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肝卵圆细胞分化过程中SDF-1/CXCR4生物轴的作用研究
目的 探讨肝卵圆细胞的激活、增殖和分化过程中基质细胞衍生因子(stromal cell-derived factor-1, SDF-1)及其受体(CXCR4)生物轴的作用机制.方法 在三个对照组(2/3肝部分切除组;2/3肝部分切除组及AMD3100预处理组、2/3部分肝切除与二乙酰氨基芴和AMD3100预处理组)的参照下,用光镜与透射电镜观察观察雄性Wistar大鼠经2/3部分肝切除+二乙酰氨基芴预处理后不同时间(术后3,5,7,10,14,21 d)肝卵圆细胞的数量、形态和分布变化,采用SP免疫组化法检测卵圆细胞CK18、CK19、AFP、CXCR4和SDF-1的表达,用RT-PCR方法测定SDF-1和CXCR4 mRNA表达水平.结果 2-AAF/PH组术后3~10 d,CK18、CK19、AFP、ADF-1和CXCR4表达阳性的细胞数量逐渐增加,CXCR4和SDF-1阳性表达见于汇管区附近肝小叶内增生的终末小胆管上皮细胞,以及与增生的胆管/终末小胆管在位置上相延续且形态相类似的卵圆细胞;术后10~14 d,CK18、CK19、AFP、ADF-1和CXCR4阳性细胞数达到高值;之后,开始下降,至21 d则下降至低水平.自术后3 d起,SDF-1和CXCR4 mRNA表达水平同步升高,10 d升高至峰值,较术后3,5,7 d差异均有统计学意义(P均<0.01),之后开始下降,至21 d则下降到低水平.结论 SDF-1/CXCR4生物轴可能有刺激肝干细胞的活化和促进肝卵圆细胞的增殖作用,趋化因子SDF-1及其受体CXCR4可能是肝卵圆细胞的重要标志物.
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苦参碱含药血清对大鼠肝干细胞的影响
目的 研究苦参碱含药血清对大鼠肝干细胞系WBF-344细胞的增殖及AFP、Notch1蛋白和mRNA表达的影响.方法 用MTT法检测苦参碱含药血清对WBF-344细胞增殖的影响,免疫细胞化学及RT-PCR方法检测苦参碱含药血清对WBF-344细胞AFP、Notch1蛋白和mRNA表达的影响.结果 5%、10%、20%浓度的苦参碱含药血清作用于WBF-344细胞24 h、48 h、72 h均有不同程度的抑制增殖作用,且存在时间、剂量依赖性.正常培养WB-F344细胞有少量AFP、Notch1蛋白和mRNA表达,肝癌前病变模型组血清培养后AFP、Notch1蛋白和mRNA表达上调,苦参碱含药血清培养后AFP、Notch1蛋白和mRNA表达较模型组血清AFP、Notch1蛋白和mRNA表达下调. 结论肝癌前病变模型组血清可能具有诱导WBF-344细胞向肝癌细胞方向分化的作用,苦参碱含药血清可逆转此作用,以上作用与调节Notch1表达关系密切.
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肝卵圆细胞分化过程中SDF-1/CXCR4轴的作用研究进展
1956年,Faber在研究大鼠肝癌变机制时首次提出了肝卵圆细胞的概念(hepatic oval cell,HOC),1958年Wilson和Leduc在研究小鼠营养性肝损伤的修复机制中发现,增殖的毛细胆管(终末胆管细胞)具有干细胞特性,可分化为肝细胞和胆管细胞,于是提出肝内可能存在具有双向或多向分化潜能的肝干细胞,自此许多研究证实成年哺乳动物肝脏存在HOC.
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造血干细胞标志物CD74在大鼠肝干细胞中的表达
目的 检测与分析大鼠肝干细胞(HSC)标志物,为分离和鉴定HSC提供可能的新方法.方法 采用胶原酶灌流法与密度梯度离心法分离正常SD大鼠HSC,利用倒置相差显微镜、逆转录PCR和免疫组织化学法等技术,观察HSC标志物白蛋白、CK19、Oval-6、CD90和成熟肝细胞标志物酪氨酸氨基转移酶(TAT)及造血干细胞标志物CD45和CD74在HSC中的表达情况.结果 正常SD大鼠分离培养的HSC在倒置相差显微镜下呈卵圆形,具有较高的核浆比率.逆转录PCR分析显示,该细胞表达白蛋白、CK19、CD90和CD74基因,不表达TAT和CD45.细胞免疫组织化学法检测结果证实HSC表达Oval-6和CD74.结论 CD74有可能成为分离和鉴定HSC的新标志物之一.
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肝癌干细胞的靶向示踪及治疗
自干细胞概念引入肿瘤研究后，肿瘤干细胞（cancer stem cells，CSCs）学说开始逐渐形成。Ma等[1]报道，肝细胞型肝癌细胞株中存在功能性的肝癌干细胞（liver cancer stem cells，LCSCs）；Sell[2]用实验证实，肝干细胞在致癌基因和化学致癌剂的诱导下可以转化成癌前细胞并终形成肝癌。CSCs学说为人类认识肿瘤提供了一个崭新的视野，特异性靶向杀伤CSCs将为肿瘤治疗带来新的希望。笔者对肝癌干细胞的靶向示踪及治疗进行综述。
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肝干细胞及其调控因子的研究进展
肝干细胞具有向肝细胞和胆管细胞分化的潜能,在肝细胞移植、人工肝脏的体外构建和基因治疗方面有着巨大的潜力,笔者就肝干细胞的来源及其调控机制综述如下.
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人胎肝干细胞的分离、培养和鉴定
为探讨人胎肝中干细胞的存在并对其生物学特性进行鉴定,采用原代分离法培养人胎肝细胞集落,免疫组化鉴定细胞集落分子标志物的表达.结果:从人胎肝组织中成功分离表达甲胎蛋白(AFP)、白蛋白、波形蛋白等标志物的胎肝干细胞集落.证实人胎肝中同样存在具有干细胞特性的原始细胞.这一发现为肝干细胞的生物学特性的深入研究奠定了良好的基础.
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肝脏相关干细胞的临床应用
肝脏疾病仍是一个世界性难题,我国肝病发病率高,目前还无有效的治愈措施.现在治疗终末期肝病理想的方法是原位肝移植,而肝供体缺乏等限制了其应用.不同来源的干细胞具有自我更新、高度增殖和定向分化为肝细胞的特性,因而干细胞移植治疗可成为替代肝移植的佳治疗手段,并有效改善患者的肝脏功能和生活质量.肝脏相关干细胞移植和基因综合治疗可望治愈肝癌和遗传代谢性肝病等肝脏疾病.
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脐血间充质干细胞治疗肝衰竭的研究进展
肝干细胞按其来源可划分为肝源性干细胞和非肝源性干细胞,而非肝源性肝干细胞主要指骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、脐带间充质干细胞和脐血间充质干细胞等,脐血间充质干细胞作为非肝源性肝干细胞的一种,具有低免疫原性、来源丰富、可扩增及多向分化的特点,在诱导剂的作用下可向肝细胞分化,表达肝细胞特异性标志物及相关功能,这为移植脐血间充质干细胞治疗肝衰竭提供了实验依据.
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肝干细胞与肝癌关系的研究进展
肝干细胞是肝内具有自我更新、高度增殖和多向分化潜能的成体干细胞,与肝脏发育和再生修复密切相关.近年研究表明,肝干细胞有多种来源,与肝癌的发生密切相关,支持肝癌干细胞来源于正常肝干细胞转化的假说.肝干细胞的研究可能为肝癌靶向治疗提供新的靶点.
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中药复方调控肝干细胞分化及机制的实验研究
目的 研究中药复方牛黄、西洋参(简称牛黄参)含药血清对大鼠肝干细胞系WB-F344增殖、分化的影响,探讨益气解毒法体外诱导肝干细胞分化为肝细胞的内在机制.方法 采用中药血清药理学方法,以不同浓度的牛黄参含药血清(5%、10%、20%)作用于WB-F344,以正常大鼠血清(5%、10%、20%)处理的WB-F344为空白对照组,以单纯培养体系处理的WB-F344为正常对照组;噻唑兰(MTT)比色法检测不同浓度含药血清对WB-F344增殖的影响;取增殖的佳浓度,蛋白印迹法(western blot)检测含药血清对WB-F344细胞HGFR、EGF、EGFR、TGFβ1R、TGFβ2R表达的影响;逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测含药血清对WB-F344肝细胞表面标志物白蛋白(ALB)的mRNA表达的影响.结果 牛黄参含药血清能促进WB-F344的增殖(P ＜ 0.01),且10%为增殖的佳浓度梯度;能刺激WB-F344细胞HGFR、EGF、EGFR、TGF-β1R、TGF-β2R的表达量上调(P ＜ 0.01);能促进WB-F344肝细胞表面标志物ALB的mRNA表达(P ＜ 0.01).结论 牛黄参含药血清可以通过细胞因子体系对肝干细胞WB-F344的增殖、分化进行调节,为利用中药复方制剂调控肝干细胞,促进肝再生和肝损伤修复提供实验与理论基础.
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肝干细胞作为肝癌靶向基因治疗载体的体内实验研究
肝癌基因治疗作为现代分子药物治疗,为肝癌的治疗带来了新的前景,但目前肝癌基因治疗的研究结果尚不能令人满意,缺乏良好的基因转移载体是其重要原因[1],改进现有思路,提供一个靶向肝癌细胞的新的基因转移策略十分必要.
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肝干细胞的研究进展
肝干细胞又称肝卵圆细胞,在一定病生理条件下可向肝细胞和胆管上皮细胞、胰腺外分泌上皮等有限的几种组织细胞分化,具有多向分化增殖潜力,体外培养肝干细胞将为生物型人工肝提供一种新的细胞来源,肝干细胞移植不但可以替代坏死的肝组织,还可以刺激受体组织再生以达自身修复,治疗急性或亚急性肝坏死;同时为基因治疗提供新的可能.本文将就肝干细胞分类、表面标志、来源、诱导分离方法及人类肝干细胞的研究综述如下.
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肝干细胞移植治疗大鼠暴发性肝功能衰竭的实验研究
目的 探索肝干细胞移植对暴发性肝功能衰竭大鼠的治疗效果.方法 以二乙酰氨基芴(15mg/kg BW)联合2/3肝切除建立雄性大鼠肝干细胞增殖模型,以改进Seglen胶原酶原位灌注及Percoll密度梯度离心方法分离、纯化肝干细胞,经肝脏注射移植(4×106细胞)治疗由D-氨基半乳糖诱导的暴发性肝功能衰竭雌性大鼠,移植前及移植后24、48、72 h及1周取血测定肝功能指标如血氨、ALT、TBiL,移植后1、2、4周取受体肝脏组织应用PCR方法进行性别决定因子检测.结果 肝干细胞移植可延长暴发性肝功能衰竭大鼠的中位生存时间(P＜0.05),移植后肝干细胞移植组大鼠血清ALT、TBiL及血氨水平明显下降,其测定值各时间点组间比较,治疗组明显低于对照组(P＜0.01);肝脏病理损伤减轻,肝干细胞移植2周后雌性受体肝脏组织中性别决定因子呈阳性表达,且随时间延长而表达增强.结论 肝干细胞移植可延长暴发性肝功能衰竭大鼠中位生存时间,改善肝功能及病理指标.
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大鼠肝卵圆细胞的诱导、分离及鉴定
目的建立大鼠肝卵圆细胞的增殖模型,并探索其分离及鉴定方法.方法雄性Wistar大鼠每天1次连续灌胃给予不同剂量二乙酰氨基芴(2-AAF,5、10、15、20、25 mg/kg BW),第5天行标准的2/3肝切除术,术后按各自剂量继续给予11天,不同时间取肝脏组织,行甲胎蛋白、细胞角蛋白18及19染色并观察.以确定的2-AAF佳剂量制备大鼠肝干细胞增殖模型,Seglen胶原酶原位灌注结合Percoll密度梯度离心分离纯化大鼠肝卵圆细胞,光镜、电镜下观察细胞特点,并进行上述细胞表型标志免疫组化染色.结果2-AAF 15 mg/kg BW能建立较理想的肝卵圆细胞增殖模型.HE染色可见汇管区及中央静脉周围大量增殖的嗜碱性小细胞,电镜下观察此种细胞具有卵圆形细胞核、细胞质少而淡、核/浆比例较大等特点,免疫组化染色证实甲胎蛋白、细胞角蛋白18和19染色阳性,白蛋白及白细胞共同抗原(LCA)染色阴性.分离所得底层细胞,光镜下表现大小不等、不规则圆形细胞,体积较小,细胞核/浆比例较大,电镜下细胞表面可见少量短而小的微绒毛状突起,余同增殖细胞特点,免疫组化染色与增殖细胞表现相同细胞表型特点.结论本方法可成功诱导、分离、纯化大鼠肝卵圆细胞,符合肝卵圆细胞的形态特点、超微结构及细胞表型标志特点.
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人胎儿肝干细胞分离鉴定及体内移植
目的分离鉴定人胎儿肝干细胞,并观察其对急性肝损伤严重联合免疫缺陷(SCID)小鼠进行异种移植的治疗效果.方法以改进Seglen胶原酶(Ⅳ型)原位灌注结合Percoll密度梯度离心法分离纯化要求终止中期妊娠而流产的男性胎儿肝干细胞,经光镜、电镜下观察细胞特点,进行肝干细胞细胞标志SABC免疫组化染色.经肝脏直接注射移植人胎儿肝干细胞(106细胞)以治疗D-氨基半乳糖(800mg/kg)诱发的急性肝损伤雌性SCID小鼠,于移植前及移植后24、48、72 h、1周取血测定ALT、TBiL,于移植后1、2、4周取受体肝脏组织,PCR方法检测受体肝组织性别决定因子.结果人胎儿肝干细胞平均细胞产量(2.10±0.50)×107,细胞活性率为(92.30±1.23)%;光镜下呈游离状态、大小不等的单个细胞,约为正常肝细胞1/5～1/3大小;电镜下细胞表面可见少量短而小的微绒毛状突起,卵圆形细胞核,核/浆比例较大等特点;甲胎蛋白、细胞角蛋白8、19及α-1-抗胰蛋白酶免疫组化染色呈阳性,白蛋白及白细胞共同抗原染色呈阴性表现,培养3周可形成克隆样结构.人胎儿肝干细胞移植组急性肝损伤SCID小鼠移植24h后血清ALT、TBiL水平降低,各时间点均低于对照组(P＜0.05),且肝脏病理损伤逐渐减轻;存活2周小鼠肝脏组织中PCR测定性别决定因子呈阳性表达,随时间延长表达增强.结论该方法能成功分离高产量、高活性人胎儿肝干细胞,在急性肝损伤SCID小鼠体内移植存活,并改善其肝功能、肝脏病理指标.
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肝干细胞分离培养技术的研究进展
干细胞是一种具有自我更新能力和多向分化潜能的细胞,存在于许多组织中;肝干细胞在肝脏的形成和再生中有重要作用,可以分化为肝细胞、胆管上皮细胞和胰腺上皮细胞等.随着对其特性的深入了解,它将代替肝细胞移植和肝脏移植成为治疗器官衰竭的一种重要细胞来源,在体外对肝干细胞进行分离纯化和培养扩增,将对肝的细胞移植、组织工程和基因治疗等有重要作用.
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肝卵圆细胞研究进展
1956年,Farber在研究大鼠肝细胞癌变机制时,观察到一类体积较小,核较大,呈卵圆形,胞浆少而浅染的细胞,提出卵圆细胞的名称以区别这类细胞[1].此后研究发现此类细胞可分化为肝细胞和胆管细胞,因而认为它是一种干细胞,较早的文献中也称作胆小管肝细胞(ductular hepatocyte)、新生毛细胆管(neocholangioles)、肝细胞样细胞(hepatocyto-like cell)、胆道肝细胞(biliary hepatocyte)、过渡细胞(transitional cell)等[2].就其分化能力而言,肝卵圆细胞属于二级干细胞,即前体细胞(progenitor cell).它来源于原始干细胞,又可分化为多种成熟细胞[3,4].
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胎儿肝干细胞的分离、鉴定及培养
目的:分离、鉴定人胎肝中肝干细胞并短期培养,为体外扩增及诱导分化实验提供细胞来源.方法:采用原位两步胶原酶灌注结合Percoll液密度梯度离心的方法分离、纯化胎肝中肝干细胞,用光镜、电镜观察所得细胞形态,通过免疫细胞化学染色检测细胞AFP、CK19、CD34.测量肝脏重量及获得的肝千细胞数量,计算肝干细胞产量,对肝干细胞进行短期培养.结果:两步胶原酶灌注可有效消化胎儿肝脏结缔组织,分离的肝脏细胞经不连续Percoll密度梯度离心,可得到肝干细胞,细胞活性率为(88.35±2.45)%(n=30).光镜下肝干细胞呈卵圆形,直径约为成熟肝细胞的1/3,电镜下肝干细胞直径约10μm,细胞大部分被卵圆形细胞核所占据,细胞质少,核浆比例大,内质网、线粒体、高尔基体等细胞器不发达.ABC法免疫细胞化学染色显示:胎儿肝干细胞CK19、CD34及AFP呈阳性信号.对肝干细胞进行培养,12 h后肝干细胞逐渐粘附、贴壁、铺展,呈现为圆形、椭圆形,呈上皮细胞样平铺生长.肝干细胞产量为(8.76±0.46)×105个/g(n=15).结论:两步胶原酶灌注结合不连续Percoll液密度梯度离心法可较好地分离纯化胎儿肝干细胞,所得细胞可体外培养,可做为进一步实验的材料.
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我国肝干细胞研究取得重大进展肝干细胞治疗肝脏疾病将成为可能
本刊讯(通讯员 肖鑫 王泽锋)7月18日,第二军医大学基础部细胞生物学教研室主任胡以平教授课题组,通过4年艰辛攻关,实现了小鼠成纤维细胞向肝干细胞分化的重编程,并证明了通过这种重编程方法所产生的肝干细胞,具有与活体内自然存在的肝干细胞相似的生物学特性.相关研究成果发表在今天网络在线出版的国际权威学术刊物《细胞·干细胞》上.
