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B细胞表位人源化的猪ZP4在大肠杆菌中的表达与鉴定
近年来,以卵透明带为靶抗原的疫苗制备已从初的卵透明带及其组分水平向更高层次发展.Minoru等[1]发现用人工合成的LDPENLTL八肽B细胞表位片段与外源性T细胞表位所得嵌合肽免疫小鼠所得抗血清可有效抑制猪精卵结合试验,但对人精卵结合试验却效果甚差.
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3-羟酰基辅酶A脱氢酶在大肠杆菌中的表达及抗血清的制备
目的:克隆并在大肠杆菌中表达3-羟酰基辅酶A脱氢酶(3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase,HCDH)并制备其抗血清.方法:通过PCR方法扩增HCDH基因片段,经DNA测序证实后克隆到原核表达载体pMAL-P2X,重组质粒转化大肠杆菌DE3,IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析表达结果,经麦芽糖树脂亲和纯化的蛋白皮下注射免疫獭兔,琼扩和ELISA检测抗血清的效价,Western blot检测其特异性.结果:PCR扩增得到786 bp的目的片段,序列测定证实与GeneBank上登录的序列一致;成功构建了HCDH基因片段的原核表达载体;在详细探索表达条件的基础上,成功诱导HCDH的表达,并制备了相应的抗血清.结论:检测HCDH蛋白在表达水平上的变化及为HCDH基因表达调控的进一步研究奠定了基础.
关键词： 3-羟酰基辅酶A脱氢酶 原核表达 抗血清 -
重组多克隆抗体——一类新的治疗制剂
抗体作为治疗制剂已有上百年历史,主要有抗血清和单克隆抗体,抗血清对多表位抗原的中和能力较强,但是,抗血清安全性低、供应量有限、批次间差异大、有效抗体成分低,而且不能进行基因改造;单抗药物的特异性强、重复性好、能够进行基因操作、安全性高,不过,在由多表位抗原或者是突变较快的病原体引起的疾病治疗中,单抗的疗效相对较差;重组多克隆抗体几乎拥有抗血清和单抗的所有优点,在多种疾病比如感染和癌症的治疗中将体现其巨大的优势和良好的临床应用前景.本文将对这一类新型抗体治疗制剂做简要综述.
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草原兔尾鼠卵透明带3蛋白的免疫原性及其抗血清对体外精卵结合的影响
目的:大肠杆菌表达的重组草原兔尾鼠透明带3(Recombinant Lugurus zone pellucida 3,r-LZP3)蛋白的免疫原性直接影响抗体的滴度,通过对r-LZP3免疫原性的分析,获得特异性的抗血清,并探讨r-LZP3和抗血清对体外精卵结合的影响.方法:在大肠杆菌中以包涵体形式表达r-LZP3,经过变性、复性及纯化后作为抗原,用LZP3 DNA疫苗初免小鼠后,再用r-LZP3进行免疫加强,产生特异性的LZP3抗血清;通过EL1SA测定抗体应答的水平;蛋白印迹、间接免疫荧光和免疫组化方法检测抗血清同r-LZP3、鼠卵母细胞表面天然ZP的反应性;精卵结合实验观察r-LZP3、抗血清体外对鼠精卵结合能力的影响.结果:用LZP3 DNA疫苗免疫制备的抗血清在免疫鼠中产生了较高的抗体滴度,并且可以识别大肠杆菌表达的r-LZP3以及鼠卵细胞表面天然的ZP,抗血清和r-LZP3也都能在体外抑制鼠的精卵结合.结论:大肠杆菌表达的r-LZP3有较好的免疫原性,r-LZP3和抗血清能够在体外阻止鼠的精卵结合.
关键词： 草原兔尾鼠卵透明带3 免疫原性 抗血清 卵母细胞 精卵结合 -
自身免疫性溶血性贫血免疫分型及临床分析
自身免疫性溶血性贫血是一种获得性疾病[1],其获得过程通常是由患者自身的抗体和补体吸附在红细胞表面,导致红细胞破坏,红细胞造血功能缺失,从而引发的溶血性贫血.近年来,随着人们的工作压力逐渐增大,人们往往会忽视自己身体的营养状况,个人身体体质大不如前,导致出现自身免疫性溶血性贫血的患者逐年增多.在对自身免疫性溶血性贫血患者治疗过程中,医学界逐渐引进现代科学技术,采取抗血清对患者进行治疗的方法得到了医学界普遍认可.根据自身免疫性溶血性贫血患者的临床特点、治疗疗效以及预后和患者自身带有的抗体类型和基本性质有着密不可分的关系.对患者治疗过程中,利用广谱抗人球蛋白血清、单特异性抗体IgG、抗C3抗血清这3种抗血清[2,3],注射到病人体内,进行直接抗人球蛋白的临床试验,再结合相关溶血性贫血的理论对注射3种抗血清的患者做进一步的治疗.本次临床试验,对我院34例自身免疫性溶血性贫血患者进行实验室指标分析,并根据临床治疗结果,探讨该方法的治疗意义,具体报道方案如下.
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小鼠载脂蛋白A-Ⅰ的原核表达及抗血清的制备
目的 原核表达小鼠载脂蛋白A-Ⅰ(ApoA-Ⅰ),并制备抗血清.方法 应用RT-PCR方法从小鼠肝脏中扩增ApoA-Ⅰ基因,亚克隆至原核表达载体pET-28a(+),转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达.表达的融合蛋白经Ni2+-NTA柱纯化后,免疫家兔,制备抗血清.结果 扩增的ApoA-Ⅰ基因经测序,表明与GenBank中报道的序列(NM_009692)完全相同.重组表达质粒经酶切鉴定,证明构建正确.表达的ApoA-Ⅰ融合蛋白相对分子质量约为32 000,表达量占菌体总蛋白的17%.纯化的融合蛋白纯度达90.7%,可与抗His·Tag单抗发生特异性反应.制备的抗血清可识别ApoA-Ⅰ融合蛋白,效价可达1:105.结论 已在大肠杆菌中表达了小鼠ApoA-Ⅰ,并制备了较高效价的抗血清.
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铜绿假单胞菌RhlR抗血清制备
目的 在原核系统中表达铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)PAO1的调控蛋白RhlR,制备兔抗RhlR抗血清.方法 构建重组表达载体pGEX-4T-1-rhlR和pET-22b-rhlR并转化至大肠埃希菌BL21感受态细胞中,IPTG诱导表达GST-RhlR和His-RhlR蛋白,经GST或Ni2+亲和层析纯化重组蛋白.将His-RhlR蛋白免疫新西兰大白兔,制备RhlR抗血清,GST-RhlR蛋白包被ELISA板,检测效价.结果 构建的表达载体pGEX-4T-1-rhlR和pET-22b-rhlR经双酶切及测序鉴定证明构建正确;构建的工程菌表达的目的蛋白His-RhlR和GST-RhlR相对分子质量分别为29 000和54 000,表达量均约占菌体总蛋白的85％,纯度大于90％.制备的RhlR抗血清效价可达1∶80000.结论 获得高效价的RhlR抗血清,为PA中rhl调控系统的研究奠定基础.
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利用DNA免疫技术制备麻疹病毒抗血清
目的 利用DNA免疫技术制备特异性麻疹病毒抗血清,用于麻疹减毒活疫苗毒种以及含麻疹病毒疫苗的检定.方法 以含麻疹病毒沪-191融合蛋白F和血凝素H基因的重组真核表达载体pGI-F和pGI-H作为免疫原,免疫家兔,制备麻疹病毒抗血清.采用细胞培养法检测抗血清细胞毒性,ELISA法检测抗体滴度,微量细胞病变法检测抗血清的特异性和中和效价.结果 麻疹病毒抗血清细胞毒性小,与风疹病毒、腮腺炎病毒、水痘病毒均无交叉反应.抗血清的ELISA效价大于256 000,中和效价为1∶1 024,4倍稀释后仍能完全中和1×105 CCID50/ml麻疹病毒.结论 DNA免疫方法可制备高效价、低细胞毒性的麻疹病毒抗血清,该血清可用于麻疹疫苗毒种及含麻疹疫苗的质量控制.
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水痘-带状疱疹病毒在Vero细胞中的传代培养及抗水痘血清的制备
目的 在Vero细胞中传代培养水痘-带状疱疹病毒(varicella-herpes zoster virus,VZV),并制备抗水痘血清.方法 将VZV(北京株VZV84-2)在Vero细胞中传代培养,待细胞病变(CPE)稳定后制备抗原,分别免疫家兔(分为1组和2组)和豚鼠(仅1组),均免疫4次,每次间隔14 d,其中除家兔1组第3、4次免疫经耳静脉注射不含佐剂的免疫原外,其他均经背部皮下免疫含弗氏完全佐剂的免疫原.于末次免疫后2周经颈动脉采血,分离血清,进行无菌试验、中和抗体效价检测及特异性干扰试验.结果 VZV(北京株84-2)在Vero细胞中传至第5代时,CPE可达80％ ～90％,传至第10代时,CPE稳定.用含兔及豚鼠血清培养基制备的免疫原的蛋白含量分别为2.1和1.7 mg/ml.抗血清无菌检测合格;家兔1组、豚鼠组、家兔2组的血清中和抗体效价分别为1∶128、1∶256、1∶64;抗水痘血清对麻疹(沪191株)、腮腺炎(S79株)、风疹(BRDⅡ株)疫苗的滴定无干扰.结论 成功将VZV在Vero细胞中进行传代培养,并制备了抗水痘血清,但效价较低,有待进一步提高.
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麻腮风水痘联合减毒活疫苗病毒滴定中混合抗血清对异种病毒的干扰
目的 检测麻腮风水痘(measles,mumps,rubella and varicella,MMRV)联合减毒活疫苗病毒滴定中混合血清对异种病毒的干扰作用.方法 滴定MMRV联合减毒活疫苗各病毒成分时,根据各种抗病毒血清的使用浓度,通过不同滴度水平的异种病毒,采用96孔微量版滴定法(麻疹、腮腺炎、风疹病毒)和改良蚀斑法(水痘病毒)检测混合抗血清对其滴度的影响.结果 1∶320抗腮腺炎病毒血清、1∶40抗风疹病毒血清和1∶128抗水痘病毒血清的混合血清对不同滴度的麻疹病毒无干扰作用;1∶320抗麻疹病毒血清、1∶40抗风疹病毒血清和1∶128抗水痘病毒血清的混合血清对不同滴度的腮腺炎病毒无干扰作用;1∶320抗麻疹病毒血清、1∶320抗腮腺炎病毒血清和1∶128抗水痘病毒血清的混合血清对不同滴度的风疹病毒无干扰作用;1∶80抗麻疹病毒血清、1∶40抗腮腺炎病毒血清和1:40抗风疹病毒血清的混合血清对不同滴度的水痘病毒无干扰作用.结论 在MMRV联合减毒活疫苗病毒滴定中,混合抗血清对异种病毒无干扰作用.
关键词： 麻腮风水痘联合减毒活疫苗 抗血清 病毒 干扰 -
人乳头瘤病毒58型截短型L1蛋白与结核分枝杆菌早期分泌型抗原靶蛋白-6的融合表达及其抗血清的制备
目的 原核表达人乳头瘤病毒(Human papilloma virus,HPV)58型截短型L1 (Truncated L1,tL1)蛋白与结核分枝杆菌早期分泌型抗原靶蛋白-6(Early secreted antigenic target-6,ESAT-6)融合蛋白,并制备其抗血清.方法 利用PCR技术分别从HPV基因组DNA和ESAT-6-18T质粒DNA中扩增tL1和ESAT-6基因,构建重组原核表达质粒ESAT-6-tL1-pET-21a,分别转化E.coli BL21(DE3)和Rosetta,IPTG诱导表达.表达的融合蛋白ESAT-6-tL1经镍离子亲和层析柱纯化后免疫昆明小鼠,ELISA检测血清抗体效价.结果 PCR扩增出750 bp的tL1基因片段和320 bp的ESAT-6基因片段,测序结果与GenBank登录的序列一致；重组表达质粒ESAT-6-tL1-pET-21a经双酶切鉴定,构建正确；表达的ESAT-6-tL1融合蛋白相对分子质量约40 000,在E.coli Rosetta中的表达形式为包涵体,纯化后纯度为85％,免疫小鼠血清抗体效价为1:4 000.结论 成功表达了ESAT-6-tL1融合蛋白,并制备了其抗血清,为进一步研制检测HPV58的抗体奠定了基础.
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高效价抗肠道病毒71型兔血清的制备及鉴定
目的 制备高效价的抗肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)兔血清.方法 分别用RD细胞和Vero细胞培养EV71,纯化后,将经甲醛灭活和未灭活的EV71抗原分别加入佐剂或不加佐剂,经不同途径(肌肉、皮下、腹腔)免疫家兔,每周采血,分离血清,分别采用ELISA、免疫双扩散、免疫荧光和中和抗体试验检测兔血清抗体效价,并分析不同方法检测兔血清抗体结果的相关性.结果 未灭活和灭活的纯化EV71抗原加弗氏佐剂后,经皮下或肌肉途径免疫家兔均可获得高效价的抗EV71兔血清,其中加弗氏佐剂的灭活疫苗经皮下途径免疫获得了高滴度的中和抗体;当抗血清ELISA效价达到或接近1∶108,免疫双扩散效价达到或接近1∶512,抗血清1:2000稀释后荧光强度＞++时,可进行免疫家兔的全血采集;不同方法免疫家兔全血采集的血清中和抗体效价为29 406～ 1280652 U/ 0.2ml;免疫双扩散检测与中和抗体和免疫荧光检测结果的相关性较高.结论 获得了高效价的抗EV71兔血清,为EV71疫苗抗原的相关检定创造了条件.
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中蜂囊状幼虫病病毒结构蛋白的表达及其抗血清的制备
目的 原核表达中蜂囊状幼虫病病毒(Chinese sarbood virus,CSBV)结构蛋白,并制备其抗血清.方法 采用RT-PCR法扩增CSBV结构蛋白基因片段,克隆至pGEX-4T-1载体中,转化大肠杆菌BL21 (DE3),IPTG诱导表达.表达的重组蛋白经Gluthathione-Sepharose 4B亲和层析纯化后,免疫小鼠,制备抗血清,并进行Western blot鉴定.结果 重组表达质粒经菌落PCR鉴定证明构建正确；表达的重组蛋白相对分子质量约52 000,以可溶性形式表达；纯化后纯度可达95％以上；制备的抗血清可识别天然CSBV结构蛋白.结论 成功在大肠杆菌中表达了CSBV结构蛋白,并制备了其抗血清,为进一步研究囊状幼虫病病毒与宿主的相互作用及开发血清学诊断方法奠定了基础.
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柯萨奇病毒A组6型衣壳蛋白VP1的原核表达及其抗血清的制备
目的 原核表达柯萨奇病毒A组6型(Coxsackie virus group A 6 strain,CVA6)衣壳蛋白VP1,并制备其抗血清.方法 合成经密码子优化的CVA6-VP1全长基因,克隆至原核表达载体pET-28a中,构建重组质粒pET-28a-VP1,转化感受态E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达目的蛋白,同时优化IPTG终浓度(0.1、0.2、0.3、0.5 mmol/L)、诱导温度(15、20、25、30℃)及诱导时间(6、8、12、16 h).表达产物采用Ni-NTA柱亲和层析纯化,将纯化重组蛋白免疫新西兰兔,制备VP1抗血清,微量细胞病变法检测血清抗体效价.结果 重组质粒pET-28a-VP1经双酶切及测序鉴定,构建正确.重组蛋白适诱导条件为:IPTG终浓度为0.3 mmol/L,诱导温度为15℃,诱导时间为12h.重组蛋白相对分子质量约34 000,于上清和包涵体中均有表达,纯化后纯度可达95％以上.兔血清效价均＞1∶8,呈阳性.结论 成功于原核表达系统中高效表达了可溶性CVA6-VP1蛋白,且获得效价较高的抗血清.
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精制抗狂犬病血清的接种反应
目的 观察国产精制抗狂犬病血清接种后的反应.方法 按照抗狂犬病血清使用说明,对符合三级暴露者850人进行抗狂犬病血清接种,并观察接种反应.结果 抗狂犬病血清注射者850人,反应阳性率为12.47%,其中24h内反应率为3.41%,迟发过敏反应率为9.06%.无过敏性休克病例.4～8d出现局部反应率为4.94%,比其他时间组均高,差异有显著意义.皮试阳性组与阴性组迟发过敏反应率比较,差异无显著意义.男性反应率为10.83%,女性反应率为13.91%,两组差异无显著意义.不超过加岁组反应率为8.12%,20岁以上年龄组反应率为15.62%,两组差异有显著意义.结论 使用国产精制抗狂犬病血清安全可行.
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猪干扰素γ的原核表达及抗血清的制备
目的 原核表达猪干扰素γ(poIFNγ),并制备其抗血清.方法 PCR扩增poIFNγ成熟多肽基因片段,克隆至原核表达载体pET-28a(+)中,构建重组表达质粒pET-28a-poIFNγ,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达.表达的蛋白纯化后免疫小鼠,制备抗血清,ELISA检测抗血清的效价.结果 重组原核表达质粒pET-28a-poIFNγ经双酶切和测序证明构建正确;重组蛋白的表达量占菌体总蛋白的40%,主要以包涵体形式表达;纯化的重组蛋白纯度可达90%;制备的抗血清效价可达10~(-5).结论 已成功地在大肠杆菌中表达了poIFNγ,并制备了较高效价的抗血清.
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谈效价及检验报告单的管理
效价亦称为滴度,在免疫学中用来表示抗体的量.在抗原抗体反应中,单位容积抗血清中抗体含量即用效价来表示.通常在连续稀释抗血清后,加入相应抗原,后以出现标准效应的血清高稀释倍数作为血清中该抗体的效价.<丘吉尔医学词典>解释效价为引起反应的高稀释度的倒数.如1:256稀释仍出现标准反应,而1:512未出现,则抗体的效价为256[1].<现代免疫学词典>也如此解释[2].国外影响深远的<微生物学基础>和<基础与临床免疫学>,在论述抗体效价时,均以引起反应的高稀释度的倒数来表示.
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华支睾吸虫成虫RPEF基因产物及其抗RPEF多克隆抗体的制备
目的 体外制备华支睾吸虫成虫RNA聚合酶Ⅱ延长因子(RPEF)基因产物及抗RPEF多克隆抗体.方法 亲和纯化试剂盒纯化表达蛋白pGEX-4T-1-RPEF,凝血酶酶切表达蛋白制备重组蛋白RPEF,将重组蛋白RPEF免疫小鼠,制备多克隆抗血清,检测抗体滴度和抗血清特异性.结果 体外制备的RPEF蛋白经SDS电泳呈单一条带;酶联免疫吸附结果显示,免疫过程抗体滴度呈连续上升趋势;免疫印迹结果显示,小鼠抗血清具有抗RPEF特异性.结论 获得较专一的华支睾吸虫RPEF蛋白和RPEF抗血清.
关键词： 华支睾吸虫 RNA聚合酶Ⅱ延长因子 基因产物 抗血清 多克隆抗体 -
人乳头瘤病毒16型E4蛋白表达、纯化及抗血清制备
目的 表达人乳头瘤病毒16型(HPV16) E4蛋白,并制备小鼠抗HPV16 E4血清.方法 将HPV16 E4基因克隆入pQE30,重组质粒pQE30-HPV 16E4经鉴定后转化大肠埃希菌M15(PREP4),诱导表达并鉴定表达产物.因纯化、变性和复性方法,制备可溶性HPV16 E4蛋白.免疫Bal B/C小鼠制备抗血清,检测小鼠IFN-γ水平、CD4/CD8比值和抗血清滴度变化.结果 酶切和测序结果表明pQE30-HPV16F4构建成功.表达分子相对分子量(Mr)为10 000,Western blot法证明具有较高特异性.小鼠抗血清效价升高,CD4/CD8无升高,小鼠γ干扰素(IFN-γ)无升高.结论 成功制备可溶性HPV16 E4蛋白和小鼠抗HPV16 E4高效价的抗血清.
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人乳头瘤病毒16型E7蛋白的表达、纯化及抗血清制备
目的 建立人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)16型E7蛋白的原核表达系统,表达HPV16 E7蛋白,制备小鼠抗HPV16 E7血清.方法 采用PCR方法扩增HPV16 E7基因,构建入pET21b质粒,重组表达载体经鉴定后转化大肠埃希菌BL21(DE3).诱导表达后经十二烷基硫酸钠(so-dium dodecyl sulphate,SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE)和Western blot鉴定表达产物.提取包涵体进行变性复性处理后纯化,纯化后的可溶性蛋白免疫Balb/C小鼠,检测小鼠体内 γ-干扰素(interferon-γ,IFN-γ)水平、CD4/CD8比值和抗血清滴度变化.结果 PCR扩增片段为0.3 Kb,酶切和序列测定证实重组质粒构建正确.SDS-PAGE在11 KD处出现蛋白条带.蛋白表达以包涵体为主.免疫后小鼠抗体效价升高,CD4/CD8比值无升高,IFN-γ无反应.结论 成功制备可溶性HPV16E7蛋白和小鼠抗HPV16E7高效价抗血清.
