行转染并作对照研究,a)第1组:先加病毒上清,6 h后补充培养液;b)第2组:先加病毒上清,隔夜补充培养液;c)第3组:先加病毒上清,6 h后更换成培养液,隔夜培养后弃液,重复先加病毒上清,6 h后更换成培养液;d)第4组:先加病毒上清,6 h后补充培养液,隔夜培养后弃液,重复先加病毒上清,6 h后补充培养液;e)第5组:经典转染法,同时加病毒上清液和培养液.转染2 d后免疫荧光显微镜下观察荧光显色,4周稳定转染后分别检测各组细胞培养液中NO含量,并用ELISA法检测上清液中hIL-1Ra的表达情况.结果 酶切鉴定重组基因正确;免疫荧光显微镜观察可见绿色荧光显色;1～5组NO含量以第4组为高,第5组为低;ELISA检测1～5组培养液中hIL-1Ra的含量以第4组为高,第5组为低.结论 四种不同加样转染方法的转染效率均高于经典法,其中以第4组为好.

抗逆转录病毒减少HIV感染的母婴传播

1 RHL评论1.1 证据总结该评价讨论抗逆转录酶疗法降低HIV-l的母婴传播(MTCT)风险.叠氮胸苷的"长程疗法"或"短程疗法"试验5项[1-5],比较产期、产后尼维拉平治疗与产期、产后叠氮胸苷治疗疗效试验1项[6],抗逆转录酶病毒治疗基础上加产期尼维拉平治疗试验1项[7]以及比较叠氮胸苷＋3硫胞苷产期短程疗法与产期叠氮胸苷＋3硫胞苷＋母婴同治1周疗效的比较试验1项[8].

Cochrane评价:抗逆转录酶疗法降低艾滋病病毒母婴传播的危险度

1背景在母乳喂养人群中应该考虑到较长期使用尼维拉平(尤其结合早期断奶)的潜在价值,因为它能进一步降低母婴传播的危险度.现正在进行的对抗逆转录病毒联合疗法的评估具有重大意义,那些有能力开展此项治疗的国家可以立即从中受益.在那些资源贫乏的国家,仍应将可替代抗逆转录病毒联合疗法的有效、可负担、安全和可接受的其它降低母婴传播疗法的研究列入研究议程(UNAIDS/WHO).绝大多数儿童感染缘自母亲妊娠期、分娩期或生后哺乳的母婴传播.母婴传播危险度在欧洲、美国、非洲分别为15%-20%、15%-30%、25%-35%(Working Group).要降低儿童死亡率,首先要优先采取降低HIV传播危险度的干预措施.由于大部分孕期HIV感染的疾病负担落在世界上无能力承受昂贵和复杂干预措施的国家和地区,因此,要在全球范围内减少儿童HIV疾病,简单且能承受的干预措施是必需的.抗逆转录病毒疗法是旨在降低接受治疗者的HIV含量的各种药物.体内HIV的载量可通过采取血样测定病毒负荷的方法获得.病毒负荷越低,血液循环中的HIV就越少.妊娠和分娩时母亲的病毒负荷高,HIV母婴传播的危险度就增加.

EBV LMP2A逆转录病毒表达载体的构建及产毒细胞系的建立

目的 构建含EB病毒(EBV)潜伏膜蛋白基因2A(LMP2A)的逆转录病毒表达载体,筛选建立携带该基因的高滴度产毒细胞系.方法 逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增获取目的基因LMP2A,定向插入逆转录病毒表达载体pMSCVpuro,形成重组质粒pMSCVpuro-2A,脂质体法将pMSCVpuro-2A转染逆转录病毒包装细胞PT67.嘌呤霉素筛选产毒细胞克隆,扩大培养产毒细胞克隆,收获病毒进行滴度测定,RT-PCR检测产毒PT67细胞目的基因的转录表达.结果 限制性酶切、PCR及测序鉴定证实LMP2A正确插入逆转录病毒表达载体;筛选获得稳定产毒的抗性细胞克隆;收获病毒的滴度为3.2×107 CFU/L,且重组腺病毒在PT67细胞能有效转录.结论 携带LMP2A基因的重组逆转录病毒表达载体pMSCVpuro-2A构建成功,转染PT67细胞后包装出重组逆转录病毒,进而筛选获得了能转录表达LMP2A的产毒细胞系PT67-LMP2A.