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神经中间丝蛋白Nestin在胎肝中的表达
目的采用免疫组织化学方法标记不同发育时期人胚胎肝干细胞中巢蛋白(Nestin)的表达,探讨肝干细胞新的表面标志蛋白.方法取材不同发育时期胎儿肝脏,固定并制成石蜡切片,ABC法标记神经前体细胞的特异性表面标记Nestin在胎肝干细胞中的表达.结果汇管区周边界板处卵圆样干细胞表达Nestin阳性,Nestin阳性细胞呈单层紧密排列成管,呈鞘样包绕着早期汇管区,部分包绕着初级汇管区,随着次级汇管区的成熟,Nestin阳性卵圆样干细胞逐渐局限于赫令管周围;此外胚胎发育不同时期可见Nestin阳性单个核样细胞散布在肝实质内.结论肝脏内有Nestin表达阳性的干细胞存在,其功能、来源需要进一步深入研究.
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人胎肝干细胞体外分离培养及脾内移植的初步研究
目的 将人胎肝于细胞脾内移植2/3肝切除的严重联合免疫缺陷(SCID)小鼠,观察其在受体小鼠内定植、迁移及分化的可行性.方法 ①以临床上自然流产废弃的孕期16～24周健康胎肝为供体,分离纯化胎肝干细胞,并行光镜、电镜观察及免疫细胞化学和流式细胞检测鉴定.②人胎肝干细胞经脾内移植到2/3肝切除的SCID小鼠.③免疫组化检测15、30、60、90 d受体小鼠脾脏和肝脏的人Hepatocyte、α1-AT、AFP的定位和表达.PAS染色检测受体小鼠各时间点脾脏组织糖原表达.④RT-PCR检测30、60、90 d受体小鼠脾脏组织AFP和白蛋白(Alb)基因的表达.结果 ①镜下观察分离细胞体积较小、约为肝细胞的1/6～1/3,核与浆比例大,内质网、线粒体和核糖体不发达.免疫细胞化学和流式细胞检测分别显示分离的人胎肝干细胞表达AFP、Thy-1、C-kit和CD34、CK19.②各时间点免疫组化均可检测到肝干细胞移植小鼠的肝脏和脾脏组织人Hepatocyte、α1-AT和AFP阳性表达.PAS染色显示各时间点受体小鼠脾脏组织不同程度的糖原表达.③人胎肝干细胞移植后30、60、90 d受体小鼠脾脏组织表达人AFP和Alb基因.结论 人胎肝干细胞经脾内移植可在异体内存活、定植并向受体受损肝脏迁移,在受体内增殖和定向分化为肝细胞.
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化学致癌剂3'-甲基-4-DAB影响巢蛋白Nestin在SD大鼠肝卵圆细胞中的表达
目的:采用免疫组化方法标记大鼠肝卵圆细胞中巢蛋白Nesin的表达,探讨肝卵圆细胞新的表面标记蛋白.方法:用化学致癌剂3'-甲基-4-二甲基氨偶氮苯(3'-Methy-4-dimethylaminoazobenzen,3'-me-DAB)喂养SD大鼠4周,取大鼠肝脏,用免疫组化法标记神经前体细胞的特异性表面标记物巢蛋白Nestin在大鼠肝卵圆细胞中的表达.结果:汇管区靠近界板处卵圆细胞表达Nestin阳性,Nestin阳性细胞成簇状分布或呈双层排列成管状,主要集中在赫令氏管周围.并见Nestin阳性细胞向肝小叶内迁移,散在分布于肝细胞索.结论:大鼠肝内存在Nestin表达阳性的卵圆细胞,Nestin可能是肝卵圆细胞新的标记蛋白.
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肝纤维化小鼠骨髓源性肝干细胞动员及确定
目的 建立小鼠四氯化碳性及酒精性肝纤维化模型并初步探讨干细胞动员情况,确定骨髓源性肝干细胞的表面标记.方法 四氯化碳皮下注射和酒精灌胃法使小鼠形成肝纤维化,分别取其骨髓干细胞,采用流式细胞仪检测肝纤雏化模型中不同干细胞标记的细胞群体包括c-kit+Lin-,Thy1.2+Lin-,CD34+ Lin-,Sca+1 Lin-的数量变化,寻找可能的肝干细胞动员情况.结果 与对照组相比,两组纤维化模型小鼠骨髓内c-kit+Lin-细胞显著增高,其他干细胞类型细胞数量变化小.结论 c-kit+Lin-细胞的数量在肝纤维化模型小鼠中存在明显动员情况,可能参与肝脏的修复,并成为肝干细胞的标记物.
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造血干细胞在肝脏疾患中的应用前景
近年来,肝细胞移植技术有了很大的进展,但仍存在着免疫排斥,细胞移植数量受限,肝功能支持时间短等问题.肝干细胞移植有可能克服其缺陷,而肝干细胞与造血干细胞相关关系的研究更是启迪与激起人们对肝细胞移植的研究热情.研究证明,骨髓造血干细胞在一定条件下可横向分化成卵圆细胞,并能进一步分化成肝细胞和胆管上皮细胞.在动物模型中,已成功地利用骨髓造血干细胞替代肝实质细胞治疗某些肝脏疾患.
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卵圆细胞与肝细胞癌关系的研究进展
原发性肝细胞癌(hepatocellularcarcinoma,HCC)是全球五大常见癌症之一,每年约有1百万患者发病[1].我国每年有11万患者死于肝癌,占全世界肝癌死亡人数45%,其病死率仅次于胃癌、食管癌而居第三位[2].HCC的发生是一个多因素、多阶段共同积累的过程,有研究认为HCC的细胞起源是由成熟肝细胞去分化而形成,另有学者推测可能是肝干细胞在分化过程中发生分化异常导致HCC的发生.
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鼠骨髓间充质干细胞体外诱导分化肝干细胞的研究
目的:探讨体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞(rat bone marrow stromal cells,rBMSCs)定向分化为肝干细胞的可行性.方法:采用全骨髓培养法体外培养rBMSCs,设实验组及对照组,应用肝细胞生长因子(HGF)诱导分化,采用倒置相差显微镜观察细胞形态变化,免疫组化检测CK18、CK19及波形蛋白Vimentin;ELASA等方法检测甲胎蛋白,白蛋白及碱性磷酸酶.结果:rBMSCs经体外培养诱导后呈多角形、卵圆形改变,白蛋白,AFP,CK18、CK19表达阳性,碱性磷酸酶出现明显改变.结论:rBMSCs体外经HGF诱导下,具有向肝干细胞分化的能力,可成为肝组织工程主要种子细胞来源.
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骨髓源性肝干细胞研究进展
近年来,全球掀起了有关干细胞的研究热潮,而肝干细胞是引人注目的内容之一.肝干细胞的起源可能是多源性的.肝内干细胞有卵圆细胞、小肝细胞,肝外来源可以是胰腺的上皮细胞、胰岛前体细胞、胚胎干细胞,另一个重要来源是骨髓细胞.本文对骨髓源性肝干细胞研究进行综述.
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胚胎肝干细胞癌变潜能的研究
目的 研究肝干细胞癌变的可能性. 方法 取孕14d的小鼠胚胎肝细胞作为肝干细胞移植到雌性小鼠肝脏,二乙基亚硝胺诱导肝癌.6个月后取肝癌结节做连续切片,免疫组化或免疫荧光分析Y染色体性别决定区域蛋白(SRY)、 AFP、胎盘型谷胱苷肽转移酶(GST-P)或角蛋白19的表达,以研究肝癌的细胞来源和特征. 结果 6个月后诱导多发性肝癌结节.实验组17.1%的肝细胞癌结节SRY染色阳性,胆管细胞癌结节SRY染色均为阴性.肝细胞癌结节表达AFP和GST-P,而不表达角蛋白19.胆管细胞癌结节不表达AFP和GST-P,而表达角蛋白19. 结论 移植的肝干细胞转变为肝癌,并且保持了胚胎肝干细胞未成熟的特征,仍表达GST-P和AFP.提示在诱导肝癌过程中移植的肝干细胞有直接癌变形成肝细胞癌潜能.
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肝干细胞在肝脏疾病中应用的研究进展
依据肝干细胞的起源不同,可分为肝源性肝干细胞和非肝源性肝干细胞两大类,前者主要包括肝细胞、卵圆细胞及小肝细胞等,后者主要包括胚胎干细胞、骨髓干细胞等.[1].1 肝源性肝干细胞1.1 肝细胞在正常肝脏中,大部分肝细胞处于静止状态,只有1/3 000~1/2 000分化的肝细胞分裂来维持生理肝组织质量,但相关研究表明:肝脏组织被切除2/3后,剩余的肝细胞经过1～3次分裂就可以恢复足够的肝细胞数量和肝脏体积[1].这说明肝细胞具有在特定条件下的再生能力.有研究表明,在肝脏受损时或给予恰当刺激,肝细胞能被激活,通过增殖、分化、再生,以完成肝脏结构修复和功能重建.
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肝干细胞与肝病
在较长时间内,有关肝干细胞的研究主要集中在基础方面,但近年研究表明它与肝脏多种病理生理过程密切相关,并展示了良好的应用前景.现将有关研究进展综述安等.一、肝干细胞基础研究进展目前认为,肝再生通常通过处于增殖静止期的分化肝细胞进入细胞周期完成.
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化学致癌剂3'-甲基-4-DAB影响SD大鼠肝干细胞的增殖与迁移
目的 采用免疫组织化学技术标记SD大鼠肝干细胞中OV6、CD34的表达,探讨肝干细胞与造血干细胞之间的关系.方法 用化学致癌剂3'-甲基-4-二甲基氨偶氮苯(3'-methy-4-dimethylaminoazobenzen, 3'-me-DAB)喂养SD大鼠4周,取大鼠肝脏,用免疫组化法标记卵圆细胞的特异性标记物OV6与造血干细胞标记物CD34在大鼠肝干细胞中的表达.结果 汇管区靠近界板处卵圆细胞同时表达OV6与CD34,阳性细胞成簇状分布,主要集中在赫令氏管周围,并见OV6和CD34阳性细胞向肝小叶内迁移,散在分布于肝细胞索;在肝实质内还分布着大量的表达OV6与CD34阳性的单核样干细胞;在肝实质内还可见多个CD34阳性小集落,集落内或周围也可见少许单核样干细胞.结论 3'-me-DAB刺激大鼠肝内卵圆细胞大量增生的同时,还可刺激骨髓造血干细胞增生并向肝内迁移与分化.
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一种改进的大鼠胎肝干细胞分离纯化方法
目的 改进大鼠胎肝干细胞的分离纯化方法,提高肝脏干细胞分离的纯度和活力.方法 采用剪碎酶消化法分离大鼠胎肝干细胞,差速离心结合选择性消化法进行进一步纯化,含10％优等胎牛血清的DMEM/F12培养液培养.利用免疫细胞化学方法分别检测P1和P10代肝干细胞表面标志物.结果 分离的大鼠胎肝干细胞接种培养瓶24h后开始贴壁,5d后细胞体积增大,呈梭形或多边形.经1～2次差异性肖化传代后,细胞呈集落样生长,边缘清晰且折光率强.免疫细胞化学检测示:P1代大鼠胎肝干细胞C-Kit、甲胎蛋白(AFP)抗原、OV6、细胞角蛋白(CK) 19呈阳性表达,不表达Alb.P10代肝干细胞C-Kit、CK19、OV-6及CD34呈阳性表达.结论 大鼠胎肝干细胞分离纯化、培养扩增及鉴定方法简单易行.
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原发性肝癌不同病理组织类型中肝干细胞的起源分析
目的观察原发性肝癌不同病理组织类型中肝干细胞的活化、分布、来源和免疫表达特征.方法应用HE染色、免疫组化S-P方法观察94例肝细胞癌(HCC)和12例肝内胆管细胞癌(ICC)和10例混合型肝癌的肝干细胞情况,用5例肝硬化和4例正常肝组织为对照.结果在原发性肝癌不同病理组织类型中干细胞免疫标志均有不同程度的表达,均可观察到肝于细胞向肝癌细胞的转化,以混合型肝细胞癌中肝于细胞免疫表型表达率高(P＜0.05).结论不同病理组织类型的肝癌组织中均存在不同分化状态和不同来源的肝干细胞,可能由于肝干细胞(hepatic stem cell,HSC)分化不全或分化异常所致.
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肝干细胞增殖分化相关信号通路研究进展
重症肝炎或终末期肝病时肝脏组织严重损伤,肝移植不能满足众多患者的需求.目前,应用肝干细胞诱导分化技术可作为肝脏组织严重损伤时细胞替代治疗的重要途径,调控肝干细胞增殖与分化的信号通道涉及Wnt、Notch、Hedgehog、BMP/TGF-β、PI3K/AKT等,本文对近十年来调控肝干细胞向成熟肝细胞分化的信号通路进行综述.
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胚胎肝细胞提取液体外诱导骨髓干细胞向肝系细胞分化的实验研究
目的 探讨胚胎肝细胞提取液体外诱导骨髓干细胞向肝系细胞分化的可行性.方法 通过密度梯度分离法分离出骨髓中单个核细胞,进行体外培养和鉴定.在BMSCs传代培养7d后,把培养细胞分为诱导组和非诱导组；诱导组加入胚胎肝细胞提取液的培养体系,非诱导组加入不含胚胎肝细胞提取液的基础培养体系.在诱导培养d0,d 10,d 20,d30,d 40对诱导分化的细胞进行形态学观察、肝系细胞特异性标志物的鉴定.结果 ①形态学:诱导培养2周后,长梭形细胞大多数转变成圆形、卵圆形及多角形,细胞呈肝干细胞样圆形.②免疫细胞化学检测:诱导培养d 10～20细胞表达AFP、CK19逐渐增强,d 30～40逐渐减弱；诱导培养d 10～40细胞表达ALB呈上升趋势；阳性染色细胞胞浆内出现棕黄色颗粒.非诱导组细胞不表达AFP、CK19、ALB 3种蛋白,为阴性染色.③糖原染色:诱导培养的细胞d 10～40BMSCs均有糖原表达,非诱导细胞未见糖原表达(P＜0.05).结论 胚胎肝细胞提取液在体外可以诱导骨髓干细胞向肝系细胞分化,并分化为具有合成、代谢、分泌及储存功能的肝系细胞.
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肝干细胞微环境在肝再生中的介导作用
肝干细胞(hepatic stem cells,HSCs)既可分化成多种细胞又可维持自我更新,在肝脏的发育,再生,纤维化及癌变过程中起重要作用.近年来,随着对肝干细胞研究的深入,终末期肝病实现肝移植及再造肝成为可能,而干细胞微环境在肝再生及再造肝等过程中起重要作用,本文就干细胞微环境对肝再生的介导作用作一综述.
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肝干细胞移植的研究进展及其应用前景
近年来,各类肝脏疾病严重威胁着人的生命安全,而原位肝移植由于存在着供体短缺,免疫排斥,费用昂贵等问题,使其广泛应用受到限制.大量的动物实验和临床研究发现肝干细胞具有增殖分化为肝细胞的潜能.因此,肝干细胞移植为各类肝病的治疗带来了新的曙光,给患者带来了新的希望,但仍具有一定的缺陷.本文就肝干细胞的来源,分类以及肝移植的相关技术做一综述.
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第3～5周人胚肝的细胞特征和生长因子及受体表达的研究
用第3～5周人胚,石蜡切片,免疫组化染色,光镜下观察人胚肝的细胞特征和HGF、IGF-I、TGFβ1等生长因子及其受体、PCNA、AFP、CK19等的表达.结果发现第3周末肝芽形成,第4周肝索开始形成,第3～4周人胚肝由同一类具有幼稚细胞形态学特征的细胞构成.这些细胞为AFP、c-Met阳性反应.第5周时肝索细胞的数量增加,开始出现PCNA的表达,仍仅为同一类细胞.第5周肝索细胞呈IGF-I、TGFβ1及其受体免疫反应阳性,HGF阴性,其周围的心肌细胞及间充质细胞为HGF阳性反应.结果提示第3～5周,组成肝芽和肝索的细胞属于肝干细胞,其形态和因子表达的差异说明肝干细胞可能处于不同的发育阶段,AFP、c-Met可以作为此阶段肝干细胞的标记物,HGF、IGF-I、TGFβ1及其受体可能参与对早期人胚肝发育的调节.
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携带IL-13基因大鼠肝干细胞系的建立
目的 构建包含IL-13基因片段的慢病毒载体,培养IL-13基因工程大鼠肝干细胞(肝卵圆细胞,HOC,WB-F344细胞),将IL-13基因重组至WB-F344细胞中,使之可分泌大鼠IL-13.方法 人工合成大鼠IL-13基因,利用pWPXL-MOD(TG-005)载体构建包含大鼠IL-13基因片段的质粒; 制备慢病毒穿梭质粒及其辅助包装元件载体质粒,四质粒载体(组成为pRsv-REV、pMDlg-pRRE、pMD2G及目的穿梭质粒)分别进行高纯度无内毒素抽提,共转染293T细胞,培养48 h后,收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液,对其浓缩后得到高滴度的慢病毒浓缩液,定量PCR检测病毒滴度.将构建好的慢病毒感染WB-F344细胞,5 d后采用real-time PCR检测WB-F344细胞中IL-13的表达水平,Western blot检测重组蛋白表达水平.结果 成功构建了IL-13过表达慢病毒载体,并获得IL-13基因工程大鼠肝干细胞; 将IL-13基因重组至WB-F344细胞基因组中,并可在细胞中进行转录,慢病毒感染WB-F344细胞存在IL-13 mRNA表达,可分泌大鼠IL-13.结论 构建的基因工程WB-F344细胞能显著分泌大鼠IL-13,感染后的WB-F344细胞的IL-13表达水平显著高于感染前,满足动物实验要求.
