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抗HIV药物进展
文章讨论了现存各种抗AIDS药物及其作用与研究进展,文末附表作了概括,为抗HIV药物研究提供参考.
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两个抗艾滋病新药Maraviroc和Raltegravir的Ⅲ期临床试验结果被公布
目前抗艾滋病药的作用机制包括抑制HIV复制所需的酶--蛋白酶和逆转录酶的抑制剂、阻止艾滋病病毒进入和感染免疫细胞的CCR5抑制剂、通过阻断病毒与宿主细胞膜的融合而阻断HIV繁殖的膜融合抑制剂,如罗氏公司的恩夫韦地(enfuvirtide,Fuzeon)以及整合酶(integrase)抑制剂.
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细胞核内尿嘧啶DNA糖苷酶(UNG2)在抗体多样性和HIV-1感染中的作用
尿嘧啶DNA糖苷酶(Uracil DNA Glycosylase,UNG 0r UDG)能切断DNA中错误插入的尿嘧啶(U)碱基与糖基之间的N-糖苷键,移去尿嘧啶,留下无碱基位点[1],该位点能被其它酶(如DNA聚合酶和DNA连接酶)识别和修复[2].因此,UNG能够减少由胞嘧啶(C)与鸟嘌呤(G)配对向腺嘌呤(A)与胸腺嘧啶(T)配对的颠换率,防止和修复DNA中的错配,是生物体减少突变的自我保护机制之一.除了作为DNA修复过程中的一个重要的修复酶外,近年来的研究发现,UNG与机体的免疫功能相关,它参与免疫分子抗体多样性的产生和细胞内天然抗病毒防御作用[3]J.另外,UNG也参与到许多病毒(例如HIV-1)的复制过程中,有效减少病毒的突变率[4]J.HIV-1感染过程实际上就是病毒与机体免疫系统互相对抗的过程,UNG在这场对抗中的作用正在逐渐引起科学家的兴趣.
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鲍曼不动杆菌耐药性与Ⅰ类整合子关系研究
目的:了解本院鲍曼不动杆菌中Ⅰ类整合子的分布与基因盒结构,并探讨整合子与鲍曼不动杆菌耐药的关系.方法:收集鲍曼不动杆菌临床株,用纸片扩散法(K-B法)测定77株鲍曼不动杆菌对18种抗生素的敏感性,采用PCR法检测鲍曼不动杆菌Ⅰ类整合酶基因(intI 1)并扩增其可变区,对PCR产物进行酶切分析,并测序分析整合子可变区携带的耐药基因盒.结果:鲍曼不动杆菌耐药现象十分严重.77株菌株中有49株含Ⅰ类整合子,阳性率63.64%,其中有45株(91.84%)整合酶阳性株扩增出可变区,共检测出4种耐药基因盒组合形式:aacA4(0.8 kb)、dfrXII-orfF-aadA2(1.8 kb)、aacA4-catB8-aadA1(2.3 kb)、aacC1-orlX-orfX-orfX'-aadA1a(3.0 kb).整合子阳性菌株与整合子阴性菌株对多种抗生素耐药性存在差异.结论:Ⅰ类整合子与鲍曼不动杆菌耐药性密切相关,在多重耐药鲍曼不动杆菌耐药机制中起重要作用.
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弗氏柠檬酸杆菌临床分离株整合子与耐药相关性的研究
目的 了解临床分离弗氏柠檬酸杆菌中整合子的分布,分析整合子与细菌耐药性的关系.方法 选取2011年7月至2013年2月非重复分离自浙江省人民医院就诊患者临床样本中的37株弗氏柠檬酸杆菌,用聚合酶链反应(PCR)检测菌株第Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ类整合子.抗生素药敏试验采用微量肉汤稀释法.结果 37株弗氏柠檬酸杆菌中,有14株(37.8％)检测到第Ⅰ类整合子,未检出第Ⅱ类和第Ⅲ类整合子.对15种常用抗生素的耐药性检测显示,第Ⅰ类整合子阳性菌株对复方磺胺甲(噁)唑及环丙沙星的耐药率高于第Ⅰ类整合子阴性菌株(P均＜0.05);对其他抗生素的耐药性,第Ⅰ类整合子阳性和阴性菌株间差异无统计学意义(P均＞0.05).结论 第Ⅰ类整合子在弗氏柠檬酸杆菌中分布普遍.第Ⅰ类整合子与复方磺胺甲(噁)唑及环丙沙星的耐药性密切相关.
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阴沟肠杆菌中acc(6')-Ib-cr基因的分布及其耐药性研究
目的:调查我院阴沟肠杆菌临床分离株acc(6')-Ib-cr基因的分布以及与耐药谱的关系,并初步探讨其在分子流行病学中的作用.方法:收集临床2011年1-9月分离的阴沟肠杆菌46株进行acc(6')-Ib-cr基因检测,并通过DNA直接测序确定；分析两种耐药基因在阴沟肠杆菌的分布及两者之间的关系.结果:根据PCR产物片段大小及测序分析,46株阴沟肠杆菌中共有aac(6')-Ib基因阳性菌株15株,阳性率为32.6％；对阳性菌株进行DNA测序、BLAST比对,其中6株为aac(6')-Ib-cr,2株为aac(6')-Ib的变异株,变异株为第119位氨基酸与第173位氨基酸的突变.其余7株均为aac(6')-Ib野生型.15株aac(6')-Ib阳性菌中12株携带有整合酶基因.结论:我院分离阴沟肠杆菌耐药严重,氟喹诺酮耐药主要通过aac(6')-Ib-cr基因介导,多伴随携带整合酶基因.
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HIV-1整合酶3′端加工抑制剂筛选方法的建立与优化
目的：建立与优化HIV-1整合酶3′端加工抑制剂筛选方法。方法利用荧光共振能量转移原理建立筛选方法,用DNaseⅠ切割底物 DNA确定底物检测波长,在该检测波长下,对缓冲液成分、底物浓度、酶浓度、金属离子浓度等影响整合酶活性的条件进行优化,并用阳性药物雷特格韦和杨梅黄素进行方法验证。结果检测波长为495 nm/525 nm,使用缓冲液1、底物浓度500 nmol·L-1,整合酶浓度1μmol· L-1,镁离子浓度20 mmol · L-1时整合酶3′端加工活性强。在此反应条件下雷特格韦和杨梅黄素能有效地抑制整合酶3′端加工活性。用所建立的方法筛选到2个有较强抑制整合酶3′端加工活性的抑制剂。结论该文成功建立并优化了HIV-1整合酶3′端加工抑制剂筛选方法。
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HIV-1整合酶142-288氨基酸蛋白的表达、纯化及抗原性鉴定
目的 构建人类免疫缺陷病毒Ⅰ型(HIV-1)整合酶(IN)142-288氨基酸蛋白的原核表达系统,对其进行表达、纯化及抗原性评价.方法 采用PER方法以野生型HIV-1 IN表达质粒为模板扩增IN142-288氨基酸cDNA片段.BamH Ⅰ与Xho Ⅰ双酶切消化后连接到表达载体pGEX一4T1中.构建pGEX-4T1-IN142-288质粒,并进行双酶切与测序鉴定.将该质粒转化大肠埃希菌BL21(DE3).经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,表达产物经液相层析纯化.将纯化后的IN142-288蛋白免疫BALB/c小鼠,对其抗原性进行评价.结果 pGEX-4T1-IN142-288质粒经过双酶切后可见清晰的载体条带和438bp插入的外源基因片段.SDS-PAGE和Western-blot方法对纯化的分析.可见一约40kDa的蛋白条带.ELISA法检测免疫小鼠的抗血清,结果显示3只小鼠均产生了较高滴度的抗体;Western-blot结果显示1号小鼠抗血清可以识别变性转移至NC膜上的野生型HIV-1 IN.结论 成功构建了pGEX-4T1-IN142-288质粒.在原核表达系统中表达的IN 142-288多肽抗原具有良好的抗原性.
关键词： 人类免疫缺陷病毒Ⅰ型 整合酶 蛋白纯化 -
鲍曼不动杆菌整合子与耐药性的相关性研究
目的 调查鲍曼不动杆菌中Ⅰ类、Ⅱ类和Ⅲ类整合子的存在情况,分析整合子与鲍曼不动杆菌耐药性的关系.方法 测定93株鲍曼不动杆菌对抗菌药物的敏感性；应用简并引物PCR方法,同时扩增整合子5’保守区的Ⅰ类、Ⅱ类和Ⅲ类整合酶基因,对阳性PCR产物用限制性内切酶HinfⅠ作限制片段长度多态性(RFLP)分析进行整合子分类.结果 22株鲍曼不动杆菌检测出Ⅰ类整合子,来检出Ⅱ类和Ⅲ类整合子.Ⅰ类整合子阳性的菌株对抗菌药物的耐药率普遍比整合子阴性的菌株高.结论 鲍曼不动杆菌临床分离株的耐药性强,细菌的多重耐药性与Ⅰ类整合子的存在相关.
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耐亚胺培南铜绿假单胞菌Ⅰ类整合子遗传标记及β-内酰胺类抗生素耐药相关基因研究
目的 了解临床分离的耐亚胺培南铜绿假单胞菌(IRPa)中Ⅰ类整合子及β-内酰胺类抗生素耐药相关基因存在状况.方法 自临床分离28株IRPa,采用聚合酶链反应及序列分析的方法检测Ⅰ类整合子遗传标记(intI1和qacE△1-sul1基因)及18种β-内酰胺类抗生素耐药相关基因.结果 28株中,intI1、qacE△1-sul1、blaTEM、blaOXA-10群和blaCARB基因阳性株数(%)分别为21株(75.0%)、24株(85.7%)、20株(71.4%)、1株(3.6%)和1株(3.6%),经序列分析分别确认为blaOXA-10(GenBank注册号:AY841859)和blaCARB-3.25株(89.3%)oprD基因缺失,blaIMP、blaVIM、blaSHV、blaPER、blaVEB、blaGES、blaMIR、blaDHA、blaSPM、blaGIM、blaOXA-1群、blaOXA-2群、blaBEL-1、blaCTX-M-1群基因均阴性.结论 临床分离的IRPa中Ⅰ类整合子携带率很高,至少存在blaTEM、blaOXA-10和blaCARB-3种β-内酰胺酶基因,oprD基因缺失突变是其对亚胺培南耐药的主要原因.
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阴沟肠杆菌Ⅰ类整合酶基因及质粒AmpC酶基因检测
目的明确我院临床分离的阴沟肠杆菌中Ⅰ类整合酶基因(int Ⅰ 1)、qacE△1-sul Ⅰ基因和质粒AmpC酶基因(AmpC MIR、AmpC DHA)存在状况.方法采用ATB药敏试验板微量肉汤法测定临床分离的20株阴沟肠杆菌对20种抗菌药物的敏感性,采用聚合酶链反应(PCR)技术检测耐药基因.结果该20株菌呈现多重耐药,对亚胺培南和美罗培南均敏感,对阿莫西林、阿莫西林/克拉维酸、头孢噻吩和头孢西丁完全耐药,头孢吡肟和复方新诺明的耐药率分别为25.0%和85.0%,对氨基糖苷类抗生素的耐药率在60.0%～90.0%之间,其余的耐药率在80.0%～95.0%之间.int Ⅰ 1、qacE△1-sul Ⅰ、MIR和DHA基因的阳性株数(%)分别为19株(95.0%)、17株(85.0%)、17株(85.0%)、1株(5.0%).结论我院临床分离的阴沟肠杆菌多重耐药严重,int Ⅰ 1、qacE△1-sulⅠ和MIR基因携带率很高.在阴沟肠杆菌中检出intⅠ 1、qacE△1-sulⅠ以及质粒型AmpC MIR基因在我国大陆均属首次报道.
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健康人大肠埃希菌中Ⅰ类整合酶基因IntI1定位分析
目的:了解健康人大肠埃希菌中I类整合子基因定位情况,探讨其在细菌耐药性获得与传递中的作用.方法:采用质粒接合实验和斑点杂交实验.结果:64.3%的整合子位于接合性质粒上,35.7%位于染色体或其他非接合性质粒中.结论:本文研究的整合子阳性菌株对耐药基因的捕获主要是通过接合性质粒介导的,造成耐药基因的水平播敞.
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菌落杂交法鉴定沙门菌第一类整合子
目的:建立一种快速而经济的鉴定细菌中整合子的新方法,分析整合子介导的细菌耐药性.方法:以第一类整合酶基因intI1为探针,采用地高辛进行标记,菌落杂交的方法来鉴定第一类整合子阳性菌株.结果:发现在23株沙门菌中,四株第一类整合子阳性菌株,与采用第一类整合酶基因intI1 PCR扩增方法所得到的结果相一致.结论:菌落杂交法可以简单快速地鉴定细菌中整合子,这对研究整合子的特性及整合子在细菌耐药性中的介导作用具有重要意义.
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HIV整合酶在大肠杆菌中的表达纯化及其应用
采用pThioHisB系统表达HIV-1整合酶P31蛋白,目的蛋白的表达量达到菌体蛋白的30%左右.通过包涵体洗涤和离子交换层析,蛋白纯度高于95%.用纯化后的P31抗原制备成条带免疫试纸条,检测HIV参考品血清时表现了很好的灵敏度和特异性.本研究为进一步开发HIV-1血清学诊断试剂盒奠定了基础.
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鲍曼不动杆菌的耐药性与Ⅰ类整盒子的相关研究
目的：了解该院鲍曼不动杆菌的流行趋势以及鲍曼不动杆菌与Ⅰ类整合子的耐药关系。方法用该院临床常用22种抗菌药物来检测临床分离的鲍曼不动杆菌的敏感性。用 PCR 检测鲍曼不动杆菌Ⅰ类整合子酶基因,再扩增部分Ⅰ类整合子酶基因的可变区,对整合子可变区进行基因测序分析。结果鲍曼不动杆菌的耐药现象十分严重,呈多重耐药性。鲍曼不动杆菌对CPZ/SB 耐药率为1.2%,对替加环素、左旋氧氟沙星、亚胺培南、比阿培南、阿米卡星等几种抗菌药物的耐药率为15.4%~69.5%,对其他抗菌药物均在71%以上。102株中有72株菌株含Ⅰ类整合子(阳性率为70.2%),Ⅰ类整合子阳性株的耐药性均高于阴性株,对Ⅰ类整合子可变区采用双酶切分析产生类似的酶切条带,说明该院鲍曼不动杆菌具有同源性。Ⅰ类整合子基因盒序列分析表明该院鲍曼不动杆菌Ⅰ类整合子携带 aacA4、catB8和 aadA13种耐药基因。结论该院2010~2013年,鲍曼不动杆菌对头孢菌素类、广谱青霉素、氨基糖苷类和氟喹诺酮类呈高度耐药及严重的多重耐药现状,说明治疗鲍曼不动杆菌所致感染的抗菌药物选择已十分有限。Ⅰ类整合子与鲍曼不动杆菌多重耐药性密切相关。
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临床大肠埃希菌第Ⅰ类整合子检测及耐药基因盒分析
目的 对来自临床腹泻患者大肠埃希菌的第Ⅰ类整合子分布及其耐药基因盒的结构特征进行分析.方法 应用聚合酶链反应(PCR)方法检测第Ⅰ类整合酶基因intⅠ阳性菌株,并对其整合的耐药基因进行测序及序列分析.结果 在40株大肠埃希菌中有28株(70%)第Ⅰ类整合酶基因阳性.耐药基因盒扩增结果,13株菌得到1 664 bp的扩增产物,10株得到1 586 bp的产物,3株得到1 009 bp的产物,2株得到1 009 bp和1 586 bp两种不同产物.序列分析结果表明,1 664 bp携带aadA5和dfr17,1 586 bp携带aadA1和dhfrⅠ,均为对氨基糖苷类抗生素壮观霉素、链霉素和磺胺类药物甲氧苄氨嘧啶产生耐药的基因盒;1 009 bp为aadA23b,为对氨基糖苷类抗生素壮观霉素、链霉素产生耐药的基因盒.结论 测出的28株第Ⅰ类整合子阳性菌株携带耐氨基糖苷类抗生素的基因,应从基因水平上对细菌耐药及其传播进行监测.
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整合子与大肠埃希菌耐药性的相关性研究
目的 调查大肠埃希菌中Ⅰ类、Ⅱ类和Ⅲ类整合子的存在情况,分析细菌携带的整合子与大肠埃希菌耐药性的关系.方法 测定87株大肠埃希菌对抗菌药物的敏感性;应用简并引物聚合酶链反应(PCR)方法,同时扩增整合子5'保守区的Ⅰ类、Ⅱ类和Ⅲ类整合酶基因,对阳性PCR产物用限制性内切酶HinfⅠ作限制片段长度多态性(RFLP)分析进行整合子分类.结果 30株大肠埃希菌检测出Ⅰ类整合子,未检出Ⅱ类和Ⅲ类整合子.Ⅰ类整合子阳性菌株对抗菌药物的耐药率普遍比整合子阴性菌株高.结论 大肠埃希菌临床分离株的耐药性强,细菌的多重耐药与Ⅰ类整合子相关.
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整合子及其研究进展
1989年Strokes和Hall首次提出整合子的概念.整合子被认为是一种天然的克隆和表达载体[1].整合子根据其含有的整合酶不同而进行分型,整合酶超家族包含了许多整合酶,它们都是用酪氨酸残基作为链交换反应的亲核攻击,有一些相似和保守的区域作为催化中心.
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HIV-1整合酶抑制剂的研究进展
HIV-1中病毒编码的酶有三种,即逆转录酶、蛋白酶和整合酶.目前,FDA已批准上市了9个逆转录酶抑制剂和6个蛋白酶抑制剂,虽然对整合酶有抑制作用的化合物很多,但到目前为止还没有一个上市.
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HIV-1整合酶酶联免疫吸附试验的建立和应用
目的:建立一种检测人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)整合酶的酶联免疫吸附试验(ELISA)方法,用于筛选HIV-1整合酶抑制剂.方法:将质粒F185K/C280SIN1-288转化到大肠杆菌中,经IPTG诱导表达,柱亲和层析纯化,获得HIV-1整合酶融合蛋白,建立酶联免疫吸附试验(ELISA)方法.与3H同位素标记方法比较,检测其生物学活性,并用ELISA方法测定了已知HIV-1整合酶抑制剂,验证方法的可靠性.结果:SDS-PAGE电泳分析显示相对分子量31000上方有HIV-1整合酶融合蛋白条带出现.
