首页 > 文献资料
-
人端粒酶逆转录酶在肿瘤免疫治疗中的应用进展
2009年的诺贝尔生理学和医学奖颁发给了Elizabeth H.Blackburn,Carol W.Greider和Jack W.Szostak,以表彰他们对端粒酶(Telomerase)的发现作出的贡献.自从端粒酶被发现至今,研究人员每年都要进行数百次的实验来探究端粒酶的结构和功能,并将这些研究成果应用到生物医药领域.近年来的研究结果表明,端粒酶几乎在所有的恶性肿瘤中广泛表达,并且是肿瘤致瘤性的关键环节.新研究结果显示,靶向端粒酶的抗肿瘤疗法可以有效的消除肿瘤干细胞,而肿瘤干细胞被认为是肿瘤细胞中的高致瘤性亚群,是造成肿瘤患者对标准抗肿瘤疗法抵抗的关键.
-
短发夹RNA对人骨髓间充质干细胞生长增殖的影响
目的 观察靶向人端粒酶逆转录酶(hTERT)的短发夹RNA(shRNA)对人骨髓间充质干细胞(hMSCs)生长增殖的影响.方法 根据RNA干扰原理,利用构建的表达shRNA的靶向hTERT mRNA的真核表达质粒(shRNA1),非特异性的shRNA真核表达质粒(shRNA2),转染试剂和正常培养液处理细胞.24h后在共聚焦显微镜下检测荧光表达情况;24h、48h、72h用MTT法检测细胞增殖活性;48h后行HE染色、RT-PCR及端粒酶活性检测.结果 (1)共聚焦显微镜下见shRNA1及shRNA2组有大量的细胞表达荧光.(2)相应时间点各组细胞生长增殖无明显差异.HE染色发现,同等培养条件下,各组细胞生长密度及形态无明显变化.(3)RT-PCR显示各组细胞均无hTERT mRNA的表达;端粒酶活性均为阴性表达.结论 靶向hTERT mRNA的shRNA对正常hMSCs的生长增殖无明显影响,该方法对不表达hTERT的正常体细胞是安全的.
-
端粒,端粒酶与肝癌
端粒酶存在于绝大多数的恶性肿瘤中,而正常组织,体细胞中却检测不到,这就为恶性肿瘤的早期诊断,治疗和预后开辟了一条新的思路.端粒是真核生物线性染色体末端一种特殊结构,由简单重复的富含G的DNA序列及相关蛋白组成.端粒酶是由小分子RNA和蛋白质组成的一种核糖和蛋白酶,Tahara等首先对105例肝癌,慢性肝病和正常肝组织进行端粒酶活性的检测发现,端粒酶阳性率在肝癌组织中为85%,其中HBV阳性的肝癌组织的端粒酶阳性率为100%,在慢性肝炎为50%,而在正常肝组织全部为阴性,本文就端粒,端粒酶与肝癌的关系作一综述.
-
胆囊癌hTERT、c-myc表达及相关性研究
目的观察端粒酶催化亚基(hTERT)、c-myc在胆囊癌中的表达,探讨hTERT及c-myc与胆囊癌的相关性.方法采用免疫组织化学方法检测15例胆囊癌组织、癌旁组织、正常胆囊黏膜及20例胆囊腺瘤性息肉组织hTERT、c-myc的表达.结果①正常胆囊黏膜、胆囊腺瘤性息肉组织、癌旁组织及胆囊癌组织hTERT的阳性表达率分别为6.67%(1/15)、10.00%(2/20)、33.33%(5/15)及80%(12/15);c-myc阳性表达率分别为20.00%(3/15)、45.00%(9/20)、40%(6/15)及86.67%(13/15);胆囊癌组织中hTERT与c-myc阳性表达率明显高于其它组织(P＜0.05);②胆囊癌组织hTERT和c-myc表达与淋巴结转移有关,伴淋巴结转移的胆囊癌hTERT及c-myc阳性表达率明显高于无淋巴结转移者(P＜0.05);③c-myc在hTERT阳性的胆囊癌组织的表达率明显高于hTERT阴性组(P＜0.05).结论 hTERT过度表达在胆囊癌的发生发展过程中具有重要作用,c-myc在转录水平上调控hTERT的表达,进而激活端粒酶促进胆囊癌的形成.
-
短发夹RNA对人骨髓间充质干细胞生长增殖的影响
目的:观察靶向人端粒酶逆转录酶(hTERT)的短发夹RNA(shRNA)对人骨髓间充质干细胞(hMSCs)生长增殖的影响,探讨靶向hTERT的RNA干扰技术临床应用的安全性.方法:根据RNA干扰原理,利用构建的表达shRNA的靶向hTERTmRNA的真核表达质粒(shRNA1),非特异性的shRNA真核表达质粒(shRNA2),转染试剂(德国metafectene)和正常培养液处理细胞.24 h后在共聚焦显微镜下检测荧光表达情况;24h、48 h、72 h用MTT法检测细胞增殖活性;48 h后进行HE染色、RT-PCR及端粒酶活性检测.结果:①共聚焦显微镜下见shRNA1及shRNA2组有大量的细胞表达荧光.②相应时间点各组细胞生长增殖无明显差异(P＞0.05);HE染色发现,同等培养条件下,各组细胞生长密度及形态无明显变化.③RT-PCR显示各组细胞均无hTERT mRNA的表达;端粒酶活性为阴性.结论:靶向hTERT mRNA的shRNA对正常hMSCs的生长增殖无明显影响,该方法对不表达hTERT的正常体细胞可能是安全的.
-
hTERT mRNA联合CYFRA21-1、NSE在肺癌检测中的应用研究
目的 探讨hTERT mRNA、CYFRA21.1与NSE联合检测肺癌的意义.方法 CYFRA21-1、NSE使用电化学发光免疫法检测,hTERT mRNA使用荧光PCR定量检测.结果 检测组合中3种肿瘤标志物肺癌组阳性率依次为hTERTmRNA(70.62％).NSE(66.10％)、CYFRA21-1(53.11％).联合检测中hTERT mRNA+CYFRA21-1+NSE敏感性高为95.48％.结论 hTERTmRNA+CYFRA21.1+NSE合检测肺癌敏感性大大增高,特异性减低不明显,有效性高,在上述几种联合检测中价值高.
-
胃粘膜细胞涂片检测端粒酶蛋白对胃癌诊断价值的研究
目的通过检测磁定位采集器采集的胃粘膜细胞涂片中端粒酶hTERT蛋白的表达,探讨其对胃癌诊断的价值.方法采用抗人hTERT单克隆抗体,以免疫组化法检测通过磁定位采集器收集的113例胃粘膜细胞涂片标本的hTERT蛋白表达.结果 28例经组织病理学确诊的胃癌患者的涂片标本中,15例被细胞病理学诊断为癌,其中14例hTERT阳性;2例被细胞病理学诊断为可疑癌的标本中,1例hTERT阳性;5例镜下查到不典型增生细胞的标本中,3例hTERT阳性;6例细胞病理学阴性的标本中,5例hTERT阳性.细胞涂片hTERT检测诊断胃癌的灵敏度为82.1%;细胞病理学诊断胃癌的灵敏度为60.7%.同时,在23例重度肠化标本中,测得2例hTERT阳性,其余各良性病变组均为阴性.结论磁定位采集胃粘膜细胞涂片标本的hTERT检测结合细胞病理学诊断可作为胃癌筛检和诊断的敏感而有效的方法.
-
"七叶灵"颗粒抑制H460细胞生长和转移作用靶点的实验研究
目的 观察"七叶灵"颗粒对人肺腺癌H460细胞生长的抑制作用,以及对H460细胞中COX-2、OPN和hTERT表达的影响,探讨"七叶灵"颗粒在抑制肿瘤细胞生长、延缓肿瘤细胞的转移和浸润方面的作用靶点.方法 MTT法测定"七叶灵"颗粒对人肺腺癌H460细胞生长的抑制率,根据结果 得出IC50值.用RT-PCR法检测不同浓度的"七叶灵"颗粒对COX-2、OPN和hTERT表达的影响.结果 ①"七叶灵"颗粒对人肺腺癌H460细胞的生长有抑制作用.②IC50值随时间的增加明显降低(P＜0.05).③RT-PCR法结果 显示: "七叶灵"颗粒抑制了COX-2、OPN和hTERT表达(P＜0.05).结论 "七叶灵"颗粒具有益气养精、清热解毒、消肿散结的功效.有抑制人肺腺癌H460细胞生长的作用,并通过调节COX-2、OPN和hTERT的表达,起到抑制肿瘤细胞生长,延缓肿瘤细胞转移和浸润的作用.
关键词： 七叶灵颗粒 人肺腺癌H460细胞 COX-2 OPN hTERT -
人BMI-1基因真核表达载体构建及其在人乳腺癌细胞系MDA-MB-468细胞中的表达
目的:构建人Bmi-1基因的真核表达载体pcDNA3.1(+)-Bmi-1,转染人乳腺癌细胞株MDA-MB-468细胞中并检测其表达.方法:RT-PCR检测Bmi-1 mRNA在乳腺癌细胞系MCF-7及MDA-MB-468细胞中的表达水平;从MCF-7细胞中提取总RNA,逆转录为cDNA,以cDNA为模板,扩增Bmi-1基因序列,将含有Bmi-1全长编码序列的PCR产物经TA克隆后经PCR、酶切验证,亚克隆入真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建重组质粒pcDNA3.1(+)-Bmi-1,转化至大肠杆菌后,酶切、测序鉴定;将重组质粒转染到MDA-MB-468中,48h后RT-PCR检测转染前后Bmi-1 mRNA及hTERT mRNA的表达变化.结果:Bmi-1 mRNA在MCF-7细胞中表达较高,而在MDA-MB-468细胞中仅适量表达.成功从MCF-7细胞中克隆获得Bmi-1基因并构建真核表达载体.转染后在MDA-MB-468中检测到Bmi-1 mRNA表达上调,其过表达上调hTERT mRNA的表达.结论:成功克隆和建立人Bmi-1基因真核表达载体;pcDNA3.1(+)-Bmi-1能在MDA-MB-468中表达;为进一步研究Bmi-1基因在细胞中的功能奠定了基础.
-
hTERT和survivin双靶点RNAi表达载体的构建及对人结肠癌SW480细胞的抑制作用
目的 构建人端粒酶反转录酶(hTERT)和生存素(survivin)基因表达的RNA共干扰载体,并检测其对人结肠癌SW480细胞中hTERT基因和survivin基因的干扰作用.方法 根据Genbank提供的hTERT和survivin cDNA序列,设计、筛选出高效、特异性强的干扰序列,构建特异性干扰hTERT基因和survivin基因的重组体pGenesil-1.1-survivin、pGenesil-1.2-hTERT,酶切、测序鉴定正确后,两个重组体均用HindⅢ和BamHⅠ双酶切,将pGenesil-1.1-survivin回收大片段,pGenesil-1.2-hTERT回收小片段,将回收大、小片段用T4 DNA连接酶定向连接,即构建成重组体pGenesil1.1-survivin-h TERT.将3个重组体分别转染SW480细胞,RT-PCR检测细胞中hTERT和survivin基因表达水平,MTT检测对SW480细胞增殖的影响.结果 构建的各质粒经限制性酶切及DNA测序均证明其质粒构建正确,RT-PCR检测hTERT和survivin基因表达水平明显降低(P＜0.05),各干扰质粒重组体对细胞增殖有明显的抑制作用(P＜0.05).结论 靶向survivin和hTERT基因的双干扰载体构建成功,为后续的结肠癌基因治疗研究奠定理论基础.
-
RNAi双沉默Survivin和hTERT基因抑制人结肠癌SW480细胞增殖促进凋亡
目的：探讨双向沉默Survivin和hTERT基因对结肠癌SW480细胞增殖和凋亡的影响，为结肠癌的基因治疗提供实验依据。方法设计并构建能够稳定转录shRNA并可分别及联合干扰Survivin和hTERT分子表达的质粒，将其转染结肠癌SW480细胞后，分阴性对照组、空白质粒对照组、 Survivin RNAi 组、hTERT RNAi 组和Survivin-hTERT RNAi组。转染48h后TRAP-PCR-ELISA法检测端粒酶活性，RT-PCR法检测Survivin和hTERT mRNA的表达，Western blot检测Survivin和hTERT蛋白的表达，流式细胞仪及cck-8法分别检测细胞凋亡和细胞增殖的变化。结果 Survivin-hTERT RNAi组SW480细胞端粒酶活性明显下降（ P ＜0.01）， Survivin-hTERT RNAi 组Survivin及hTERT的mRNA水平较正常对照组分别减低82.8％和73.6％（ P ＜0.01），蛋白表达抑制率分别为79.2％和66.7％（ P＜0.01）。实验各组中Survivin-hTERT RNAi组细胞增殖抑制率和凋亡率高，分别为43.6％±0.1％和39.2％±2.3％（ P＜0.01）。结论 Survivin和hTERT双干扰质粒可明显下调Survivin和hTERT蛋白的表达，抑制结肠癌SW480细胞的增殖，促进其凋亡。
-
在SW480细胞中沉默survivin基因抑制细胞增殖及hTERT表达
目的 观察生存素(survivin)基因干扰对SW480细胞增殖的影响,探讨其干扰对hTERT基因表达的影响及机制.方法 构建携带survivin小发夹干扰RNA的重组表达载体pGenesil-1.1-survivin,转染结肠癌SW480细胞,MTT检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞增殖周期;荧光定量PCR和Western blot检测survivin、h TERT和Sp1的mRNA和蛋白表达,TRAP-ELISE法检测端粒酶活性.构建靶向Sp1基因的RNA干扰载体转染SW480细胞,检测hTERT基因mRNA和蛋白水平及端粒酶活性.结果 Survivin基因干扰后,SW480细胞增殖受到明显抑制,增殖抑制率为34.44％ (P ＜0.05),G0/G1期细胞增加,S期和G2/M期细胞减少(P＜0.01).hTERT和Sp1基因的mRNA和蛋白表达水平显著降低,端粒酶活性降低(P＜0.01).Sp1基因干扰后,hTERT基因的mRNA和蛋白表达水平及端粒酶活性下降(P＜0.01).结论 靶向沉默survivin基因对SW480细胞增殖有明显的抑制作用;同时下调hTERT基因表达,其机制可能与Sp1基因表达下调有关.
-
P53对涎腺腺样囊性癌细胞端粒酶活性的抑制作用
目的为了探讨P53基因对腺样囊性癌细胞端粒酶活性的抑制作用及机制.方法构建携带人野生型P53基因的腺病毒表达载体,以脂质体法瞬时转染腺样囊性癌SACC-83细胞,RT-PCR检测转染细胞P53基因mRNA的表达,TRAP-PCR-ELISA法检测转染细胞端粒酶活性的改变.并将P53基因与含有hTERT启动子核心调控区的荧光素酶报告基因pGL2-630共转染SACC-83细胞,测定转染细胞荧光素酶报告基因活性.结果 1. 瞬时转染含人野生型P53基因的重组腺病毒表达载体pΔE1-P53于腺样囊性癌SACC-83细胞后,其P53基因mRNA的表达明显增强;2. 基因转染后,SACC-83细胞内源性端粒酶活性显著降低.3. P53基因与含有hTERT启动子核心调控区的荧光素酶报告基因pGL2-630共转染SACC-83细胞后,其荧光素酶活性显著下降.结论外源性表达P53基因可以降低腺样囊性癌细胞SACC-83细胞端粒酶活性,并可能通过抑制端粒酶hTERT基因启动子的转录活性实现.
-
AgNOR染色及hTERT、PCNA表达在良、恶性胸腹水鉴别诊断中的意义
目的 应用AgNOR染色及hTERT、PCNA的表达探讨其对良、恶性胸、腹水的诊断及鉴别诊断价值.方法 对67例因胸、腹水就诊的患者除进行常规胸、腹水脱落细胞学检查外,还进行AgNOR染色,并用SP法检测胸腹水脱落细胞hTERT和PCNA的表达.结果 恶性与良性胸、腹水AgNOR每核颗粒平均数分别为4.33±O.68和1.57±0.48;AgNOR染色敏感性为89.1%,特异性为90.1%.在46例恶性胸、腹水中,hTERT和PCNA的阳性表达率分别为84.8%和63.0%,反应性间皮细胞hTERT和PCNA(-).AgNOR颗粒数增多与hTERT、PCNA的表达具有一定的相关性.AgNOR计数较PCNA检测的敏感性和准确率均明显升高,而hTERT与AgNOR计数相比差异不显著.结论 hTERT和PCNA的表达及AgNOR颗粒数增多均是恶性胸、腹水的特征,可作为胸、腹水脱落细胞学检查的重要辅助手段.
-
hTERT与p53在胃癌和癌前病变的表达及意义
应用免疫组化检测hTERT和p53蛋白在胃癌及癌前病变中的表达,探讨端粒酶hTERT和p53蛋白在胃癌早期诊断中的价值,以及在胃癌的发生发展过程中两者的相互关系.
-
白血病HL-60、HL-60A细胞Cyclin D1、hTERT表达和端粒酶活性及意义
本研究旨在现察cyclin D1、hTERT和端粒酶在正常人单个核细胞(MNC)、HL-60和HL-60A中的表达及活性,并探讨它们与白血病发生及耐药的关系.实验用正常人外周血MNC、耐药白血病细胞株HL-60和HL-60A,采用流式细胞仪检测细胞周期,Annexin V-FITC+ PI染色法检测细胞凋亡,real-time PCR和Western blot检测细胞cyclin D1、hTERT mRNA及蛋白表达,TRAP-ELISA法检测细胞端粒酶活性.结果表明:MNC、HL-60、HL-60A的S期细胞比例分别为(10.21±2.11)%、(44.93±3.00)%、(51.38±1.10)%;凋亡细胞比例分别为(16.14±2.13)%、(7.53±0.92)%、(4.15±0.96)%;cyclin D1、hTERT的mRNA和蛋白水平依次增高;HL-60、HL-60A端粒酶活性较正常MNC增强(p=0.000),HL-60与HL-60A之间无明显差别(p=0.232);cyclin D1、hTERT与端粒酶活性呈正相关(p<0.01).结论:与正常人MNC相比,HL-6O、HL-6OA的S期细胞增多,凋亡细胞减少,且以HL-60A更为明显,这可能与cyclin D1、hTERT、端粒酶活性上调有关.
-
人端粒酶逆转录酶基因反义核酸对CEM细胞系端粒酶活性的影响
为了探讨人端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase, hTERT)基因的全硫代修饰反义寡核苷酸(antisense phosphorothioate oligodeoxynucleotide, ASODN)对CEM细胞端粒酶活性的影响,采用端粒酶聚合酶链反应-酶联免疫测定法检测CEM细胞的端粒酶活性,采用逆转录-聚合酶链反应方法检测hTERT基因mRNA的表达水平,以间接免疫荧光标记法通过流式细胞仪检测hTERT蛋白表达含量的变化.结果显示: hTERT ASODN作用于CEM细胞后, hTERT mRNA表达水平明显降低; ASODN与CEM细胞共同孵育48小时,hTERT蛋白表达阳性率降为(40.43±2.07)%, 72小时hTERT蛋白表达阳性率降为(15.26±2.74)%,而hTERT正义核酸作用CEM细胞24,48,72小时,对hTERT mRNA及蛋白表达水平均无影响; hTERT基因ASODN作用于CEM细胞48,72小时,其端粒酶活性明显降低,分别与正义寡核苷酸组、空白对照组相比有显著性差异(P<0.05).结论:hTERT基因反义寡核苷酸能特异性地抑制CEM细胞的端粒酶活性.
-
三氧化二砷对骨髓瘤细胞系U266抑制增殖及诱导凋亡的机制研究
本研究探讨三氧化二砷(As2O3)在体外对骨髓瘤细胞系U266的生物学效应及其机制.用MTT法观察As2O3对U266细胞增殖的影响,用流式细胞术、DNA凝胶电泳法分析As2O3对U266细胞凋亡的影响,以RT-PCR法检测2 μmol/L As2O3不同处理时间对U266细胞人端粒酶逆转录酶蛋白催化亚单位(hTERT)mRNA的表达变化,用Western blot法检测As2O3不同处理时间对U266细胞pmcaspase-3、bcl-2及hTERT蛋白水平的表达变化.结果表明:As2O3能明显抑制U266细胞增殖,半数抑制浓度(Ic50)为2μmol/L;As2O3能诱导U266细胞凋亡,呈现剂量和时间依赖性;2 μmol/L As2O3不同时间处理U266细胞后procaspase-3蛋白及hTERT mRNA、蛋白表达呈时间依赖性降低,而bcl-2蛋白表达未发生变化.结论:As2O3通过改变线粒体跨膜电位,触发了U266细胞的线粒体凋亡途径,导致了caspase-3的活化,终诱导U266细胞凋亡;hTERT表达下调也是As2O3诱导U266细胞凋亡的重要作用机制.
-
hTERT反义寡核苷酸对HL-60细胞增殖及端粒酶活性的抑制作用
为了研究hTERT基因反义寡核苷酸(ASODN)对HL-60细胞增殖及端粒酶活性的抑制作用,并探讨HL-60细胞端粒酶活性与hTERT基因表达的关系,应用反义寡核苷酸封闭HL-60细胞hTERT基因的表达,RT-PCR方法检测该基因表达抑制情况,倒置显微镜观察细胞形态变化,MTT法检测细胞增殖状态,应用TRAP-ELISA、TRAP-PAGE方法检测HL-60细胞端粒酶活性.结果发现:反义硫代寡核苷酸作用于HL-60细胞72小时后,hTERT基因表达明显受抑,细胞生长受抑,增殖能力减弱,其抑制作用具有序列特异性及浓度、时间依赖性.端粒酶活性检测显示:反义寡核苷酸10、20和30 μmol/L作用组OD450-690值分别为1.504±0.47、1.223±0.39,0.944±0.16,与未作用组(2.648±0.42)比较,差异有显著性(P＜0.05);正义寡核苷酸20 μmol/L作用组(OD450-690值为2.376±0.65)与未作用组比较,差异无显著性(P＞0.05).TRAP-PAGE检测表明: hTERT ASODN作用组较SODN作用组端粒酶条带明显减少,以30 μmol/L作用组条带少.结论: hTERT基因反义寡核苷酸能够通过封闭hTERT基因的表达而抑制HL-60细胞增殖,下调端粒酶活性.
-
骨髓增生异常综合征患者人端粒酶逆转录酶和survivin基因的表达
本研究探讨骨髓增生异常综合征(MDS)患者端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)和凋亡抑制因子survivin的表达及它们之间的关系.以普通RT-PCR方法检测56例MDS患者和27例缺铁性贫血患者骨髓端粒酶逆转录酶hTERT mRNA的表达,以应用Taqman探针的实时定量RT-PCR方法检测55例MDS患者和12例缺铁性贫血患者骨髓survivin mRNA的表达,分析它们在MDS中的表达水平及相互关系.结果表明:RA患者及RAEB患者hTERT的阳性率均显著高于对照组,差异有统计学意义(p<0.005);随着病情的改善,RA患者hTERT表达率下降,与对照组相比无明显差异(P>0.10);按IPSS危险度分组,低危+中危-1组hTERT的表达与中危-2+高危组相比无明显差异(P>0.50);RA患者survivin的表达均明显高于对照组,差异有显著性(P<0.02),而RAEB患者survivin的表达与对照组相比无明显差异(P>0.05);按IPSS危险度分析,低危+中危-1组survivin的表达明显高于对照组,差别有显著性(P<0.02).中危-2+高危组survivin的表达与对照组无明显差异(P>0.10).结论:端粒酶逆转录酶hTERT和凋亡抑制因子survivin可能在MDS恶性克隆细胞逃脱凋亡控制、获得无限增殖能力的过程中发挥作用.
