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尿毒症毒素硫酸盐对甲酚对血管内皮细胞的体外作用
目的 探讨尿毒症毒素硫酸盐对甲酚(PCS)对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的毒性作用及机制.方法 体外培养HUVECs,不同浓度对甲酚硫酸钠盐作用HUVECs,WST-1法检测细胞增殖;Matrigel法检测细胞成血管能力;特异性荧光探针2',7'-二氯荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)检测细胞活性氧自由基(ROS)水平;实时定量聚合酶链反应(Real-time PCR)及免疫印迹法(Western blotting)检测细胞中炎症因子及黏附分子表达情况.结果 硫酸盐对甲酚对HUVECs增殖及成血管能力未有显著影响,分子机制研究发现,其能显著诱导细胞中ROS水平上调并促进其分泌炎症因子白细胞介素(IL)-1β、肿瘤坏死因子-a(TNF-a)及细胞间黏附分子-1(ICAM-1).结论 尿毒症毒素硫酸盐对甲酚可以加剧血管内皮细胞氧化应激及炎症反应状态,提示其可能参与慢性肾病患者动脉粥样硬化的发生发展.
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氧化低密度脂蛋白诱导巨噬细胞泡沫化氧化损伤后血管紧张素转化酶2的表达变化及意义
目的 观察氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导巨噬细胞泡沫化后血管紧张素转化酶2(ACE2)的表达变化与氧化应激损伤的关系,探讨ACE2的抗氧化作用.方法 用不同浓度ox-LDL诱导小鼠巨噬细胞RAW 264.7泡沫化,油红O染色观察巨噬细胞内脂质堆积变化,并定量分析细胞内脂滴含量,通过检测细胞上清中丙二醛(MDA)含量鉴定细胞氧化损伤程度,实时定量聚合酶链反应(Real-time PCR)检测ACE2及MAS mRNA表达,化学比色法检测超氧化物歧化酶(SOD)活性与还原型谷胱甘肽(GSH)的含量.结果 不同浓度(20、40、60、80mg/L)ox-LDL处理巨噬细胞24 h,油红O染色可见巨噬细胞变大、变圆,胞质内脂滴含量呈剂量依赖性增加;用60mg/Lox-LDL诱导巨噬细胞泡沫化模型组中MDA含量较对照组明显升高(P＜0.01);Real-time PCR结果显示,模型组ACE2和MAS mRNA表达水平较对照组显著减少(P＜0.05);与对照组比较,模型组中SOD活性与GSH含量显著降低(P＜O.05或P＜0.01).结论 巨噬细胞泡沫化氧化损伤进程与ACE2及其下游受体MAS表达下调密切相关,提示ACE2具有一定的抗氧化作用,其机制可能与SOD及GSH有关.
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转化生长因子-β1和丹参酮Ⅱ A联合诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞的分化
目的 探讨转化生长因子-β1(TGF-β1)与丹参酮Ⅱ A(tanshinone Ⅱ A)联合诱导对大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)定向分化为心肌样细胞的影响.方法 采用全骨髓贴壁法从10只SD大鼠四肢骨中分离、培养BMSCs,流式细胞术对培养的细胞进行鉴定.对第2代BMSCs作定向诱导,根据加入诱导剂的不同分为TGF-β1组、tanshinone Ⅱ A组、两者联合诱导组及实验对照组(不加任何诱导剂).诱导72h后更换为常规培养基继续培养,相差显微镜观察培养细胞的形态学变化;各组培养4周后,应用免疫细胞化学染色法检测原肌球蛋白(TPM)、缝隙连接蛋白43(Cx43)以及心肌肌钙蛋白Ⅰ(cTnⅠ)的表达情况;实时定量PCR(Real-time PCR)法检测各组BMSCs在诱导培养的第1、2、4周心肌早期转录因子GATA-4、Nkx2.5的表达情况;透射电子显微镜观察分化细胞的超微结构变化.结果 实验对照组细胞TPM、Cx43及cTnⅠ均为弱阳性或阴性表达.与实验对照组相比,TGF-β1组、Tanshinone Ⅱ A组及两者联合诱导组BMSCs以上各标记物的阳性表达均明显升高,差异均具有统计学意义(均P＜0.05).其中,两者联合诱导组各标记物的阳性表达均显著高于TGF-β1及TanshinoneⅡA单独诱导组.Real-time PCR结果显示,在诱导第1周时TGF-β1组、Tanshinone Ⅱ A组及两者联合诱导组GATA-4及Nkx2.5基因表达均强,随后表达减弱至不表达.1周时,联合诱导组GATA-4 mRNA相对表达量是实验对照组的3.7倍,Nkx2.5 mRNA相对表达量是实验对照组的2.9倍,差异均具有统计学意义(均P＜0.05).透射电子显微镜结果显示,各诱导组均可见分化的细胞呈杆状,胞核卵圆形,位于细胞中央,胞质中可见平行排列的肌丝、粗面内质网和线粒体等细胞器.结论 TGF-β1、tanshinone Ⅱ A均可分别及联合诱导BMSCs获得心肌分化表型,且两者联合诱导效果优于单一诱导.
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稳定表达α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸受体GluA1亚基单克隆细胞株的构建
目的 构建稳定表达α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸(AMPA)受体GluA1亚基的细胞株.方法 PCR扩增GluA1目的基因,并将其装载至慢病毒表达载体PLV.0-绿色荧光蛋白(GFP),采用4质粒系统转染HEK293T细胞包装慢病毒.嘌呤霉素抗性筛选细胞,挑选单克隆细胞株用Real-time PCR、Western blotting、免疫荧光和全细胞膜片钳鉴定GluA1的表达与功能.结果 菌落PCR鉴定扩增产物与GluA1分子量(2724 bp)一致,经测序插入慢病毒载体序列与GluA1序列一致;慢病毒感染并抗性筛选的HEK293T细胞经Real-time PCR、Western blotting和免疫荧光实验证明,GluA1在过表达GluA1组的HEK293T细胞正确表达,空载体组不表达.单克隆挑选的稳定细胞株免疫荧光染色显示,各细胞膜表面GluA1蛋白表达相对一致.单克隆细胞在电压钳模式下,细胞外液加10 mmol/L谷氨酸诱导,空载体组检测不到电信号,而过表达GluA1组可记录5～ 40 pA电信号.结论 成功构建了稳定表达AMPA受体GluA1亚基的HEK293T细胞株.
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葡萄糖转运蛋白2在人脐带间充质干细胞向胰岛前体细胞分化过程中表达的变化
目的 探讨葡萄糖转运蛋白2(Glut2)在人脐带间充质干细胞(hUMSCs)向胰岛前体细胞分化过程中的表达变化.方法 分离、培养、鉴定及诱导hUMSCs,分别收集诱导过程中第7天、14天和21天细胞和细胞上清液,采用免疫细胞化学、ELISA、免疫荧光、Western blotting及Real-time PCR检测诱导后细胞相关蛋白和基因的表达.结果 免疫组织化学检测诱导后细胞胰腺十二指肠同源盒基因-l(PDX-1呈阳性表达;免疫荧光检测诱导后细胞Ngn3和胰岛素呈阳性表达;Western blotting检测Glut2在诱导过程中逐渐升高,诱导14 d达到峰值,与正常组比较P ＜0.01;Real-time PCR显示,Glut2基因自第7天即增高(P＜0.05).结论 hUMSCs经诱导后分化为胰岛前体细胞,表达Glut2后能引起胰岛素分泌,已初步具有胰岛B细胞功能.
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姜黄素对猪脂肪间充质干细胞成脂分化及Krüppel样因子2表达的影响
目的 探讨姜黄素对猪脂肪间充质干细胞(AMSCs)成脂分化的影响,及姜黄素调控成脂分化的机制.方法 用不同浓度姜黄素处理猪AMSCs,用MTT比色法检测姜黄素对猪AMSCs增殖的影响,用油红O染色提取法检测对成脂分化的程度,用实时定量聚合酶链反应(Real-time PCR)检测对Krüppel样因子(KLF2)和过氧化物酶增殖物激活受体γ(PPARγ)2 mRNA表达的影响.结果 当姜黄素浓度为1、5、10lμmol/L用于猪AMSCs时对,AMSCs增殖无明显影响,但高于15.μmol/L时,则具有显著的抑制作用(P＜0.05);当姜黄素用于猪AMSCs的成脂诱导分化时,1 ～ 30μmol/L的浓度即能显著抑制成脂分化(P＜0.05),其中25 μmol/L浓度获得68.19％的高抑制率;当25 μmol/L姜黄素用于检测KLF2和PPARy2 mRNA的表达,诱导分化2、8和16d的KLF2 mRNA的表达上调率分别达到48.37％、20.56％和9.64％,而PPARγ2 mRNA的表达下调率分别达到16.01％、35.93％和27.27％.结论 姜黄素具有抑制猪AMSCs增殖和成脂分化作用,该抑制作用与姜黄素促进KLF2 mRNA的表达和抑制PPARγ2 mRNA的表达相关.
关键词： 姜黄素 Krüppel样因子2 脂肪间充质干细胞 成脂分化 实时定量聚合酶链反应 猪 -
体内转染血管内皮生长因子基因对慢性低氧诱导小鼠肺动脉高压的影响
目的 探讨血管内皮生长因子(Vegf)体内转基因对慢性低氧诱导小鼠肺动脉高压(PAH)的治疗作用.方法 将昆明雄性小鼠36只随机分为3组:低氧Vegf治疗组(P-V组),模型组(PAH组),对照组(C组),每组12只.采用间断性常压缺氧法复制小鼠PAH模型.观察4周后,P-V组经尾静脉注射聚乙烯亚胺(PEI)包被的pBudCE4.1-Vegf-EGFP载体,其他组注射等量生理盐水,继续低氧处理.转基因治疗后30 d,观察小鼠的一般情况、平均肺动脉压(mPAP)、动脉血气、右心肥大指数[右心室/(左心室+室间隔)]及肺小动脉形态学改变,RT-PCR方法检测增强绿色荧光蛋白(EGFP)表达情况;Real-time PCR方法检测各实验组肺组织Vegf mRNA量;ELISA方法及硝酸还原酶法分别检测各实验组肺组织VEGF和NO含量.结果 PAH组小鼠出现代谢性酸中毒,平均肺动脉压升高,右心室肥厚,肺小动脉管壁厚度(WT)增加,与C组相比,差异有统计学意义(P＜0.05).与PAH组相比,P-V组小鼠平均肺动脉压升高、右心室肥厚及肺小动脉管壁增厚减轻,差异有统计学意义(P＜0.05).与PAH组小鼠相比,P-V组小鼠外源基因Vegf的mRNA及蛋白水表达增加,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 Vegf转基因治疗能上调慢性低氧诱导小鼠的肺组织中Vegf mRNA和VEGF的表达,从而拮抗肺动脉压升高,减轻右心肥厚及肺动脉血管增厚.
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阿霉素致人诱导性多潜能干细胞来源的心肌细胞损伤模型的建立
目的 利用人诱导性多潜能干细胞来源的心肌细胞(hiPSC-CMs) 技术,建立人源的阿霉素心肌细胞损伤模型.方法 从人诱导性多潜能干细胞分化hiPSC-CMs,再用不同浓度阿霉素对hiPSC-CMs作用24 h后检测其细胞活性、钙瞬变、氧化应激和DNA损伤等表型.结果 阿霉素诱导hiPSC-CMs细胞活力下降,破坏其钙瞬变,引起氧化应激水平上升,导致线粒体膜电位下降和造成DNA损伤,同时右丙亚胺对阿霉素心肌细胞损伤有保护作用.结论 利用hiPSC-CMs成功建立了人源阿霉素心肌细胞损伤模型,克服了人心肌细胞难以获得及对药物反应存在种属差异的局限性,更好地用于阿霉素心脏毒性的机制研究及药物筛选.
关键词： 阿霉素 心脏毒性 人诱导性多潜能干细胞 心肌细胞损伤模型 免疫荧光 实时定量聚合酶链反应 -
小鼠骨髓间充质干细胞向胰岛素分泌细胞诱导分化过程中调控PDX-1基因表达miRNAs的鉴定
目的 实现小鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)向胰岛素分泌细胞(IPCs)的诱导分化并对分化过程中可能调控胰十二指肠同源异型盒基因-1(PDX-1)基因表达miRNAs进行鉴定.方法 首先分离培养BMSCs,应用conophylline和尼克酰胺将其诱导分化为IPCs,采用双硫腙(DTZ)染色和免疫荧光检测胰岛素的表达.然后采用靶基因预测软件miRanda和Target Scan对调控PDX-1基因表达miRNAs进行预测并通过双荧光素酶报告基因系统鉴定.实时定量聚合酶链反应(Real-time PCR)检测诱导分化过程中miRNAs及PDX-1的表达.结果 诱导分化后的细胞双硫腙染色呈猩红色,免疫荧光化学显示有胰岛素表达.生物信息学方法预测得到4个可能调控PDX-1表达的miRNAs,通过双荧光素酶报告基因系统检测发现其中的miR-149和miR-346能结合到PDX-1 mRNA的3'UTR并有效抑制其表达.Real-time PCR检测结果表明,miR-149和miR-346的表达水平与PDX-1表达呈负相关.结论 miR-149和miR-346能负性调控IPCs诱导分化过程中PDX-1的表达.
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利用CRISPR/Cas9系统构建4T1细胞CXCR4基因敲除稳定细胞株
目的 利用CRISPR/Cas9系统敲除4T1细胞中的CXCR4基因,构建稳定敲除CXCR4基因的4T1细胞株.方法 根据CRISPR/Cas9靶点设计原则,在美国国立生物技术信息中心(NCBI) 上找到CXCR4基因序列的外显子区域,设计两条sgRNA,用LentiCRISPRv2作为载体构建LentiCRISPRv2-sgRNA重组质粒并转化至感受态的Stbl3菌体中,挑取单克隆测序验证并扩大培养提质粒后转染至293T细胞中包装成慢病毒.收集病毒并感染4T1细胞,通过嘌呤霉素筛选并用有限稀释法分离培养出单克隆细胞.提取筛选出的单克隆细胞基因组DNA并对敲除位点附近的DNA片段进行PCR扩增并测序;用Real-time PCR检测细胞株CXCR4基因mRNA表达情况;用免疫印迹法检测CXCR4蛋白质的表达情况.结果 LentiCRISPRv2-sgRNA重组质粒构建成功;经过基因组DNA片段PCR扩增测序得1株缺失27 bp的稳定敲除CXCR4基因的细胞株;细胞株CXCR4mRNA的表达量低且几乎无CXCR4蛋白质的表达.结论 通过CRISPR/Cas9系统获得靶向敲除CXCR4基因的重组质粒,并筛选出稳定敲除CXCR4基因的细胞株.
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斑马鱼胚胎发育过程成纤维细胞生长因子受体基因时序性表达
目的 探讨斑马鱼胚胎发育过程成纤维细胞生长因子(FGF)受体基因时序性表达规律.方法 分别提取发育至4、6、10、12、18、24、48及72hpf斑马鱼胚胎总RNA并反转录为cDNA,用实时定量PCR方法检测FGF受体基因(fgfrs) mRNA的相对表达量.结果 斑马鱼胚胎发育过程fgfrs mRNA动态表达水平有明显峰谷变化(P＜0.01),胚胎fgfrs开始表达阶段依次为fr1a与fgr1b(囊胚期)、fgfr4(原肠胚初期)、fgfr2(原肠胚期)及fgfr3(原肠胚后期),其表达高峰期分别在原肠胚期、原肠胚后期、体节期及胚胎发育中后期.旁系同源基因fgfr1a与fgfr1b动态表达趋势相似(r =0.830,P＜0.05).fr1a与fgfr3、fgfr1b与fgfr4、fgfr2与fgfr3 mRNA表达量之间相关分析也有意义(r值分别为-0.726,0.821及0.772,P＜0.05).结论 斑马鱼胚胎发育过程fgfrs时序性表达有一定规律性,fgfr1、fgfr4主要参与胚胎早期发育调控,fgfr2、fgfr3主要参与胚胎中、后期发育调控.fgfr1a与fr1b共表达使其调控作用具有冗余能力.fgfr1和fgfr3之间在表达上可能存在相互制约关系.
关键词： 胚胎发育 成纤维细胞生长因子受体 基因表达 实时定量聚合酶链反应 斑马鱼 -
人端粒酶反转录酶启动子调控的microRNA-21海绵抑制剂慢病毒载体的构建及功能分析
目的 构建由人端粒酶反转录酶(hTERT)启动子调控的microRNA-21(miR-21)海绵抑制剂慢病毒载体,探讨该重组慢病毒载体对端粒酶阳性肿瘤的特异性抑瘤作用及其机制.方法 将hTERT启动子核心序列取代慢病毒载体RFP上游的CMV启动子;将重组成功的慢病毒载体Lenti-hTERT-miR-21-sp感染端粒酶阴性细胞HBE及端粒酶阳性肿瘤细胞A549、H1299,观察RFP的表达情况;同时在肿瘤细胞中检测抑制miR-21表达后对细胞生长、凋亡的影响;并应用含人类全长基因的cDNA表达谱芯片,对抑制miR-21表达后人肺癌细胞株A549中差异表达基因进行分析.结果 经酶切及测序法鉴定慢病毒载体构建成功;将包装后获得的高滴度病毒颗粒感染目的细胞后,发现重组病毒只能在端粒酶阳性肿瘤细胞中特异性高表达,且下调miR-21基因表达后,肿瘤细胞的生长能力受到抑制,凋亡率明显上升(P＜0.05);与对照相比,抑制miR-21表达的A549细胞中差异表达的基因共有64条,其中20条上调,44条下调.结论 hTERT启动子能够严格地引导病毒载体在端粒酶阳性肿瘤细胞中特异性的封闭miR-21的表达,实现抑制肿瘤细胞生长的作用;芯片结果提示,miR-21引发肺癌可能是多因素多基因共同作用的结果.
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Krüppel样因子4在猪脂肪间充质干细胞成脂分化过程中的表达模式
目的 探讨猪脂肪间充质干细胞(AMSCs)成脂分化过程中Krüppel样因子4(KLF4)的表达模式.方法 采用F3代以上猪AMSCs进行成脂诱导分化,用油红O染色提取法检测成脂分化程度,用RT-PCR和Real-time PCR检测KLF4的表达模式.结果 猪AMSCs成脂诱导分化,诱导3d开始出现脂肪滴,诱导10 d时成脂分化率达60％;RT-PCR检测,在诱导分化2、4、8、12和16d时都能检测出KLF4的表达;经Real-time PCR检测,上述各诱导分化时间点的表达量分别为对照组的1.6657±0.2269、2.6790±0.0524、2.6293±0.0280、2.3633±0.1568和2.6146±0.1575倍.这些结果表明,KLF4的表达在猪AMSCs成脂诱导分化的第2天就有显著上调,表达高峰出现在成脂分化的第4天,此后持续高表达.结论 在猪AMSCs成脂分化过程中,从早期到晚期,KLF4发挥持续性的调控作用.
关键词： 脂肪间充质干细胞 成脂分化 Krüppel样因子4 实时定量聚合酶链反应 猪 -
GADD45α对大鼠部分肝切除后肝脏再生的调控作用
目的 探讨生长阻滞和DNA损伤诱导基因GADD45α在大鼠部分肝切除(PH)后肝再生中的作用及其调节机制.方法 将114只大鼠随机分为19组,2/3肝切除9组,手术对照9组,正常对照1组,制作大鼠部分肝切除模型,然后用大鼠基因组芯片Rat Genome 230 2.0检测部分肝切除后再生肝的基因表达变化,采用实时定量PCR技术验证芯片检测结果.利用谱函数(Ep)分析基因表达变化预示的生理活动改变,进而通过IngenuityPathway Analysis(IPA)汇总GADD45α调控肝再生的信号通路并分析其可能的分子机制.结果 GADD45α在PH后2 ～6h、24h和36～72h均表达上调,GADD45α通过NF-κB、p38PRAK、p53、STAT3-p21、STAT3-Bcl-2、STAT3-cMyc等6条途径参与大鼠部分肝切除后的肝脏再生调控.谱函数分析发现,GADD45α调控的生理活动的变化情况基本与大鼠肝再生进程相符.结论 GADD45α在大鼠肝再生中可能通过上述信号通路调控细胞增殖、细胞周期和细胞存活等生理活动,进而调节肝脏的再生.
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MiR-382促进大鼠正常肝细胞BRL-3A增殖
目的 探讨miR-382对大鼠正常肝细胞BRL-3A增殖和凋亡的影响.方法 BRL-3A细胞瞬时转染miR-382的模拟物和抑制物48 h,MTT法测定细胞活性;流式细胞术检测细胞周期;Real-time PCR检测细胞增殖和凋亡相关基因的表达情况.结果 在大鼠BRL-3A细胞中,转染模拟物可以显著增加miR-382的表达,转染抑制物可以显著降低miR-382的表达(P＜0.01).MTT检测表明,miR-382过表达后,BRL-3A细胞活性明显提高;流式细胞术检测表明,miR-382过表达组S期的细胞数明显增加,而miR-382干涉组S期的细胞数明显减少;用Real-timePCR检测细胞增殖/凋亡相关基因mRNA表达水平表明,miR-382过表达后,BRL-3A细胞增殖相关基因增殖细胞核抗原(PCNA)、Bcl-2和Ccnd1的mRNA表达水平上调,细胞凋亡相关基因Caspase-3和Bax的mRNA表达水平下调,而miR-382干涉组与上述结果相反.结论 miR-382通过促进细胞增殖相关基因表达,抑制细胞凋亡相关基因表达而促进大鼠正常肝细胞BRL-3A增殖.
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何首乌饮对衰老大鼠生精细胞线粒体凋亡通路关键基因表达的影响
目的 探讨何首乌饮对衰老大鼠睾丸生精细胞线粒体凋亡通路关键基因表达的影响.方法 选用12月龄Wistar雄鼠45只,随机分为3组:青年对照组、自然衰老组、何首乌饮组,每组15只,何首乌饮组和自然衰老组于16个月开始分别灌胃何首乌饮和等量蒸馏水,连续60d.青年对照组于12月龄,其余两组于18月龄分别进行实验,通过Real-time PCR、免疫荧光染色和免疫印迹法,观察各组大鼠睾丸组织线粒体凋亡通路关键基因DR6、BAX、Caspase-3、Cyt-C、14-3-3σ的表达变化.结果 自然衰老大鼠线粒体凋亡通路关键基因14-3-3σ表达明显低于青年对照组,DR6、BAX、Caspase-3、Cyt-C表达明显高于青年对照组;而何首乌饮用药后能明显逆转上述现象.结论 何首乌饮提高衰老大鼠精子质量与线粒体凋亡通路有关.
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姜黄素对猪骨髓间充质干细胞增殖和成脂分化的影响
目的 探讨姜黄素(curcumin)对猪骨髓间充质干细胞(BMSCs)增殖和成脂分化的影响及机制.方法 用含不同浓度姜黄素的细胞培养液和诱导分化液,培养和诱导分化猪BMSCs,用MTT比色法检测对BMSCs增殖的影响,用形态学和油红O染色提取法检测对成脂分化的影响,用实时荧光定量PCR(Real-time PCR)检测对成脂分化相关基因过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ2)和脂蛋白脂肪酶(LPL) mRNA表达的影响.结果 当姜黄素用于猪BMSCs的培养,1μmol/L浓度在培养第3天、第5天和l0μmol/L浓度在培养第5天开始能够显著促进细胞增殖(P＜0.05),但高于15μmol/L则具有显著的抑制作用(P＜0.05);当姜黄素用于猪BMSCs的成脂诱导分化,所用不同浓度的姜黄素都能显著抑制成脂分化(P＜0.05),用0.5 μmol/L获得28.3％的抑制率,而用20μmol/L获得71.24％的高抑制率;当用20μmol/L姜黄素处理和分别诱导分化5、10和15d,PPARγ2 mRNA表达的抑制率分别达到19.11％、49.52％和76.76％,LPL mRNA表达的抑制率分别达到37.58％、49.32％和74.70％.结论 适当浓度姜黄素具有促进猪BMSCs增殖和抑制猪BMSCs向脂肪细胞分化的作用,对脂肪细胞的分化发挥了重要调控作用.
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白细胞介素-34／集落刺激因子-1R在转化生长因子-β1诱导 A549细胞上皮-间质转化中的表达
目的：探讨白细胞介素-34/集落刺激因子-1受体（IL-34/CSF-1R）在转化生长因子-β1（TGF-β1）诱导A549细胞发生上皮-间质转化（ EMT）中的表达。方法体外培养A549细胞；CCK 8法检测不同浓度TGF-β1在不同时间点对A549细胞增殖的影响；选用5μg/L TGF-β1刺激A549细胞（0、12、24、48h），提取细胞蛋白和RNA， Western blotting法检测α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、E-钙黏连蛋白（E-Cad）、基质金属蛋白酶-2（MMP-2）、基质金属蛋白酶-9（ MMP-9）、基质金属蛋白酶抑制剂-1（ TIMP-1）蛋白的变化；Real-time PCR 法检测 IL-34、CSF-1R、MMP-2、MMP-9基因表达的变化。结果 TGF-β1对A549细胞的增殖无明显影响（ P＞0.05）。 TGF-β1刺激A549细胞后，间质细胞标志性蛋白α-SMA表达升高，上皮细胞标志性蛋白E-Cad表达下降，纤维化相关的MMP-2蛋白表达升高，MMP-9蛋白表达先升高后下降，TIMP-1蛋白早期出现短暂性增高后，呈持续降低趋势（ P＜0.01）。 IL-34 mRNA表达逐渐升高，CSF-1R mRNA、MMP-2 mRNA、MMP-9 mRNA表达先升高后下降（P＜0.01）。结论 TGF-β1诱导A549细胞的EMT过程中，存在IL-34/CSF-1R的动态表达。
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斑马鱼胚胎发育过程中miR-9、miR-219及Dicer基因的时序性表达
目的 探讨斑马鱼胚胎发育过程中miR-9、miR-219及Dicer基因时序性表达规律.方法 取正常发育至受精后4、8、12、16、20、24、36、48和72 h(hpf)斑马鱼胚胎各约40枚,用Trizol法分别提取总RNA,茎环法反转录为cDNA,用Real-time PCR检测胚胎miR-9、miR-219及Dicer表达量.结果 miR-9、miR-219及Dicer表达水平在胚胎发育过程中呈现峰谷变化,不同发育阶段之间总的差异有统计学意义(P＜ 0.05).与胚胎发育全程的基因平均表达水平相比,miR-9在8 hpf之前表达量较低(P＜0.05),36 hpf后表达量持续增高,48 hpf和72 hpf时表达量显著高于平均水平(P＜0.01).miR-219在8 hpf之前表达量也处于较低水平(P＜0.05),20 hpf后迅速增高,24hpf时达到峰值,并持续到48 hpf(P ＜0.01).Dicer在胚胎早期(4 hpf)就有明显表达(P＜0.05),随后表达水平迅速下降,16 hpf时达到低点(P＜0.05),然后逐渐回升,直至胚胎末期.结论 斑马鱼胚胎发育过程miR-9、miR-219及Dicer时序性表达有一定规律,miR-9主要在胚胎后期表达,miR-219主要在胚胎中期表达,Dicer主要在胚胎早期表达,其次在胚胎后期,提示miR-9、miR-219及Dicer参与胚胎发育调控过程.
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G蛋白耦联受体30对去卵巢小鼠子宫中toll样受体4分布与表达的影响
目的 探讨雌激素膜性受体G蛋白耦联受体30(GPR30)在子宫免疫中的作用.方法 将80只小鼠分为假手术(sham)组、卵巢摘除(OVX)组、OVX注射0.1nmol、0.5nmol和2.5nmol GPR30激动剂G1组及OVX小鼠注射0.1 nmol、0.5nmol和2.5nmol GPR30拮抗剂G15组,分别采用免疫组织化学SP法及实时定量PCR技术,对子宫中toll样受体4(TLR4)的分布及TLR4 mRNA的表达量进行研究.结果 TLR4免疫反应阳性产物主要分布在小鼠子宫的内膜上皮、腺上皮及间质细胞;G1高浓度组中TLR4的免疫组织化学阳性着色强度显著低于其他组(P＜0.01),去卵巢小鼠给予GPR30拮抗剂G15后,TLR4的相对表达量随G15浓度的升高面升高,各浓度组间TLR4的相对表达量显著性变化差异同OVX+G1组.各组小鼠子宫中TLR4 mRNA的表达量变化与TLR4相对表达量变化一致.结论 GPR30可下调子宫中TLR4的表达,并可能介导雌激素参与子宫的局部免疫功能的调节.
