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机械牵张力下大鼠小梁网细胞的差异蛋白组学及生物信息学分析
目的 研究机械牵张作用对大鼠小梁网细胞蛋白组学的表达影响.方法 实验对象选用对数生长期的大鼠小梁网细胞.采用FX-5000牵张应力加载系统拉伸细胞,提取细胞全蛋白后进行基于鸟枪法的质谱测试和蛋白质的鉴定.运用微阵列显著性分析(significance analysis of microarray, SAM)方法分析实验组和对照组的蛋白组学差异;对差异蛋白进行基于Gene Ontology(GO)的功能注释、富集和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)通路富集并筛选出显著富集的蛋白.结果 SAM法筛选出差异蛋白共计57种,均表达上调,分布在细胞各个区域,参与细胞发育、免疫调节、刺激反应、代谢、细胞黏附等过程.其中24种显著富集在9个隶属生物学过程的GO term中,进一步KEGG通路富集分析显示热休克蛋白和核糖体蛋白显著富集在内质网蛋白加工通路和核糖体通路中.结论 机械牵张对大鼠小梁网细胞的蛋白质表达影响区域广,过程复杂.富集分析说明热休克蛋白和核糖体蛋白在牵张刺激下的应答保护和眼压调控中起到了重要作用.
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鱼藤酮诱导青光眼患者小梁网氧化损伤的研究
目的:原发性开角型青光眼(POAG)是一种发病隐匿的不可逆性致盲性眼病,发病机制有待进一步探讨.本研究通过激光共聚焦显微镜及流式细胞方法检测鱼藤酮对青光眼患者小梁细胞氧化损伤的影响,探讨POAG的发病机理.方法:原代培养POAG患者及正常人小梁网细胞,采用激光共聚焦显微镜、流式细胞技术观察不同浓度鱼藤酮对小梁网细胞内ROS水平的影响.结果:原代POAG患者小梁网细胞内ROS水平明显高于正常人,差异有统计学意义(P<0.05).ROT对GTM小梁网细胞ROS的诱导作用呈时间-浓度依赖性,而正常人原代小梁网细胞NTM经过ROT处理后,结果显示ROT浓度高于5μmol/L时对正常人小梁网细胞内ROS产生有显著诱导作用(P<0.01);而≤5μmol/L时,ROT对NTM细胞内ROS的产生并没有明显诱导作用.在不同浓度下,ROT对原代POAG患者和正常人小梁网细胞ROS的诱导作用相比,均有显著性差异(P<0.01).结论:鱼藤酮诱导小梁网氧化损伤增强,提示线粒体复合物活性下降可能会引起青光眼患者小梁网功能障碍,推测其与眼压升高及POAG发病密切相关.
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线粒体功能失调和氧化应激在小梁网细胞损伤中的作用机制
小梁网是青光眼在前房的靶组织,小梁网细胞结构和功能障碍时可引起眼压升高.近年来研究表明,线粒体功能失调和氧化应激在小梁网细胞损伤的过程中起重要作用.线粒体是细胞内有氧呼吸的重要场所,当线粒体功能失调时细胞内ATP合成减少且活性氧生成过多.体内过多的活性氧物质堆积导致线粒体DNA损伤,引起线粒体结构和功能的进一步损伤,反过来生成更多的活性氧物质.活性氧的释放和损伤的线粒体可引起细胞色素C的释放,激活半胱天冬酶途径,诱导细胞凋亡.此外线粒体损伤引起的氧化应激反应还可通过损伤体内大分子物质、诱发炎症反应、介导溶酶体功能失调等途径造成小梁网细胞损伤或死亡.
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自噬与青光眼关系的研究进展
自噬是溶酶体降解或再循环利用细胞器、蛋白质等胞内物质成分的过程,在细胞内环境稳态中发挥重要作用.近年来的研究表明,自噬与众多眼病包括青光眼的发生和发展有着密切联系.自噬可能是导致小梁网细胞功能异常的重要因素之一,其对视网膜神经节细胞发挥保护作用还是促进其死亡,仍存在争议.目前与青光眼有关的自噬基因的研究主要是OPTN基因,其编码的蛋白质optineurin与正常眼压性青光眼的发生发展相关.通过调控自噬而保护视网膜神经节细胞免于损伤可能是青光眼视神经保护的一种新方法.
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叔丁基过氧化氢诱导小梁网细胞氧化应激模型的建立
目的 体外建立叔丁基过氧化氢小梁网细胞氧化应激模型.方法 应用tBHP刺激体外培养的小梁网细胞(iHTM)后,观察小梁网细胞形态学的改变,分别用MTT法检测氧化损伤后小梁细胞的活性,流式细胞术检测活性氧水平,Suc-LLVY-荧光底物检测糜蛋白酶样蛋白酶体的活性,流式细胞术和激光共聚焦显微镜检测小梁细胞的凋亡.结果 正常培养的小梁细胞呈梭形,折光性好,贴壁较牢;应用tBHP刺激后,部分细胞变圆、脱落、皱缩,小梁细胞的细胞活性明显下降,活性氧水平升高,糜蛋白酶样蛋白酶体活性降低,细胞凋亡水平明显增加.随着刺激时间的延长,上述改变更为明显.结论 tBHP刺激后,小梁网细胞出现典型的氧化应激改变,tBHP刺激小梁网模型的建立可应用于青光眼氧化应激的研究.
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葡萄糖调节蛋白GRP78在小梁网细胞中的表达及临床意义
目的：检测葡萄糖调节蛋白78(GRP78)在体外培养的正常人小梁网细胞(NTM)及原发性开角型青光眼(POAG)患者小梁网细胞(GTM)中蛋白及mRNA表达差异及临床意义。方法将体外培养的NTM及GTM细胞分为衣霉素(Tm)组、十字孢碱(STS)组及对照组,采用Real-time PCR、Western blot方法检测药物处理6、24 h后小梁网细胞中GRP78 mRNA及蛋白表达。结果原代培养的GTM细胞中GRP78表达水平明显低于NTM细胞,差异有统计学意义(P<0.05)。Tm可增加NTM、GTM细胞中GRP78的表达,但后者的增高水平明显低于前者,差异有统计学意义(P<0.05)。 GTM细胞对STS的反应大于NTM细胞。结论 POAG患者小梁网细胞对内质网应激反应能力低下,GRP78表达明显下调,对损伤性刺激的敏感性增强,提示GRP78蛋白可能在内质网应激诱导产生的小梁细胞凋亡中起保护作用。
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纤维连接蛋白对原发性开角型青光眼小梁网细胞整合素α5β1表达的影响
目的 探讨纤维连接蛋白(FN)对体外培养的原发性开角型青光眼(POAG)患者小梁网细胞整合素α5β1表达及细胞存活的影响.方法 体外培养POAG患者小梁网细胞,分别加入不同浓度的FN(0、5、10、20、40、100μg/ml)培养.采用免疫细胞化学法观察各组细胞整合素α5β1的表达及细胞存活情况.结果 随着FN浓度增加,整合素α5β1表达增强.在FN低浓度(0-40 μg/ml)范围内,阳性细胞面积增多;而在FN 100μg/ml时阳性细胞面积减少.结论 FN影响小梁网细胞外基质,参与眼内压的调节.
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纤维连接蛋白对原发性开角型青光眼小梁网细胞增殖、黏附和迁移的影响
目的 通过研究纤维连接蛋白(FN)对体外培养的原发性开角型青光眼(POAG)患者小梁网细胞增殖、黏附、迁移的影响,探讨FN与POAG发病机制的关系.方法 取临床确诊的POAG患者小梁网切除术中的深层巩膜组织块,进行小梁网细胞体外原代和传代培养,并对其进行免疫细胞化学和电镜鉴定.取第3代小梁网细胞,实验组分别加入浓度为5、10、20、40、100μg/ml的FN(含无血清DMEM/F12培养液)培养,对照组不加FN.培养24 h后,采用CCK-8比色法和Transwell试剂盒检测各组光密度值,分析FN对POAG小梁网细胞增殖、黏附、迁移的影响.采用SPSS 17.0统计软件,组间比较采用One-Way ANOVA分析,两两比较采用SNK检验.结果 经过免疫细胞化学和电镜鉴定后,确定培养的细胞为POAG小梁网细胞.不同浓度FN对小梁网细胞均有影响.FN对POAG小梁网细胞有促增殖作用,在FN为5～10μg/ml浓度范围,小梁网细胞增殖相对缓慢,10μg/ml以后呈现上调趋势,在40μg/ml时达到增殖高峰.100 μg/ml仍促进增殖,但是相对缓慢.各实验组光密度值分别与阴性对照组比较,差异均有统计学意义(P<0.01);各实验组不同浓度组间比较,差异有统计学意义(F=81.778,P<0.05).FN浓度为5、10、20、40、100 μg/ml时,小梁网细胞的增殖率分别为18.6%、54.7%、67.9%、98.7%和121.5%.同样,FN对POAG小梁网细胞有明显的促黏附、迁移作用.小梁网细胞的黏附、迁移能力随FN浓度的增加而增强,基本呈现曲线上升趋势,与阴性对照组比较,差异均有统计学意义(P<0.05).结论 FN能促进POAG患者小梁网细胞增殖、黏附和迁移,其在POAG发病机制中的作用可能为通过影响POAG小梁网细胞的增殖、黏附、迁移功能参与房水流出的凋节过程.
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家兔高眼压模型小梁网细胞p53基因表达的检测
目的检测高眼压状态下不同时间家兔高眼压模型小梁网细胞p53基因的表达.方法家兔30只,任选1眼作实验,另眼对照.2%甲基纤维素0.20～0.25ml前房注射制做高眼压模型,根据高眼压持续时间不同对动物进行分组(10天、20天、30天各为一组),分期取材、石蜡切片、免疫组化染色检测p53基因的表达情况.光学显微镜下对小梁网细胞凋亡情况进行定量分析.结果凋亡高低依次为:10天组>20天组>30天组=对照组.结论在眼压急速升高的模型眼中,小梁网细胞有凋亡现象,而且凋亡主要发生在实验的早期,随着高眼压持续时间的延长,小梁网细胞大量死亡,凋亡处于相对静止状态.
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原花青素对氧化应激人眼小梁网细胞凋亡及细胞色素C释放的影响
目的 研究原花青素对H2O2诱导人眼小梁网细胞(human trabecular meshwork cells,HTMC)凋亡及细胞色素C释放的影响.方法 将HTMC进行传代后随机分为5组.未处理组:正常培养的HTMC;对照组:正常培养的HTMC+H2O2(500μmol·L-1处理lh);3个浓度的原花青素组:正常培养的HTMC+H2O2(500 μmol· L-1处理lh)+原花青素(浓度分别为0.02 g·L-1、0.05 g·L-1、0.10g·L-1).使用Annexin V-FITC检测细胞凋亡情况,Western blot检测HTMC胞浆细胞色素C含量.结果 与未处理组相比,对照组及各原花青素组细胞凋亡率均升高,差异均有统计学意义(均为P＜0.01).与对照组相比,各原花青素组细胞凋亡率均降低,差异均有统计学意义(均为P＜0.01);不同浓度原花青素组间随原花青素浓度增加细胞凋亡率下降,各原花青素组间差异均有统计学意义(均为P＜0.01).与未处理组相比,对照组以及0.02 g·L-1和0.05 g· L-1原花青素组细胞色素C的释放均增加,差异均有统计学意义(均为P＜0.01);而0.10 g·L-1原花青素组与未处理组相比,差异无统计学意义(P＞0.05).与对照组相比,各原花青素组细胞色素C释放均减少,差异均有统计学意义(均为P＜0.01).不同浓度原花青素组间随原花青素浓度增加细胞色素C的释放减少,各组间差异均有统计学意义(均为P＜0.01).结论 外源性原花青素可以降低氧化应激HTMC的凋亡率,减少细胞色素C的释放,有较强的抗氧化作用,并在一定浓度范围内随着浓度的增加其抗氧化作用逐渐增强.
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氧化应激条件下miR-21对人眼小梁网细胞胞外基质蛋白表达的影响
目的 探讨氧化应激条件下miR-21对人眼小梁网细胞(human trabecular meshwork cells,HTMCs)胞外基质蛋白表达的影响.方法 用不同浓度H2O2(0μmol·L-1、200 μmol·L-1、400 μmol·L-1、600 μmol·L-1)刺激HTMCs l h,MTT法检测其对HTMCs活力的影响,从而确定后续实验所需H2O2浓度.随后将细胞分成正常组和H2O2组,Real-time PCR检测miR-21的表达,Western blot检测胞外基质蛋白(纤维连接蛋白和胶原蛋白I)的表达.然后将细胞分成5组:H2O2组(只用H2O2处理)、miR-21干预组(H2O2+ miR-21模拟物)、miR-21对照组(H2O2+ miR-21对照模拟物)、miR-21抑制组(H2O2+ miR-21抑制剂)和miR-21抑制对照组(H2O2+miR-21抑制剂对照物),Real-time PCR检测miR-21、转化生长因子(transforming growth factor,TGF)-β2和PTEN mRNA表达,Western blot检测胞外基质蛋白、TGF-β2和PTEN蛋白表达.后将细胞分成3组:H2O2组(只用H2O2处理)、PTEN干扰组(H2O2 +PTEN siRNA)和干扰对照组(H2O2+ control siRNA),检测PTEN、胞外基质蛋白和TGF-β2蛋白水平表达.结果 当H2O2浓度≥400 μmol·L-1时,可显著抑制HTMCs的活性,后续实验选择此浓度.与正常组相比,H2O2组中miR-21、纤维连接蛋白和胶原蛋白Ⅰ的表达均增加,差异均有统计学意义(均为P＜0.05).检测氧化应激条件下miR-21对胞外基质蛋白、TGF-β2和PTEN表达的影响,发现与H2 O2组相比,miR-21对照组和miR-21抑制对照组中miR-21、纤维连接蛋白与胶原蛋白Ⅰ蛋白水平表达以及TGF-β2和PTEN mRNA及蛋白水平表达差异均无统计学意义(均为P＞0.05);与miR-21对照组相比,miR-21干预组miR-21、纤维连接蛋白和胶原蛋白Ⅰ蛋白水平及TGF-β2 mRNA和蛋白水平表达均增加,PTEN蛋白水平表达降低,差异均有统计学意义(均为P＜0.05),而PTEN mRNA表达差异均无统计学意义(均为P＞0.05);与miR-21抑制对照组相比,miR-21抑制组miR-21、纤维连接蛋白和胶原蛋白Ⅰ蛋白水平及TGF-β2 mRNA和蛋白水平表达均降低,PTEN蛋白水平表达增加,差异均有统计学意义(均为P＜O.05),而PTEN mRNA水平差异无统计学意义(P＞0.05).采用Western blot检测氧化应激条件下PTEN对TGF-β2和胞外基质蛋白表达的影响,发现与H2O2组相比,干扰对照组PTEN、TGF-β2、纤维连接蛋白和胶原蛋白Ⅰ的表达差异均无统计学意义(均为P＞0.05);与干扰对照组相比,PTEN干扰组PTEN的表达下调,TGF-β2、纤维连接蛋白和胶原蛋白Ⅰ的表达均升高,差异均有统计学意义(均为P＜0.05).结论 氧化应激条件下miR-21可增加HTMCs胞外基质产物,这可能与其靶向沉默PTEN基因,调节TGF-β2的表达相关.
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细胞外钙离子内流上调原发性开角型青光眼患者小梁网细胞Copine1表达的研究
目的 探讨原发性开角型青光眼患者(primary open-angle glaucoma,POAG)小梁网细胞外钙离子内流对膜蛋白copinel表达的影响.方法 原代培养POAG患者小梁网细胞,应用荧光显微镜和流式细胞仪检测细胞内钙离子浓度,所用钙离子荧光探针为Fluo3-AM；应用钙离子运载剂A23187增加细胞内钙离子浓度；应用Real-time PCR检测小梁网细胞内钙离子浓度增加前后copine1在转录水平的表达.结果 经免疫组织化学鉴定培养的细胞为小梁网细胞.荧光显微镜下观察与流式细胞仪定量结果均显示,应用钙离子运载剂A23187增加了POAG患者小梁网细胞内的钙离子浓度.Real-time PCR检测证实A23187的应用使copine1 mRNA在小梁网细胞中表达增加了(1.8±0.3)倍.结论 POAG患者小梁网细胞内钙离子浓度增高可引起copinel在转录水平表达的上调,copinel在小梁网细胞中的功能研究将会增加对POAG病理学机制的理解,有助于新药物靶点的开发.
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可溶性CD44分子对人眼小梁网细胞凋亡调节蛋白bcl-2相关死亡因子bad表达的影响
背景 研究表明可溶性CD44分子(sCD44)在原发性开角型青光眼(POAG)患者眼中的质量浓度高于正常人,POAG患者房水中sCD44水平与小梁网细胞凋亡相关蛋白的表达是否有关及其对POAG的共同作用机制至今尚不明确. 目的 探讨不同质量浓度的sCD44对POAG患者小梁网细胞凋亡调节蛋白bcl-2相关死亡因子bad表达的影响.方法 收集POAG患者行小梁切除术中切除的小梁网组织,采用组织块培养法原代培养小梁网细胞,并用免疫细胞化学法对培养细胞进行鉴定,将第3代的小梁网细胞按随机数字表法随机分为6个组,分别在无血清培养基中加入含终质量浓度为0(对照组)、1、5、10、25、50 μg/L的sCD44,培养细胞48 h.采用细胞计数试剂8(CCK-8)法和ELISA法检测小梁网细胞中凋亡调节蛋白bc1-2相关死亡因子bad蛋白的表达.结果 培养的细胞经层黏连蛋白(LM)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)单克隆抗体、纤维连接蛋白(FN)免疫组织化学染色呈阳性反应.CCK-8法检测0、l、5、10、25、50μg/L sCD44作用48 h后小梁网细胞吸光度(A450)值分别为:0.2460±0.0019、0.1874±0.0015、0.1570±0.0016、0.1302±0.0019、0.1084±0.0018、0.0940±0.0020,差异有统计学意义(F=14.922,P=0.000),各实验组A450值均低于对照组,差异均有统计学意义(P=0.013、0.008、0.011、0.005、0.004).ELISA法检测表明,0、l、5、10、25、50 μg/LsCD44作用48 h后小梁网细胞中bad蛋白质量浓度分别为(114.8461±2.9560)、(137.8270±2.4259)、(161.4194±3.7381)、(170.9453±3.2006)、(221.2252±4.3738)、(324.6167±4.4220) ng/L,差异有统计学意义(F=16.610,P=0.000),各实验组小梁网细胞中bad蛋白质量浓度均明显高于对照组,差异均有统计学意义(P=0.017、0.013、0.008、0.007、0.006).结论 sCD44在一定质量浓度范围内可促进POAG小梁网细胞的凋亡,并且能上调凋亡调节蛋白bcl-2相关死亡因子bad蛋白的表达.
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内皮素-1对体外培养人小梁网细胞纤维连接蛋白及Ⅰ型胶原表达的影响
目的 观察内皮素-1(ET-1)对人小梁网细胞(TMCs)细胞外基质纤维连接蛋白(FN)、Ⅰ型胶原(COL I)的影响.方法 取死亡24h内尸眼小梁网组织,行TMCs原代和传代培养,并用FN、层黏连蛋白(LN)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)和Ⅷ因子相关抗原(FⅧRAg)鉴定为人TMCs后,取传3代的人TMCs,给予不同浓度ET-1(10-9 、10-8、10-7 mol/L)孵育72h后,免疫荧光和Western blot观察ET-1对TMCs中FN、COL I表达的影响;然后取传3代的人TMCs,分别给予10-7mol/L ET-1、10-7mol/L ET-1+10-7 mol/L ETA受体拮抗剂、10-7mol/L ET-1+10-7 mol/L ETB受体拮抗剂后孵育72h,Western blot观察ET受体拮抗剂对FN、COL I表达的影响.结果 研究受到伦理委员会的批准,取材前征得供体家属的知情同意.培养的细胞形态多样,含少许色素颗粒,FN、LN、NSE染色均呈阳性反应,FⅧRAg呈阴性反应.人TMCs与10-9～10-7mol/L ET-1共孵育后FN表达上调(F=18.41,P＜0.05);与10-8mol/L、10-7mol/L ET-1共孵育后COL I表达上调(F=39.81,P＜0.05),并呈浓度依赖性,10-7mol/L时作用明显;给予ETA受体拮抗剂后,与ET-1组相比,FN、COL I的表达均降低(qFN=7.213,P＜0.05;qCOLI=6.187,P＜0.05),但给予ETB受体拮抗剂后,FN、COL I的表达均无明显变化.结论 ET-1能够促进体外培养的人TMCs中FN、COL I的表达,其机制可能是通过激动ETA受体而非ETB受体发挥作用的.
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酪氨酸激酶抑制剂通过活化大钾通道松驰小梁网细胞
青光眼是致盲的主要原因之一,大约2%老年人被青光眼困扰.部分青光眼的发病机制与眼内压升高有关.小梁网组织是眼房水外流通路上的重要结构,其细胞是平滑肌样组织具有收缩性并参与房水外流的调节.当小梁网细胞松驰时房水滤过面积加大,房水外流增加,降低眼内压;反之则眼内压升高.目的: 通过酪氨酸激酶抑制剂对小梁网细胞膜电流的影响探讨其松驰的可能机制.方法:使用"膜片钳"技术中Nystatin全细胞穿孔模式.标本取自牛眼小梁网.结果:实验中使用的所有细胞经acetylcholine预收缩.天然酪氨酸激酶抑制剂genistein(5×10-5 mol/L)引起一个强而持续并可逆转的外向电流(578±154)%(n=16);超极化(15±3) mV.人工合成酪氨酸激酶抑制剂tyrphostin 51也具有类似效果(433±46)%(n=7).该效应表现剂量依赖[10-6 mol/L时无作用;10-5 mol/L时(363±80)%(n=9);10-4 mol/L时(1129±251)%(n=9)].一种具有非活化结构的genistein同系物daidzein对膜电流没有作用(n=4).Genistein刺激产生的外向电流能被钾通道阻断剂TEA+取消.而glibenclamide(一种ATP依赖钾通道阻断剂)和apamin(一种小传导钙活化钾通道阻断剂)对由genistein和tyrphostin 51诱导的外向电流没有作用;大传导钙活化钾通道(大钾通道Maxi-K channel)阻断剂iberiotoxin(10-7 mol/L)抑制了刺激电流的(86±18)%(n=4).结论:酪氨酸激酶抑制剂可能是通过活化大钾通道松驰小梁网细胞,从而改善房水外流降低眼内压,该物质有可能成为治疗青光眼的理想候选药物.
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内源性大麻素AEA对体外培养的牛眼小梁细胞形态和细胞骨架的影响
目的:研究内源性大麻素(AEA)对体外培养牛眼小梁细胞形态和细胞骨架的影响,探讨大麻素在原发性开角性青光眼(POAG)中的降眼压的机制,为大麻素的眼部用药提供帮助.方法:原代培养的牛眼小梁细胞,经不同质量浓度的AEA作用后,于光学显微镜下观察小梁细胞形态的改变,免疫荧光染色后在荧光显微镜下观察肌动蛋白微丝束的形态改变.免疫组化(SABC法)对a-tubulin(微管蛋白)染色,结果以计算机图像分析系统分析,并统计学检验.结果:经AEA作用后的牛眼小梁细胞,细胞间隙扩大,细胞变圆,细胞立体感增强;肌动蛋白微丝纤维变稀疏,断裂,排列紊乱.各浓度组与对照组比较,微管蛋白的含量减少,其下调呈浓度依赖性.结论:大麻素可改变体外培养的小梁细胞的形态和细胞骨架,引起细胞内的微管蛋白含量的减少,有利于降低小梁网房水引流阻力.
