首页 > 文献资料
-
副溶血性弧菌的免疫捕获PCR检测
目的:将免疫捕获PCR法应用于副溶血性弧菌检测.方法:将脱毒后的副溶血性弧菌作为抗原免疫家兔,得到抗血清包被PCR管,对待检的副溶血弧菌进行免疫捕获,利用捕获到的菌体作为模板进行PCR检测.结果:PCR体系对副溶血性弧菌的tlh基因扩增具有特异性;抗体对副溶血弧菌起到一定程度的富集作用,包被抗血清后使PCR扩增出来的阳性结果更为明显,而抗血清本身没有扩增出DNA条带.结论:该检测方法能够对副溶血性弧菌进行特异性的检测,同时包被抗体的捕获对提高检测灵敏度起到一定的作用.
-
一株与大肠杆菌O157单克隆抗体及H7血清交叉凝集的布氏枸橼酸杆菌
O157:H7大肠杆菌的血清学实验和针对O157:H7抗原而发展的其他检测方法,在O157:H7大肠杆菌的监测和实验室研究中,仍是判定菌种和测定菌型的主要依据.但在监测中,国内外均发现部分肠道菌与O157抗血清发生交叉凝集.我们在2000年12月根据卫生部食检所全国食品污染物监测课题的要求对福建省食品中O157:H7大肠杆菌污染情况进行调查时,从龙岩韭菜园市场采集的一份带皮生猪肉样品中分离到一株能与大肠杆菌O157单克隆抗体及H7血清交叉凝集的布氏枸橼谮酸杆菌,国内未见报道.现将结果报告如下.
-
抗人参皂苷Rg3抗血清的制备
目的:通过构建人工抗原制备抗人参皂苷Rg3的特异性抗血清.方法:采用高碘酸盐氧化法将Rg3与牛血清白蛋白(BSA)和鸡卵清蛋白(OVA)共价偶联,分别合成免疫抗原Rg3-BSA和包被抗原Rg3-OVA.用合成的Rg3-BSA免疫家兔,制得抗人参皂苷Rg3的特异性抗血清,并通过酶联免疫方法(ELISA)对抗血清进行鉴定.结果与结论:人工抗原Rg3-BSA制备成功,由其所得抗血清的效价为1:51 200,交叉反应率低于3%,具有很强的特异性.
-
溴脱氧尿嘧啶核苷抗血清的制备及测定(摘要)
溴脱氧尿嘧啶核苷(bromodeoxyuridine,BrdU)是DNA前体胸腺嘧啶核苷的类似物,可掺入S期细胞DNA,替代放射性标记物3H-TdR应用,避免放射性污染,且检测方法更简便迅速,然而BrdU为相对分子质量仅300的半抗原,制备抗原及抗体的难度较大,国内对BrdU标记的研究远远落后.作者在BrdU抗原制备的基础上,用偶联卵清蛋白的碘尿嘧啶核苷(Ova-IU)或溴尿嘧啶核苷(Ova-BrU)免疫动物,获得较高抗体滴度的抗血清,并在动物体内标记应用,为深入研究奠定基础,现总结报道.
-
一株具有痢疾志贺菌抗原与基因相关性的侵袭性大肠埃希菌O29
目的 对造成婴儿腹泻的粪便标本中所分离出的一株菌株进行鉴定.方法 使用VITEK 2和志贺菌血清以及大肠埃希菌血清对此株菌进行生化和血清学鉴定.毒力基因和药敏试验以及对菌株进行多位点序列分析找出它与大肠杆菌和志贺菌之间的基因相关性.结果 生化鉴定为大肠埃希菌,此菌对侵袭性大肠埃希菌O29以及痢疾志贺菌1型血清都凝集.检测出ipaH基因.多位点序列分析显示属于ST38这一簇.结论 此菌株是侵袭性大肠埃希菌.
-
实时荧光定量PCR检测幼儿腹泻腺病毒
腺病毒是一种双链 DNA 病毒,依据病毒株红细胞凝集能力和 DNA 的同源性,分为六种类型,即 A、B、C、D、E、F[1-3]。其中 F 型的Ad40和Ad41是引起胃肠疾病的主要腺病毒[4,5]。目前检测腺病毒的主要方法包括病毒培养和血清学检测。病毒培养存在细胞病变效应和检测时程较长,并且有的腺病毒株不能在常用培养细胞里复制[1]等问题；血清学检测存在抗血清价格昂贵、分型技术繁琐、易出现假阴性结果等弊端。
-
鹅细小病毒vp基因片段的原核表达及抗血清的制备
以鹅细小病毒(Goose parvovirus, GPV)HG5/82株基因组作为PCR反应模板,扩增vp基因3'端长864bp的基因片段,将其克隆到pMD18-T Simple克隆载体后转化入大肠杆菌TG1.筛选阳性质粒,并通过BamHⅠ和Hind Ⅲ将外源基因定向克隆到原核表达载体pET-30a,阳性重组质粒经确证性序列测定,证明外源片断插入到pET-30a的预期位置.将其转入大肠杆菌BL21,经终浓度为0.6mmol/L的IPTG诱导,SDS-PAGE表明外源基因获得表达,融合蛋白分子量约为34kDa.将诱导后的工程菌用6mol/L盐酸胍裂解,经超声处理后离心,利用镍离子亲和树脂对裂解产物的上清进行纯化.用纯化的融合蛋白免疫新西兰白兔制备兔抗该融合蛋白的抗血清.Western blotting结果表明制备的兔抗血清与该融合蛋白及亲本病毒的结构蛋白都具有反应性.结合前期工作进展对GPV VP蛋白的B细胞线性抗原表位进行定位.
-
齿兰环斑病毒的鉴定及其抗血清的制备与应用
根据病毒生物学特性、粒体形态和血清学性质等初步确定从在厦门地区种植的表现为褪绿、褐色坏死斑症状的卡特兰(Cattleya)病株上分离的一个病毒分离物为齿兰环斑病毒(Odontoglossum ringspot virus,ORSV).通过摩擦接种6科27种(或品种)指示植物,结果其中4科8种(或品种)表现症状,与烟草花叶病毒不同;理化性质试验表明稀释限点为5×10-5,致死温度为92℃～94℃,体外存活期超过3个月.提纯病毒为长约300nm,宽约18nm杆状粒体.SDS-PAGE电泳分析表明其外壳蛋白分子量约为17kDa.该分离物与ORSV抗血清具有强阳性反应、而与TMV抗血清反应微弱,认为该病毒为ORSV分离物.用纯化病毒免疫家兔,成功地制备出特异性抗血清,并通过Dot-ELISA法对厦门地区种植的兰花病株进行了检测研究.
-
烟草环斑病毒外壳蛋白基因的原核表达及抗血清的制备
烟草环斑病毒(Tobacco ringspot virus,TRSV)是我国二类进境检疫危险性有害生物,对农业生产危害较大.本研究依据TRSV外壳蛋白基因cp序列设计合成了2条引物,通过RT PCR扩增得到长约1500bp的目的片段.将目的片段与质粒pET-22b(+)连接,构建了含TRSV cp基因的融合蛋白原核表达载体pETRSV-CP.序列分析表明,TRSV-SD1的cp基因全长1548bp,编码515个氨基酸与GenBank中其它TRSV分离物cp基因相比,核苷酸及推导的氨基酸序列同源性为90.7%～94.6%.将pETRSV-CP转入大肠杆菌,诱导表达.SDS-PAGE结果显示,表达的TRSV CP融合蛋白的相对分子质量约为58kDa.以此融合蛋白制备的抗血清的效价为1/1024,抗血清与TRSV具有良好的特异性反应.
-
棉铃虫核多角体病毒泛素基因的克隆表达及抗体制备
昆虫杆状病毒和痘病毒是目前已知唯一编码泛素基因的病毒.通过PCR方法,克隆了棉铃虫核多角体病毒(HaSNPV)泛素基因(Ubiquitin,Ubi).序列分析表明,该基因编码区全长252bp,编码83个氨基酸残基,预计分子量为9.24kDa.将泛素基因克隆到原核表达载体pET-28a上,构建重组质粒pET-Ubi,转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,IPTG诱导表达融合蛋白.用His-tag抗体检测目的蛋白,Westen-blot实验证明所表达的蛋白是带有His-tag的重组融合蛋白.通过改变IPTG浓度和诱导时间对表达条件进行了优化.利用NI-琼脂糖凝胶亲和层析柱纯化目的蛋白,SDS-PAGE鉴定为单一条带,同时用提纯蛋白制备了特异性抗体,为进一步的研究打下基础.
-
紫藤脉花叶病毒cp基因在大肠杆菌中的表达及抗血清的制备
采用RT-PCR方法自紫藤脉花叶病毒北京分离物(WVMV-BJ)的基因组中分离出其CP基因,连接到原核表达载体pET22b(+)上.获得的重组子pET-WVMVCP转化大肠杆菌BL21(DE3)后,用IPTG进行诱导表达.SDS-PAGE和Western blot分析表明,cp基因在大肠杆菌中获得了高效表达,融合蛋白分子量约为34.4 kDa.将融合蛋白纯化后免疫兔子,获得了特异性较高的抗血清.微量免疫沉淀法测定该抗血清的效价为1/1024,酶联法(enzyme-linkedimmunosorbant assay,ELISA)测定的效价为1/8192.
-
水稻矮缩病毒非结构蛋白基因S6的表达和抗血清的制备
经RT-PCR扩增出水稻矮缩病毒(RDV)中国分离物非结构蛋白基因S6,并克隆至 pGEM-Teasy 载体上.序列分析表明该基因与日本株具有高度同源性,并且含有较高比例的稀有密码子.将S6基因克隆到表达载体pGEX-6P-1,并转化大肠杆菌,该基因在大肠杆菌以包涵体形式大量表达.以表达的融合蛋白作抗原免疫家兔,制备抗S6蛋白的抗血清,ELISA 测定表明,该血清与抗原共价特异性反应,抗血清的效价为1:3000. Western blot印迹实验表明该抗血清能特异性检测RDV感染的水稻组织中的S6蛋白,因而可作为感染RDV的水稻植株的分子手段.
-
马铃薯Y病毒普通系外壳蛋白基因在大肠杆菌中的表达
将马铃薯Y病毒普通系(PVY0)的外壳蛋白基因克隆到表达质粒pMAL-c2中,构建这一基因在大肠杆菌中的表达载体pMAL-c2-PVY0CP.SDS-PAGE及Western blotting检测结果表明,这一表达栽体在E.coli DH5α中经IPTG诱导可表达分子量为71.8kDa的特异性融合蛋白.以amylose resin亲合柱层析纯化这一融合蛋白为抗原,免疫家兔制备了效价为1:1024的特异性抗血清.用该抗血清可通过对流免疫电泳、免疫双扩散及Western blotting对PVY进行检测.
-
水稻矮缩病毒昆明分离物抗血清制备及免疫捕捉PCR检测
由水稻矮缩病毒(Rice dwarf viru S,RDV)引起的水稻矮缩病害,早由日本报道,随后在东南亚等国以及我国的福建、云南等南方稻区普遍发生,云南主要发生于中部及南部地区[1].水稻在苗期至分蘖期感病后,植株矮缩,分蘖增多,叶片浓绿,僵直,出现白斑,生长后期病稻不能抽穗结实,在暴发流行年份可以引起水稻的严重减产.
-
血管加压素对心功能的抑制作用及其在心外科的意义
血管加压素(vasopressin, VP)又称抗利尿激素(ADH),于1895年由Oliver和Seheafer首先发现.1951年Du Vignaud等人工合成VP肯定了其加压和抗利尿作用.近年来VP抗血清、受体拮抗剂和放免测定技术的出现,进一步明确了VP的生理范围、作用机理,对其影响心功能的作用亦进行了研究.本文就此作一综述.
-
延长大鼠异种心脏移植后存活时间的实验研究
目的 研究如何延长大鼠异种心脏移植后的存活时间.方法 实验分为A、B、C、D四组.A组:移植术前12、8、4、0 d及10、6、2、0 d分别将脾细胞1 x 108个,抗血清0.2 ml静脉注入受体大鼠;B组:在A组的基础上,加用中华眼镜蛇毒(CCV)0.2 mg·kg-1·d-1,术前3 d至术日腹腔注射.C组:在B组的基础上,加用环孢素A(CsA)10 mg·kg-1·d-1、环磷酰胺(Cy)20 mg·kg-1·d-1,术前12d开始至术日腹腔注射.D组:在C组的基础上,加用抗巨噬细胞和抗自然杀伤细胞单克隆抗体250μg穔g-1穌-1,术前12 d开始至术日腹腔注射.结果 A、B、C、D四组移植心脏分别存活(0.32±0.12)h,(25.6±9.6)h、(48.6±10.4)h和(72.4±21.7)h;术日各组IgG均下降,尤以C、D组下降明显,与A、B组比较,差异有显著性(P＜0.05).结论 术前静脉注射供体脾细胞及抗血清,尤其与CCV、CsA、Cy合用,能显著抑制IgG的产生,延长移植心脏的存活时间.
-
人生存素基因的克隆、表达与抗血清制备
目的 克隆表达重组人生存素,制备其抗血清并检测其免疫识别活性.方法 用RT-PCR方法从培养的人白血病细胞株HL-60中克隆人生存素cDNA,克隆到原核表达载体pET32a(+),重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)进行表达,目的蛋白经Ni-NTA树脂亲和纯化后免疫小鼠制备抗血清,ELISA检测抗血清的效价,Western blot和免疫细胞化学法鉴定抗血清的特异性.结果 所克隆生存素cDNA序列与Genbank中序列完全一致,将其读码框插入原核表达载体pET32a(+)诱导表达后,SDS-PAGE电泳分析证实重组蛋白为分子量约37KD的融合蛋白,表达量占总茵体的30%,纯化后融合蛋白的纯度为95%,所制备的鼠抗血清的效价达1:1 600,Westem blotting证实其有较好的特异性,可以检测肿瘤细胞生存素的表达.结论 我们已克隆并表达了人生存素基因,所制备的抗人生存素血清可用于相关肿瘤检测.
-
地高辛人工抗原的合成、鉴定与免疫效价的测定
目的:制备地高辛(digoxin,Dig)的人工抗原及抗血清.方法:采用高碘酸钠氧化法将半抗原Dig分别与牛血清白蛋白(BSA)和鸡卵清白蛋白(OVA)反应偶联,制得Dig-BSA人工抗原和Dig-OVA包被抗原后,通过紫外光谱(UV)和基质辅助激光解吸飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)鉴定该人工抗原并测定其中结合的半抗原数目；以此抗原免疫BALB/c小鼠,制备抗血清,以Dig-OVA作包被抗原,通过酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清抗体效价.结果:合成的人工抗原Dig BSA中Dig与BSA的结合比约为5:1；免疫小鼠得到特异针对Dig的抗血清,Dig抗体的效价达到了1:62 500.结论:成功地合成了Dig人工抗原,且该抗原免疫原性良好.
-
HPV L1 C-末端保守序列多肽抗血清对临床标本中不同型别HPV的检测
目的 测试自行制备的HPV L1 C-末端保守序列多肽抗血清对外阴及宫颈病变标本中人乳头瘤病毒(HPV)的检出能力.方法 收集女性外阴及宫颈病变标本,以MY09/11为通用引物行HPV通用PCR检测,在此基础上以GP5+/6+为内引物行HPV的巢式PCR检测.PCR扩增产物用微孔板杂交法确定HPV型别.标本同时用多肽抗血清行ELISA检测,并对不同型别HPV阳性的标本行Western bolt检测.结果 临床标本的HPV检出率,通用引物PCR为70.3％(64/91),巢式PCR为86.8％(79/91),ELISA检测为84.6％(77/91),ELISA法的检出率与巢式PCR相当,高于通用引物PCR.对7个不同型别HPV阳性标本的Western bolt检测,多肽抗血清显示了良好的多价反应性.结论 该HPV L1 C-末端保守序列多肽抗血清对外阴及宫颈病变标本中的HPV具有良好的检出能力,对多型HPV具有良好的多价反应能力.
-
血清β-HCG水平检测与妊娠高血压综合征的关系
绒毛膜促性腺激素(HCG)是由合体滋养细胞分泌的一种糖蛋白激素,受精卵着床后因特异性β-HCG抗血清在母体血液中增加很快,约1～2天即增加1倍,至妊娠8～10周血清浓度达高峰,持续2周后迅速下降,妊娠中晚期血清浓度仅为峰值的10%,持续至分娩,分娩后若无胎盘残留,约于产后2周内消失.血清HCG测定在早孕、异位妊娠、滋养叶细胞疾病的诊断及疗效观察中的价值是众所周知的,同时, HCG也是反映胎盘分泌状态的一个重要指标.本文应用化学发光免疫法测定不同程度妊高征患者β-HCG水平,现将结果报告如下.
