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慢病毒介导的人Bax基因和人肝细胞生长因子基因在小鼠胚胎成纤维细胞中的共表达
目的 构建绿色荧光蛋白标记的人Bax基因(hBax)和人肝细胞生长因子基因(hHGF)双基因共表达的重组慢病毒.证实已包装成功的慢病毒能感染正常细胞并表达目的 蛋白.方法 通过重叠PCR技术构建attB1-K-hBAX/T2A/eGFP/P2A/hHGF-attB2基因片段,利用gateway technology构建慢病毒载体质粒pLV.EX2d.null-EF1A>hBAX/T2A/eGFP/P2A/hHGF和阴性对照质粒pLV.EX2d.null-EF1A>eGFP并测序,上述两种质粒分别与辅助质粒共转染293FT细胞包装病毒,荧光显微镜检测病毒滴度.实验分为实验组(感染了共表达Bax和HGF的慢病毒)、阴性对照组(仅感染了表达绿色荧光的慢病毒)和空白组(未作任何处理的正常NIH3T3细胞)三组,RT-PCR和Western blot检测染毒后各组细胞Bax和HGF的表达.结果经鉴定慢病毒载体质粒构建正确,荧光显微镜检测hBax和hHGF共表达慢病毒滴度为7.8×107 TU/ml,仅表达绿色荧光蛋白的阴性病毒滴度为9×107 TU/ml.将包装成功的慢病毒感染NIH3T3细胞48 h后,RT-PCR和Western blot结果显示实验组与其他两组相比,Bax和HGF的表达明显上调(P<0.05).结论 标记增强型绿色荧光蛋白的表达hBax和hHGF双基因慢病毒构建成功并获得高滴度的病毒感染液.通过慢病毒感染途径成功将HGF和Bax基因导入NIH3T3细胞并表达蛋白,为进一步研究Bax和HGF双基因共表达的重组慢病毒对血管内皮细胞、平滑肌细胞和成纤维细胞的影响奠定了基础.
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肝细胞生长因子对体外培养的人退变髓核细胞生物学活性影响
目的 探讨肝细胞生长因子(HGF)对体外培养的人退变髓核细胞的生物学作用.方法 收集人退变髓核组织标本,分离培养髓核细胞;免疫组化染色观察HGF受体在髓核细胞中表达;设立不同浓度HGF组(0 ng/ml,5 ng/ml,50 ng/ml,500 ng/ml),采用MTT法测细胞生长曲线,筛选HGF佳作用浓度;选取第3代髓核细胞,实验分HGF组、HGF+胰岛素样生长因子(IGF)组、IGF组、对照组,RT-PCR检测Ⅱ型胶原、蛋白多糖、SOX9 mRNA表达:流式细胞术测定细胞增殖的周期.结果 免疫组化显示髓核细胞表达HGF受体;MTF法提示不同浓度HGF对体外培养的人退变髓核细胞均有明显的促增殖作用,与对照组相比差异均有统计学意义,50 ng/ml是实验中HGF的佳作用浓度;HGF、HGF+IGF、IGF刺激后髓核细胞进入增殖期比例增加,同时促进髓核细胞Ⅱ型胶原、蛋白多糖、SOX9 mRNA表达量增加,其中HGF+IGF效果更为显著.结论 人退变髓核细胞存在HGF受体;HGF对体外培养的人退变的髓核细胞有促增殖作用,可以促进细胞外基质表达;HGF与IGF联合作用效果优于两者单独作用.
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肝细胞生长因子对肾小管上皮细胞转分化及整合素连接激酶表达的影响
目的 探讨肝细胞生长因子(HGF)在转化生长因子β1(TGF-β1)介导的肾小管上皮细胞转分化中的作用及对整合素连接激酶(ILK) 表达的影响.方法 将体外培养人肾小管上皮细胞(HKC)分为正常对照组、TGF-β1刺激组和HGF干预组.应用Western blotting方法检测ILK、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的蛋白表达,实时RT-PCR法测定ILK、α-SMA、纤维连接蛋白(Fn)、E钙黏蛋白(E-cadherin)的mRNA表达.结果 在TGF-β1刺激组,ILK和α-SMA的蛋白表达量显著增加,ILK、α-SMA和Fn的mRNA表达量也明显升高,E-cadherin mRNA 表达量则明显降低(与正常对照组比较,P<0.001).而在HGF干预组,ILK、α-SMA的蛋白表达量以及ILK、α-SMA、Fn的mRNA表达量均较TGF-β1刺激组显著降低,E-cadherin mRNA表达量则明显升高(与TGF-β1刺激组比较,P<0.01).结论 HGF能抑制TGF-β1介导的肾小管上皮细胞转分化,并可降低ILK蛋白和mRNA表达水平.
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携带人肝细胞生长因子腺病毒重组体的构建
目的 构建一种同时携带人肝细胞生长因子(hHGF)及绿色荧光蛋白(GFP)的腺病毒重组体,为hHGF的基因治疗提供实验基础.方法 对重组质粒pcDNA3-hHGF进行酶切鉴定及测序正确后,酶切获得hHGF,亚克隆至带有GFP 标记的穿梭质粒pAdTrack-CMV上.选取hHGF 正向插入的重组穿梭质粒经PmeⅠ充分线性化后,与骨架质粒pAdEasy-1 在大肠杆菌BJ5183 中同源重组,挑取阳性克隆行PCR 及酶切鉴定.重组病毒质粒用PacⅠ酶切线性化后,脂质体转染HEK293 细胞进行包装并扩增获取重组病毒上清,RT-PCR 及Western Blot 方法检测hHGF 的表达.结果 目的基因的测序结果与Genebank上的hHGF序列一致.hHGF 基因插入重组腺病毒载体的预期位置,感染Ad-hHGF的HEK293细胞中可检测到hHGF mRNA 和蛋白的表达.结论 成功构建了同时携带hHGF和GFP的重组腺病毒表达载体Ad-hHGF,为进一步探讨hHGF 的生物学功能提供了实验依据.
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血管内皮生长因子、肝细胞生长因子在虹膜新生血管大鼠房水中的含量变化
目的：探讨血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor，HGF）在虹膜新生血管（neovascularization of the iris，NVI）大鼠模型房水中的含量变化。方法将清洁级健康10周龄Wistar大鼠随机分为4组，每组20只（40眼），乙醚吸入法全身麻醉大鼠，实验1组：经尾部静脉注射孟加拉玫瑰红光敏剂；实验2组：尾部静脉注射孟加拉玫瑰红光敏剂＋氪激光光凝Wistar大鼠全部视网膜分支静脉；实验3组：氪激光光凝Wistar大鼠全部视网膜分支静脉；实验4组：空白对照组（未经任何处理）。利用虹膜荧光造影（iris fluorescence angiography，IFA）对各实验组大鼠进行鉴定，对NVI动物模型复制成功的大鼠采用Miller方法进行分级，对大鼠NVI形成前1天及模型复制后3、7、10、14、21、30 d分别抽取房水，采用酶联免疫吸附实验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）检测房水中VEGF、HGF的含量。采用SPSS 13.0统计软件分析实验组及对照组之间不同时间组房水中VEGF、HGF 含量变化，并分析两种因子的相关性。结果单纯应用孟加拉玫瑰红尾部静脉注射和单纯激光的方法不能使大鼠产生视网膜缺血，用尾部静脉注射孟加拉玫瑰红光敏剂＋氪激光光凝法可诱导大鼠视网膜静脉阻塞，成功制作NVI动物模型。 NVI模型复制前1 d房水中VEGF和HGF的浓度分别为（15.58±5.85）pg/ml和（22.84±6.75）pg/ml，复制后3、7、10、14、21、30 d二者浓度分别为（17.30±4.80）、（31.83±9.90）、（36.89±11.73）、（57.34±18.55）、（112.03±46.41）、（106.93±52.89）pg/ml和（24.58±7.18）、（36.47±11.28）、（46.27±13.11）、（59.25±15.47）、（90.71±29.91）、（102.08±34.82）pg/ml；VEGF和HGF与NVI形成呈正相关，但二者浓度无相关性。结论大鼠虹膜新生血管的形成与其房水中VEGF、HGF含量成正相关，二者在虹膜新生血管形成中可能扮演重要角色。
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组织同步成像评价肝细胞生长因子治疗心肌梗死犬的左心室同步状况
目的 探讨组织同步成像(TSI)在评价肝细胞生长因子(HGF)治疗心肌梗死犬对心肌同步状况影响中的应用.方法 将11只杂种犬随机分成HGF治疗组(6只)和对照组(5只),均结扎左冠状动脉前降支制成心肌梗死模型,在HGF组的梗死心肌周围注射HGF 1 ml,对照组的梗死心肌周围注射等量生理盐水,术后4、8周行超声心动图检查,检测心功能及左心室重构指标,采用组织同步成像(TSI)测量左心室心肌12节段的收缩期达峰值速度时间(Ts),并计算12节段Ts的标准差(Ts-SD)和Ts大和小时间的差值(Ts max-min).术后8周取心肌组织检测Ⅰ、Ⅲ型胶原含量并比较2组差异.结果 术后8周与对照组相比,HGF组左心室收缩末容积(LVESV)小于对照组,左心室射血分数(LVEF)大于对照组(P＜0.05).对2组左心室壁各节段的Ts进行多因素方差分析显示,HGF组前间隔中段Ts在术后第4及8周均小于对照组(P＜0.05).术后8周对照组 Ts-SD为(75.1±20.2)ms,HGF组为(38.7±6.4)ms(P＜0.05);当分组因素和时间因素交互作用时,2组Ts max-min比较差异有统计学意义(P=0.03).术后8周HGF组Ⅲ型胶原含量高于对照组,Ⅰ型与Ⅲ型胶原含量比值低于对照组(P＜0.05).结论 TSI可以检测心肌梗死犬心肌同步状况,采用HGF治疗后心肌同步性随着LVESV的减小和LVEF的增加而改善.
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肝细胞癌组织和血清中肝细胞生长因子的临床意义
目的 探讨肝细胞生长因子(HGF)在慢性肝炎、肝硬化、肝细胞癌(HCC)患者肝组织和血清中的表达水平及其临床意义.方法 收集2003年12月至2008年8月期间天津市第三中心医院11份正常、6份肝炎、20份肝硬化、60份HCC组织(高分化21份、中分化23份、低分化16份),及其癌旁0、1、2、3 cm组织(N0、N1、N2、N3)各24、21、54和43份.用实时荧光定量逆转录(RT)-PCR分析不同肝组织HGF mRNA表达；同时,用ELISA测定健康体检者、肝炎、肝硬化患者血清标本各20份及HCC患者57份术前1d、术后1周内血清标本的HGF浓度.多组间组织HGF mRNA水平比较用Kruskal-Wallis检验,两组间组织HGF mRNA水平比较用Mann-Whitney U检验.多组间血清HGF浓度比较用单因素方差分析,两组间血清HGF浓度比较用LSD-t检验.性别、年龄、肿瘤类型、肿瘤直径等临床因素对HCC患者组织、血清HGF水平的影响及其与患者预后的相关分析分别用Logistic回归分析及Cox比例风险模型.筛选出影响患者术后生存的独立预后指标,以中位数水平分层,由Kaplan-Meier生存曲线计算不同分层水平的死亡终点事件发生风险,并用Log-rank检验评价分层间死亡终点事件发生率.结果 实时荧光定量RT-PCR检测健康对照组、肝炎、肝硬化、N3、N2、N1、N0、HCC组HGF mRNA表达分别为0.99(0.78～1.66)、2.15 (1.06～3.40)、1.78(1.18～2.73)、4.59(2.67 ～8.63)、3.86(2.25 ～6.45)、3.12(1.59 ～5.74)、2.92(0.88 ～5.99)、0.48(0.19～1.06);ELISA检测血清HGF在健康体检者、肝炎、肝硬化及HCC患者术前1d、术后1周的浓度分别为(0.31±0.05)、(0.65±0.07)、(1.27 ±0.30)、(2.06±0.66)及(2.14±0.52)μg/L.不同肝组织相比,HGF mRNA在N3组织中表达高,而在HCC组织中的表达不仅低于以上各良性肝病组织,而且低于正常肝组织(U=196.50,P=0.03)；不同血清HGF浓度相比,HGF在肝炎、肝硬化、HCC患者血清中的浓度均明显高于健康对照组,且HCC患者术后1周的血清HGF浓度高于其术前血清HGF浓度(t=2.70,P＜0.01)；Logistic回归分析显示,HCC患者癌组织及血清HGF水平分别受肿瘤数目及Child-pugh肝功能分级影响,OR分别为0.15(95％ CI:0.03 ～0.72,P＜0.05)和0.13(95％口:0.27 ～0.89,P＜0.05).Cox比例风险模型分析显示,肿瘤组织HGF mRNA水平、血清HGF浓度是影响HCC患者术后生存的独立预后指标,OR分别为0.02(95％ CI:0.00 ～0.52,P＜0.05)和10.01(95％CI:1.16 ～86.23,P＜0.05).以肿瘤组织HGF mRNA 2-AACT中位数0.49对HCC患者进行分层分析显示,两组患者术后累计生存率差异无统计学意义(x2=0.13,P=0.72).以血清浓度中位数0.69 μg/L对HCC患者进行分层分析,HGF≥0.69 μg/L的HCC患者,其术后死亡的风险是HGF＜0.69 μg/L患者的2.84倍(95％ CI:1.03 ～7.92,P＜0.05).结论 HCC患者癌组织中HGF mRNA表达降低,但癌旁组织HGF mRNA表达和血清HGF浓度明显升高,且血清HGF浓度影响患者预后,检测血清HGF有望用于评估HCC患者预后.
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血清中肝细胞生长因子与系统性红斑狼疮活动性的关系
目的探讨血清中肝细胞生长因子(HGF)与系统性红斑狼疮(SLE)活动程度的关系和意义.方法采用双抗体夹心酶联免疫吸附测定法,检测30名健康人和36例SLE患者血清HGF水平,并分析其与SLE活动性变化关系.结果 SLE患者血清HGF水平(1 433.3±154.0 ng/L)明显高于正常对照组[(1 142.1±78.8 )ng/L,P<0.001];糖皮质激素治疗后血清HGF水平(1 101.1±100.20 )ng/L与治疗前(1 212.1±102.5)ng/L相比,差异有显著性意义(P<0.05); SLE患者活动期血清HGF(1 501.3±201.8)ng/L高于非活动期[(1 311.7±231.2) ng/L,P<0.05];非蛋白尿组(1 535.0±233.20) ng/L明显高于蛋白尿组[( 1 253.2±104.6 )ng/L ,P<0.001]; 关节炎组(1 512.3±238.1)ng/L明显高于非关节炎组[(1 293.4±71.8)ng/mL, P<0.01].结论 HGF可能与SLE的发病相关,血清HGF可作为反映SLE活动程度、肾脏损害及疾病进展或改善的一项指标.
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血清中肝细胞生长因子的检测与肝硬化发病相关性分析
肝细胞生长因子(HGF)在肝硬化和肝肿瘤发生、发展和转移均起着重要作用[1-3].我们采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测肝细胞癌(HCC)、肝硬化(LC)和慢性肝炎(CH)患者血清中的HGF水平,并对其与HCC、LC和CH的关系进行评价.
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肝细胞生长因子mRNA实时荧光定量PCR检测体系的建立及其在淋巴瘤诊断中的价值
目的 构建肝细胞生长因子(HGF)mRNA定量标准,建立实时荧光定量(FQ)-PCR检测体系,探讨其检测淋巴瘤的应用价值.方法 提取总RNA,行逆转录(RT)-PCR,获HGF cDNA目标片段并构建重组质粒,作为定量标准.设计第二引物对和探针,确定扩增条件,优化组分浓度,建立HGF mRNA实时FQ-PCR检测体系,并定量检测47例淋巴瘤患者[霍奇金病(HD)11例,非霍奇金淋巴瘤(NHL)36例;治疗后,获缓解34例,未缓解13例]和19例非肿瘤患者的淋巴组织标本中HGFmRNA表达.同时,用受试者工作特征(ROC)曲线法,评价其在淋巴瘤诊断中的敏感度和特异度.结果 本研究构建的HGF mRNA定量标准和实时FQ-PCR检测体系的标准曲线斜率为-3.513,相关系数为0.999,扩增效率达92.6%;批内、日内和日间变异系数分别为2.1%、4.0%和6.8%;灵敏性达2拷贝/μ1.HGF mRNA在淋巴瘤组的表达(6.425 4-2.172)显著高于非肿瘤对照组(0.317±0.192,t=15.883,P＜0.001),缓解组的表达(6.157±1.712)显著低于未缓解组(7.591±1.184,t=2.768,P＜0.05),但在HD组和NHL组的表达差异无统计学意义(P＜0.05).ROC曲线提示,当临床诊断临界值为3.316时,HGF mRNA对淋巴瘤诊断的敏感度和特异度分别为93.6%和100%.结论 本研究成功构建了HGF mRNA的定量标准和实时FQ-PCR检测体系,并可用于淋巴瘤的HGF mRNA定量检测.
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肝脏干细胞与肝脏再生
肝脏损伤与再生是传染病研究领域的重要课题.对肝脏损伤与修复中干细胞作用的研究进展很快,主要归纳为肝脏内源性和外源性干细胞两大部分.本文主要回顾和介绍了参与肝脏修复和再生的主要干细胞,并结合临床的进展,探讨对肝脏干细胞更深入的基础研究和临床应用的可能性.
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高血压患者血肝细胞生长因子与血管内皮功能的关系及干预研究
目的 研究高血压患者血清肝细胞生长因子(HGF)与血管内皮功能不全的相关性;氯沙坦/氢氯噻嗪复方片(海捷亚)是否可降低高血压患者血清HGF水平和改善血管内皮功能.方法 高血压(HT)患者70例,包括1级高血压(HT1组)患者27例、2级高血压(HT2组)患者31例、3级高血压(HT3组)患者12例.选择其中30例HT患者行海捷亚干预治疗.20例健康体检者为正常对照组.分别测定基线及海捷亚治疗后血清HGF、血浆内皮素(ET)和血清一氧化氮(NO)水平.结果 1) 血HGF和ET水平:HT3组高于HT2组、HT1组和对照组(P均＜0.05),HT2组和HT1组高于对照组(P均＜0.05),HT2组和HT1组之间无显著性差异(P值分别为0.061和0.162);血清NO水平:HT各组均低于对照组,且随着血压级别的增高而降低(P均＜0.05);2)相关分析结果显示:血清HGF与NO呈负相关、与ET呈正相关(相关系数分别为-0.633、0.741,P值均＜0.01);3)海捷亚治疗8周后血清HGF和ET明显降低,而血清NO明显增高(P值均＜0.01).结论 1)高血压患者血清HGF增高,其水平可能反映了血管内皮功能不全的严重程度;2)高血压患者应用海捷亚治疗后血清HGF水平下降、血管内皮功能改善.
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肝细胞生长因子对血管外膜成纤维细胞表型转化及迁移的作用
目的检测肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor/scatter factor , HGF)对血管外膜成纤维细胞(adventitial fibroblasts, AF)表型转化及迁移的影响,探索其在血管外膜重构中的可能作用.方法体外培养AF,以不同剂量(0、20、40、80 ng/ml)HGF刺激AF及40 ng/ml HGF刺激AF不同时间(0、4、16、24小时),蛋白免疫印迹方法(Western blotting)分析不同条件刺激后AF中α-平滑肌肌动蛋白(α-SM actin)的表达变化;用transwell检测不同浓度HGF对AF迁移的影响.结果 HGF可上调AF中α-SM actin表达,呈一定剂量依赖性和时间依赖性;40 ng/ml HGF可明显促进AF迁移,迁移细胞数目在一定范围内随着HGF浓度增加而增加.结论 HGF能诱导AF表型转化为肌成纤维细胞(myofibroblasts, MF),促进AF迁移,在血管外膜重构中可能具有一定作用.
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重型肝炎患者外周血干细胞因子水平及临床意义
目的: 探讨重型肝炎患者外周血干细胞因子(stem cell factor,SCF)与其肝损害程度及预后的关系.方法: 贵州省遵义医学院第一附属医院住院的肝炎患者45例及门诊体检者15例.肝炎患者分为急性肝炎组15例,慢性肝炎组16例和重型肝炎组14例;重型肝炎患者又分为好转组4例,死亡组10例.ELISA法检测各组血清SCF水平.结果: 重型肝炎患者血清SCF水平明显高于急性肝炎、慢性肝炎和健康对照组,差异具有统计学意义(2403.1±42.8 ng/L vs 2354.9±19.0ng/L,2376.7±16.4 ng/L,2358.4±16.0 ng/L,均P＜0.05).重型肝炎患者死亡组血清SCF水平明显高于好转组,差异有统计学意义(2418.1±50.7 ng/L vs 2376.3±11.7 ng/L,P＜0.05).血清SCF与肝细胞生长因子有明显正相关(r =0.38,P＜0.01).SCF与血清白蛋白、凝血酶原时间活动度呈明显负相关( P＜0.01).结论: 重型肝炎患者外周血清SCF水平随着肝损害程度加重而明显升高,提示严重肝损害时,肝再生可能需要干细胞的参与.
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骨髓间充质干细胞向肝细胞的诱导分化
目的:探索肝细胞生长因子(HGF)、制瘤素M(OSM)在体外诱导骨髓间充质干细胞(MSCs)向肝细胞分化的能力及效果.方法:分离、培养大鼠MSCs,取第3代按以下分组诱导其向肝细胞分化:A组:低糖杜氏改良培养基(DMEM-LG)+100 mL/L胎牛血清(fetal calf,serum,FCS);B组:肝细胞生长培养基(HGM);C组:HGM+20 μg/L HGF;D组:HGM+20 μg/L OSM;E组:HGM+20 μg/LHGF+20 μg/L OSM,于不同时间点用免疫细胞化学检测甲胎蛋白(AFP)、细胞角蛋白18(CK18)表达,高碘酸-希夫氏(PAS)染色检测糖原表达,谷氨酰胺脱氢酶法检测上清液尿素含量.结果:C,E组于诱导第7天出现AFP阳性表达,以后其阳性表达率随诱导时间延长逐渐降低,诱导第7天E组阳性表达率高于C组(χ2=6.322,P＜0.05).C组、E组分别于诱导第7、14天出现CK18阳性表达,于诱导第7天开始出现糖原阳性表达,随诱导时间延长表达率逐渐增高,同一时间点E组CK18(14 d:χ2=4.811,P＜0.05;21 d:χ2=6.902,P＜0.01;28 d:χ2=5.771,P＜0.05)及糖原(14 d:χ2=6.902,P＜0.01;21 d:χ2=6.818,P＜0.01;28 d:χ2=6.818,P＜0.01)阳性表达率高于C组.C,E组培养上清液中尿素浓度随诱导时间延长逐渐增高,E组增长幅度比C组高.A,B,D组各时间点均未见AFP、CK18、糖原表达及尿素浓度变化.结论:MSCs具有向肝细胞分化的能力,HGF能够诱导MSC s分化肝样细胞,OSM与HGF联合使用,能促进MSCs的分化,明显提高分化率.
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肝细胞生长因子对肝细胞癌侵袭和转移的影响
目的:研究HGF对肝细胞癌SMMC-7721的上皮-间叶转化的作用,并对其机制进行探讨.方法:HGF处理SMMC-7721后,应用细胞培养、Transwell、划痕实验、WB技术研究HGF对肝癌细胞SMMC-7721上皮-间叶转化的作用.并应用P13 kinase抑制物LY294002 10umol/L顸处理细胞,观察SMMC-7721的变化,研究P13 kinase对于HGF作用机制的影响.结果:Transwell和划痕实验显示HGF处理的细胞侵袭和转移能力增强,蛋白印迹结果显示HGF处理的细胞的N-cad、MMP-2、MMP-9和Vimentin的表达增加,E-cad的表达减少.LY294002预处理后,细胞不再受HGF的影响,细胞的形态没有明显变化.Transwell和划痕实验结果与未经处理的SMMC-7721相同.蛋白印迹结果显示:细胞的N-cad、MMP.2、MMP-9、Vimacntin和E-cad的表达变化不明显.结论:HGF能够促进SMMC-7721的上皮间叶转化,这种作用通过PD Kinase实现.
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不同诱导条件对大鼠骨髓间充质干细胞体外诱导类肝细胞的影响
目的:探讨实验性大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)体外培养、诱导的优条件,为MSCs治疗临床重症肝病患者提供参考依据.方法:采用密度梯度离心法和贴壁法分离大鼠MSCs.经培养传代获得纯化的MSCs.采用析因实验,设不同诱导时间、不同浓度的FBS、不同浓度的细胞因子为3个因素,每个因素设不同水平,对纯化的MSCs进行分组诱导培养.留取15、2l、27 d细胞培养液进行白蛋白(A1b)、甲胎蛋白(AFP)检测;于27 d时收集细胞爬片,采用过碘酸希夫(PAs)实验进行糖原染色和免疫细胞化学染色检测MSCs中CK-18和CK-19.结果:诱导15、21、27 d,各MSCs诱导组AFP水平均高于MSCs非诱导组(P＜0.01),21 d诱导组AFP水平高:15 d各MSCs诱导组与MSCs非诱导组白蛋白水平无统计学意义,21、27d各MSCs诱导组白蛋白水平均高于MSCs非诱导组(P＜0.01),27 d诱导组白蛋白水平高.27d各MSCs诱导组糖原染色阳性,免疫细胞化学染色CK-18、CK-19均阳性,而MSCs非诱导组糖原染色、CK-18、CK-19均阴性.多因素方差分析表明,Mscs体外佳诱导条件为含200mL/LFBS的DMEM+肝细胞生长因子(HGF)20Ug/L+成纤维细胞生长因子-4(FGF-4)20UG/L.结论:HGF和FGF-4可在体外诱导实验性大鼠Mscs分化为具有肝细胞样细胞表型和功能的类肝细胞:不同浓度的FBS、HGF和FGF-4影响MSCs的体外分化;MSCs可作为治疗临床重症肝病的一种细胞来源.
关键词： 骨髓 间充质干细胞 类肝细胞 肝细胞生长因子 成纤维细胞生长因子-4 -
大鼠骨髓间充质干细胞向类肝细胞体外诱导分化
目的:观察不同条件下骨髓间充质干细胞(MSCs)体外诱导分化为类肝细胞的差异.方法:Wistar大鼠24只随机均分为3组,分别为正常对照组、肝纤维化模型组、自拟中药干预组.采用CCl4乳剂皮下注射建立肝纤维化模型.造模成功后中药干预组采用丹金舒肝胶囊药液灌胃治疗.治疗结束后剖杀大鼠,留取大鼠肝脏标本,HE染色观察各组病理改变.采用密度梯度离心法和贴壁法分离各组大鼠的MSCs,经培养传代获得纯化的MSCs.各组纯化的MSCs采用HGF、FGF-4进行诱导培养.留取15、21、27 d细胞培养液进行白蛋白(Alb)、甲胎蛋白(AFP)检测;于27 d收集细胞爬片,进行糖原染色和CK-18免疫细胞化学染色.结果:3组15、21和27 d各MSCs诱导组AFP水平均高于MSCs非诱导组(P<0.01),其中21 d AFP水平高(肝纤维化模型组:48.94±0.08 vs 9.90±0.09;中药干预组:49.86±0.29vs 8.69±0.62;正常对照组:38.65±0.33 vs9.04±0.11,均P<0.01);3组15 d各MSCs诱导组与MSCs非诱导组白蛋白水平无统计学意义:21 d、27 d各MSCs诱导组白蛋白水平均高于MSCs非诱导组(1.11±0.08 vs 0.32±0.00,1.25±0.04 vs 0.32±0.00,1.06±0.03 vs 0.33±0.00;1.52±0.02 vs 0.33±0.00,1.79±0.01vs 0.31±0.03,1.63±0.04 vs 0.32±0.01,均P<0.01),27 d高.27 d各MSCs诱导组糖原染色阳性,免疫细胞化学染色CK-18均阳性,而MSCs非诱导组糖原染色、CK-18均阴性.从AFP、Alb水平综合比较,3组诱导效果发现自拟中药干预组优于其他2组.结论:HGF、FGF-4可在体外诱导实验性大鼠的MsCs分化为具有肝细胞样细胞表型和功能的类肝细胞:自体MSCs可以作为治疗临床重症肝病的一种细胞来源,而临床联合中药复方治疗可能会使MSCs体外诱导的效果更为理想.
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携带肝细胞生长因子基因的减毒沙门氏菌在大鼠胃溃疡治疗中的组织分布
目的: 阐明携带肝细胞生长因子(HGF)基因的减毒沙门氏菌在大鼠胃溃疡治疗中的组织分布规律,为HGF在胃溃疡基因治疗中的实际应用提供依据.方法:乙酸诱发80只大鼠胃溃疡模型,随机分成2组:HGF灌胃组(40只)和绿色荧光蛋白(GFP)灌胃组(40只).将携带HGF和GFP基因真核表达质粒的减毒沙门氏茵分别给予大鼠灌胃,每只0.2mL,隔日1次,共3次.GFP灌胃组第1、3、5、7、9天分别处死大鼠3只,取胃、肠、肝、脾及肾组织制备成冰冻切片,荧光显微镜下观察目的基因组织分布;HGF灌胃组第1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21天分别处死大鼠3只.ELISA方法检测HGF在各组织中的表达;PCR方法检测真核表达载体在组织中的分布.结果:GFP组大鼠在荧光显微镜下观察到胃、肠组织有较强的荧光,在肝、脾、肾组织有微弱的荧光,荧光强度在第5、7天达到峰值;HGF组大鼠胃、肝、脾、肾、大肠、小肠组织,均检测到有HGF表达,但胃、肠组织中表达较高;大鼠胃、肝、脾、肾、大肠、小肠均可检测到真核表达载体的启动子CMV片段.结论:在大鼠胃溃疡治疗中,减毒沙门氏茵作为细胞载体以po方式可将携带目的基因的真核表达载体相对靶向性转入胃、肠组织中.
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肝细胞生长因子抗肝纤维化作用及对MMP-1,TIMP-1表达的影响
目的:研究肝细胞生长因子对实验性大鼠肝纤维化的防治作用,及其对大鼠肝脏基质金属蛋白酶1(MMP-1)抑制因子1(TIMP-1)表达的影响,探讨HGF抗肝纤维化作用的可能机制.方法:将Wistar ♂大鼠80只随机分为正常对照组(A组,16只),肝纤维化模型组Ⅰ(B组,54只),HGF治疗组Ⅰ(C组,10只),采用CCl4复合因素造模,治疗组于造模同时予HGF 0.5 μg/Kg,ip,qd,6 wk末造模成功处死C组大鼠,同时随机处死A组及B组大鼠各6只;对B组剩下大鼠行二次随机分组为模型对照组Ⅱ(D组,12只),HGF治疗组Ⅱ(E组,1 0只),E组于第7周开始给予HGF治疗,10 wk末处死大鼠.检测大鼠肝功能,血清透明质酸(HA),层粘蛋白(LN),Ⅲ型前胶原(PcⅢ),Ⅳ型胶原(CIV);免疫组化法检测肝组织MMP-1,TIMP-1的表达.结果:C组与B组比较,ALT,AST,HA,LN,CIV,PcⅢ均显著降低(P＜0.01),MMP-1活性升高(0.25±0.02,vs0.22±0.05,P＜0.05):TIMP-1活性明显降低(0.34±0.05,vs0.45±0.05,P＜0.01).E组与D组相较,MMP-1活性变化无显著性,TIMP-1活性有明显降低(0.31±0.07,vs0.42±0.06,P＜0.01).结论:肝细胞生长因子对肝纤维化有明显的防治作用,并可能通过促进MMP-1的活性或抑制TIMP-1活性而促进肝纤维化降解.
