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猪带绦虫TSO45W-4B-TSOL18融合基因在大肠埃希菌ArcticExpress(DE3)中的表达、纯化和兔抗血清的制备
目的 构建猪带绦虫pGEX-TSO45W-4B-TSOL18重组质粒,纯化重组融合蛋白及制备兔抗重组蛋白血清.方法 用疏水甘氨酸接头(Gly4Ser)3连接TSO45W-4B和TSOL18编码基因,通过全基因合成猪带绦虫TSO45W-4B-TSOL18融合基因.将融合基因定向克隆到pGEX-1 λT表达载体上,构建重组质粒pGEX-TSO45W-4B-TSOL18,再用重组质粒转化大肠埃希菌(E.col) ArcticExpress (DE3).用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导其表达,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析表达情况,亲和层析纯化获得重组融合蛋白.用纯化的重组蛋白按0.5 mg/只与弗氏完全佐剂(CFA)混合,于兔后腿肌肉及背部皮下多点免疫注射;2周后再用相同剂量的重组蛋白与弗氏不完全佐剂(IFA)混合加强免疫,此后每隔10 d按第2次免疫法重复加强免疫,第4次免疫后6d,采集兔心脏血并分离血清,立即纯化及制备抗血清.采用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定抗血清的效价,采用蛋白印迹(Western blot)法鉴定抗血清的特异性.结果 全基因合成的TSO45W-4B-TSOL18融合基因片段长度为789 bp.酶切证实pGEX-TSO45W-4B-TSOL18重组质粒成功构建,测序结果获得的基因片段大小为789 bp,与预期大小相符.SDS-PAGE分析和亲和层析后显示,重组质粒在转化E.col ArcticExpress(DE3)后,获得了相对分子质量约为55×103的重组融合蛋白,纯度为85%.ELISA测定兔抗血清的效价为1∶512 000,Western blot证实抗血清能与重组融合蛋白发生特异性反应,在相对分子质量约为55×103处出现1条与预期大小一致的特异性条带.结论 成功地构建猪带绦虫重组质粒pGEX-TSO45W-4B-TSOL18及制备了高纯度的TSO45W-4B-TSOL18重组融合蛋白和高滴度的兔抗重组蛋白血清.
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毒蛇咬伤并发循环、心、肾衰竭的抢救体会
毒蛇咬伤并发循环、心、肾衰竭,常规应用纠正心、肾、循环的方法,在无特效的抗血清情况下,仍成功地渡过并发症期.因此,对已有循环、心、肾并发症的毒蛇咬伤病人应就地抢救.毒蛇咬伤在城市已少见.在春初秋末的广大农村时有发生.对近年我院抢救成功入院时已并发循环、心、肾衰竭的5例病人做一回顾.
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尿妊娠胶乳试验肉眼与镜下结果观察
尿妊娠胶乳试验,具有操作简单、时间短、结果判断明显、敏感度较高、特异性较强等优点,在怀孕早期作出诊断。 尿妊娠胶乳试验要求在较强的光线下用肉眼观察结果,所以受光线的影响,在试验中有时可产生一种非均匀一致的漂浮状白色颗粒。如果光线较弱遇此非特异性凝集,或抗血清与胶乳抗原结合,产生凝集不明显时,就会造成假阴性或假阳性结果,但在显微镜下观察就很容易鉴别,非特异性凝……
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动物咬伤后的医学处理及狂犬病疫苗和抗血清的安全性探讨
狂犬病又称恐水症,是由狂犬病毒所致的急性传染病,人被病兽咬伤而感染,多见于狗、猫、狼等肉食动物.狂犬病主要临床表现为兴奋、恐水、咽肌痉挛、进行性瘫痪等.该病是一种十分凶险的疾病,即使在科学比较发达的今天,提起狂犬病,也会让人毛骨悚然,它在某种程度上说比癌症更可怕.当今病死率高的疾病就是狂犬病,狂犬病一旦发作并出现症状,病死率几乎是100%.虽然狂犬病的病死率是100%,但狂犬病又是百分之百可以预防的.被动物咬伤后预防狂犬病发生的有效措施是正确处理伤口,注射狂犬病疫苗和抗狂犬病血清,三者缺一不可.
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兔抗人DR5抗血清诱导Jurkat细胞凋亡
制备兔抗人sDR5抗血清,检测它对Jurkat细胞的生长抑制和凋亡诱导作用.采用本室制备的sDR5免疫新西兰白兔,制备兔抗人sDR5抗血清,用ELISA法测定抗sDR5抗血清效价及抗血清的特异性.MTT试验分析它对Jurkat细胞生长抑制影响,倒置光显微镜和荧光显微镜观察抗sDR5抗血清对Jurkat细胞形态的影响,用Annexin V/PI双染试剂盒检测Jurkat细胞凋亡率,琼脂糖凝胶电泳检测Jurkat细胞中DNA的片断化.结果:获得了高效价特异性兔抗人sDR5抗血清.兔抗人sDR5抗血清对Jurkat细胞具有显著的细胞生长抑制作用,并呈剂量依赖性.兔抗人sDR5抗血清处理后,Jurkat细胞可出现典型的细胞凋亡的形态特征:细胞膜皱缩,出泡,染色质浓缩,形成凋亡小体等.流式细胞术结果显示:兔抗人sDR5血清1/80、1/160作用Jurkat细胞2 h,细胞凋亡率分别为54.98%和34.13%.兔抗人sDR5抗血清可导致Jurkat细胞中的DNA片段化.本室制备的兔抗人sDR5抗血清能抑制Jurkat细胞生长和诱导Jurkat细胞凋亡.
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人FcεRIα亚基的细胞外区的克隆表达和抗血清的制备及功能
为获得有生物活性的FcεRIα亚基细胞外区及多克隆抗体,并探知其功能,构建FcεRIα亚基的细胞外区的原核表达载体PBAD/gⅢA/FcεRIα,经表达、纯化后用斑点杂交法检测其活性.纯化制品免疫兔子获得抗血清,并研究抗血清对FcεRI的作用.结果发现,经原核表达出的FcεRIα亚基的细胞外区能与IgE结合;获得具有特异性抗FcεRI的抗血清,可能抑制嗜碱粒细胞脱颗粒.实验提示原核表达系统能产生有生物学活性的FcεRIα亚基的细胞外区,用其制备的抗血清能够识别FcεRIα亚基的细胞外区,可能抑制嗜碱粒细胞脱颗粒,为研究FcεRIα表达调节、对其的封闭作用及研究过敏性疾病的发病机制奠定物质基础.
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重组人IL-4抗血清的特异性评价
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定量测定C-反应蛋白(CRP)在小儿急性感染症中的应用
血清CRP的检测已广泛应用于儿科临床感染疾病的辅助诊断.但受测定方法和抗血清质量的限制,以致CRP测定灵敏度和准确性欠佳.本文采用速率散射比浊法定量测定了儿科常见感染症治疗前后的血清CRP水平,并与其他感染指标进行比较分析.
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红细胞免疫系统研究进展
1930年Duke发现锥虫在抗血清及补体存在时可黏附到人类红细胞膜上,并发现不同人红细胞对锥虫的黏附能力不同.
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凝血因子ⅩⅢ在病毒性肝炎患者血浆中的变化
本文采用了兔抗人因子ⅩⅢ亚基(ⅩⅢ-a)和兔抗人因子ⅩⅢb亚基(ⅩⅢ-b)抗血清借电免疫扩散法测定了21名正常人及103例瞒毒性肝炎患者血浆因子ⅩⅢ亚基水平,结果发现血浆因子ⅩⅢa亚基抗原(ⅩⅢ-a:Ag)及b亚基抗原(ⅩⅢ-b:Ag)在各组肝炎患者血浆中均有显著下降.其中7例死亡者中有2例肝硬化ⅩⅢ-a:Ag和ⅩⅢ-b:Ag与正常组比较分别为29.8%和44.7%,5例重型肝炎为33.4%和68%,并伴有凝血酶原时间延长和不同程度的出血现象.这些结果表明了ⅩⅢ-a:Ag和ⅩⅢ-b:Ag值的测定对诊断和估计肝病的严重程度以及了解凝血系统的状态具有实用价值.
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急性腹泻患儿空肠弯曲菌血清学和生物学分型
1984年12月~1985年11月,我们用加拿大Lior近年提出的血清学和生物学分型技术,系统观察了我院急性腹泻患儿空肠弯曲菌血清和生物型别分布情况.139株血清学分型的菌株中,115株能为我们使用的抗血清分型,其余24株分别出现了不凝集,与二种以上单价抗血清和仅同多价抗血清凝集.Lior血清型4和1可能是上海地区主要流行株.血清型别的分布似乎和季节无关.139株中的111株同时进行了生物学分型,结果提示:本地区引起小儿急性腹泻的空肠弯曲菌主要为弯曲菌空肠亚种生物Ⅰ、Ⅱ工亚型和结肠亚种生物Ⅰ、Ⅱ亚型,并以前者多见.本工作中未发现快速硫化氢反应阳性菌株和近被认识的耐嗪啶酸嗜热弯曲菌--弯曲菌Laridis.我们还对二种分型方法进行了比较和评价.
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不同脑区注射生长激素释放抑制激素抗血清对大鼠氧惊厥的抑制作用
在皮层结构中,纹状体和海马与惊厥的发生发展关系为密切,氧惊厥的发生与大脑皮层下中枢的异常放电有关[1],有研究表明,纹状体和海马在人和动物各种类型的惊厥中均发挥着重要的作用[2].氧惊厥发生前后,纹状体和海马中的生长激素释放抑制激素(义称生长抑素,somatostatin,SS)含量出现非常显著的改变,而通过半胱胺耗竭整个中枢SS能延迟氧惊厥的发生[1].本研究通过纹状体和海马注射SS抗血清,阻断内源性SS,观察对大鼠氧惊厥潜伏期、惊厥严重程度和死亡时间产生的影响,旨在进一步明确SS在氧惊厥发生发展过程中的作用及发挥作用的中枢部位.
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人卵透明带蛋白ZP3a和ZP3b肽段的免疫原性及其抗血清体外抑制人精子-半透明带结合
分析大肠杆菌表达的重组人卵透明带-3(r-huZP3)蛋白两个肽段(r-huZP3a22~176及r-huZP3b177~348)的免疫原性,比较两者抗血清体外抑制人精子-半透明带结合的能力.以制备性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)纯化的大肠杆菌表达蛋白为抗原,主动免疫新西兰兔产生抗huZP3a22~176及huZP3b177~348抗血清;通过ELISA测定比较两者的抗体应答水平;以蛋白印迹和免疫组化方法测定两者抗血清同重组表达蛋白、天然人卵ZP以及卵巢组织的反应性;通过竞争性半透明带结合试验(hemizona assay,HZA)观察两者抗血清体外抑制人精子-ZP结合能力.结果显示:未与大分子蛋白载体耦联的r-huZP3a22~176和r-huZP3b177~348抗原都在免疫兔中产生了较高的抗体滴度,而且它们的抗血清可识别大肠杆菌表达的各自重组ZP3肽以及人卵细胞表面天然ZP,两者抗血清也都能在体外抑制人精子-ZP结合.由此可见,r-huZP3a22~176及r-huZP3b177~348蛋白具有良好免疫原性,所产生抗血清也都显示出细胞和组织特异性.因此,单一或合并两个huZP3肽段均可作为抗原研制检测不明原因性不孕妇女中是否存在抗自身ZP抗体的诊断试剂盒,另外它们的抗血清也能用于鉴定已知huZP3表位肽段的小B-细胞表位基序.
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抗血管紧张素原多克隆抗血清的制备及鉴定
为深入研究血管紧张素原(angiotensinogen, AGT)的表达和组织分布特征, 我们以原核表达的AGT蛋白C末端片段为免疫原免疫家兔, 制备了针对AGT的多克隆抗血清, 并对其进行了ELISA、Western印迹分析及免疫组化鉴定.结果发现, 经多次免疫后获得的多克隆抗血清不仅效价高(1∶ 25600), 而且能特异性地针对组织内源性及原核表达的AGT蛋白, 同时在人和大鼠组织AGT之间会发生交叉反应.以此抗血清进行免疫组化染色, 观察到人胰腺的胰岛细胞及肝内胆管上皮细胞胞浆均有AGT蛋白表达.以上结果提示, 利用大肠杆菌融合表达的AGT蛋白可有效刺激家兔产生AGT抗体.本工作为进一步研究AGT乃至局部RAS的生理、病理意义提供了重要的实验工具.
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淋病奈瑟菌外膜PorinⅠ蛋白多价抗血清的黏附抑制功能
大量资料证实淋病奈瑟菌入侵组织早期首先需黏附至泌尿生殖道上皮细胞表面,然后才能进入机体引起一系列病变.因此黏附是淋球菌致病的先决条件,一旦失去黏附能力,就不能引起淋病[1,2].我们在成功地构建、表达并纯化淋球菌外膜GST-PI融合蛋白后(GST:谷胱苷肽S转移酶)[3],将其免疫家兔制备了PI蛋白的家兔多价抗血清,并观察了该多价抗血清对淋球菌黏附上皮细胞的抑制作用.现报道如下.
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黄瓜花叶病毒2b蛋白在大肠杆菌中的表达及抗血清制备
从黄瓜花叶病毒(CMV)中提取总RNA,通过反转录-PCR(RT-PCR)扩增得到其运动蛋白2 b基因,将扩增产物克隆到pMD-18T载体上.DNA序列分析表明,所得到2 b基因全长为303 bp与已发表CMV序列相同.将目的片段亚克隆到表达载体pET-30 a上,并在大肠杆菌JM109诱导表达,诱导9 h后,融合蛋白表达量大.经SDS-PAGE检测,融合蛋白以可溶形式存在.制备的抗血清,效价为1:4 000.
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AD7c-NTP与麦芽糖结合蛋白的融合表达、纯化及其抗血清制备
人工合成了编码AD7c-NTP的基因,并将其中的6种密码子GGA AGG AGA ATA CTA CCC分别突变成大肠杆菌偏爱密码子GGT CGT CGT ATC CTG CCG,PCR扩增后克隆到表达载体pMAL-c2上,构建表达质粒pMAL-AD7c,重组质粒导入E.coli BL21(DE3)构建工程菌,IPTG诱导实现了MBP-AD7c-NTP融合蛋白在工程菌中的高效表达,细胞裂解液经Amylose-resin亲和层析、DEAE-Sepharose离子交换层析以及Su-perdex 200凝胶过滤层析,得到了电泳纯的融合蛋白.纯化的融合蛋白免疫家兔制备了兔抗MBP-AD7c-NTP融合蛋白的抗血清,利用该抗血清及点杂交技术,初步分析了10例AD疑似患者的尿样,结果表明5例疑似患者的尿样呈阳性,另5例呈阴性.
关键词: 麦芽糖结合蛋白AD7c-NTP融合蛋白 表达 纯化 抗血清 -
日本血吸虫22.6kDa重组抗原的高效融合表达及特性鉴定
目的大量获得纯化的日本血吸虫22.6kDa重组抗原.方法用PCR方法将其编码基因序列经改造后亚克隆入载体质粒pGEx-1λT进行表达.结果得到了融合表达的蛋白抗原.此融合蛋白表达量大,用凝血酶酶切后易大量制备纯化的重组22.6kDa抗原.结论以此融合蛋白免疫的小鼠抗血清进行免疫印迹试验,表明Sj22.6/Sj26 GST融合重组蛋白具有与Sj22.6蛋白一样的免疫学活性.
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多疣壁虎SPARCL1多克隆抗血清的制备及鉴定
目的:制备针对多疣壁虎SPARCL1的多克隆抗体,为深入研究SPARCL1基因功能奠定基础.方法:构建pGEX-4T1-SPARCL1质粒,在大肠杆菌BL21表达GST- SPARCL1蛋白,经亲和层析纯化后免疫新西兰大白兔,获得SPARCL1抗血清,经酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测SPARCL1抗血清的效价,Western blot和免疫组化法检测多克隆抗体特异性.结果:成功构建多疣壁虎SPARCL1基因的原核表达质粒pGEX-4T1-SPARCL1,诱导得到较高纯度的GST-SPARCL1融合蛋白,免疫兔获得SPARCL1抗血清,经Western-blot及免疫组织化学实验显示所得抗体具有较高的效价及特异性.结论:成功获得较高效价特异性强的SPARCL1抗血清,为进一步深入研究多疣壁虎SPARCL1功能提供抗体工具.
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人类β3-N-乙酰氨基葡萄糖基(β3半乳糖)转移酶β3GnT8/ GalT7的抗体制备、免疫组化分析及其亚细胞定位
目的 探讨β3GnT8(β3GalT7,AY277592,EC2.4.1.-)基因(人类β3-糖基转移酶家族中的一个新成员)的功能.方法 原核表达该蛋白,以纯化的蛋白免疫新西兰大白兔,制备多克降抗血清;以Western blot和免疫组化分析其在多种组织细胞的表达情况;并通过荧光免疫细胞化学进行亚细胞定位.结果 获得了较纯的表达蛋白和高效价、高特异性的抗血清,片且发现该蛋白大部分位于核膜周围的胞浆中;免疫组化分析显示肿瘤细胞和组织中该酶有较高的表达,与正常组织比较具有一定的差异性.结论 该实验获得了β3GnT8/β3GalT7基因的蛋白质和相应抗体,并且对该蛋白进行了亚细胞定位,为对其生物学功能的进一步研究奠定了基础.
关键词: β3GnT8/β3GalT7 抗血清 免疫组化 亚细胞定位