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放免法同时测定糜酶转基因小鼠心脏中血管紧张素转换酶及糜酶样活性
为研究糜酶的功能,本文利用蛋白酶抑制剂Lisinopril、Aprotinin及EDTA结合放射免疫分析的方法同时测定了糜酶转基因小鼠心脏组织中血管紧张素转换酶(angiotensin converting enzyme,ACE)及糜酶样活性.结果显示转基因小鼠心脏组织中糜酶比活力(0.274±0.071U/mg蛋白)较对照(0.152±0.021U/mg蛋白)显著升高,而ACE比活力不变(分别为0.172±0.029U/mg蛋白和0.177±0.019U/mg蛋白).同时测定出转基因小鼠心脏局部血管紧张素 II(angiotensinII,Ang II)含量(1984±184pg/g心脏组织)为对照(568±88pg/g心脏组织)的3倍.表明糜酶转基因小鼠心脏中可表达糜酶且糜酶能催化Ang II 的生成,而蛋白酶抑制剂结合放免分析是一种快速、灵敏的检测ACE及糜酶样活性的方法.
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内皮素家系的新成员--内皮素1-31
内皮素1-31(endothelins1-31,ETs1-31)是糜酶水解内皮素原产生的一种成熟内皮素,有ET-11 1-31、ET-21-31和ET-31-31三种异构体,目前已检测到ETs1-31分布于人、猴和仓鼠的粒细胞、肝脏、肺、气管、肾和肾上腺等组织.ETs1-31具有促细胞增殖、收缩平滑肌、升高平滑肌细胞游离Ca2+、引起炎性细胞趋化和致心律失常等生物学效应,也可经内皮素转换酶水解为ETs1-21而间接产生效应.ETs1-31很可能与支气管哮喘、先兆子痫、动脉粥样硬化和肾小球肾炎等疾病密切相关.
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兔动脉粥样硬化心脏局部RAS及TIMP-4对心脏胶原的影响及阿托伐他汀的干预
目的：建立兔动脉粥样硬化模型，观察兔动脉粥样硬化时心脏局部糜酶和TIMP-4的表达对心脏胶原的影响以及阿托伐他汀的干预效果。方法18只雄性新西兰大白兔，随机分为3组：正常对照组、动脉粥样硬化模型组、阿托伐他汀组。检测心脏局部糜酶及TIMP-4的表达、心脏局部AngⅡ含量及心脏胶原含量。结果 AS组心脏糜酶及心脏局部TIMP-4的表达显著高于C组和ATV组（P<0.01）；AS组的心脏局部AngⅡ及心脏胶原含量显著高于C组和ATV组（P<0.01）。结论动脉粥样硬化时心脏局部RAS的激活主要表现在糜酶、TIMP-4的表达增强和AngⅡ的明显升高，引起心肌胶原增生和纤维化。阿托伐他汀可以通过抑制糜酶及TIMP-4的表达来抑制心脏局部RAS的激活，从而抑制心肌胶原增生及纤维化。
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糜酶介导心脏成纤维细胞增殖中转化生长因子β1的作用
目的 探讨糜酶对大鼠心脏成纤维细胞(CFs)增殖的影响及其与转化生长因子β1(TGF-β1)信号的关系.方法 用胰酶消化法分离、培养新生SD大鼠的CFs.采用四氮唑盐(MTT)比色法(A4go值)测定细胞数目,[3H]脱氧胸腺嘧啶核苷([3H]-TdR)掺入法测定CFs的DNA合成速率,逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测TGF-β1的mRNA表达水平.结果 糜酶以剂量依赖方式增加CFs数目与DNA合成速率.15、30和60 ng/mL糜酶组的A490值分别为0.263±0.033、0.348±0.031和0.387±O.026,均明显高于对照组的A490值(O.201±0.019,P
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转化生长因子β1/Smad通路调控糜酶诱导心脏成纤维细胞胶原合成
背景心脏肥大细胞的糜酶参与心肌纤维化,但其作用机制尚不清楚.目的 探讨糜酶对大鼠心脏成纤维细胞(CFs)胶原合成的影响及其与转化生长因子β1(TGF-β1)/Smad信号通路的关系.方法 用胰酶消化法分离、培养新生SD大鼠的CFs,采用3H脯氨酸掺入法测定CFs的胶原合成,Western blot检测TGF-β1、磷酸化Smad2/3(P-Smad2/3)及总的Smad2/3的蛋白表达水平.结果 糜酶以浓度依赖方式增加CFs的3H脯氨酸掺入率.15、30和60μg/L组3H脯氨酸掺入率分别为(520±75)、(684±62)和(769±58)计数/(min·孔),均高于对照组[(435±60)计数/(min·孔),P<0.05或P<0.01].在30μg/L糜酶作用下,TGF-β1及P-Smad2/3蛋白表达水平呈时间依赖性改变,3、6和12 h组均高于对照组(P<0.05或P<0.01);而Smad2/3蛋白表达水平与对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05).TGF-β1中和抗体和p-Smad2/3抑制剂预处理组3H脯氨酸掺入率均低于30μg/L糜酶组(P<0.01).结论 糜酶具有促进CFs胶原合成的作用,其机制可能与TGF-β1/Smad信号通路的活化有关.
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糜酶对实验性大鼠肝纤维化的影响
目的:探讨糜酶在肝纤维化形成中的作用,为研发新型抗纤维化药物奠定基础,方法:30只(o)Wistar大鼠随机均分为3组.模型组以DMN制作肝纤维化模型;干预组除应用DMN外,同时给予糜酶抑制剂;正常组以生理盐水作对照,实验结束时进行组织学检查、电镜观察、血清肝纤维化指标、转化生长因子-β1 (TGF-β1)和糜酶样活性检测,结果:与模型组相比干预组肝内纤维间隔纤细,无明显假小叶.电镜显示干预组肝细胞损伤明显减轻,肝窦内胶原纤维较少,干预组血清透明质酸(HA)、层粘连蛋白(LN)、Ⅲ型前胶原(PCⅢ)、Ⅳ型胶原(CⅣ)、TGF-β1和肝内糜酶样活性均明显低于模型组(均P＜0.05).结论:糜酶通过直接或间接诱导TGF-β1的产生在肝纤维化形成中发挥重要作用,糜酶将成为未来新型抗肝纤维化药物的作用靶点.
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糜酶在心血管方面的研究进展
糜酶是一种糜蛋白酶型丝氨酸蛋白酶,主要由肥大细胞合成、储存和分泌,其分布具有种属和器官差异.糜酶是人类心血管局部AngⅡ生成的主要酶,参与了心血管病理性重构,如血管增生、心脏肥厚、动脉粥样硬化.糜酶抑制剂作为心血管疾病治疗药物将具有良好的发展前景.
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糜酶对糖尿病大鼠肾脏细胞外基质作用的研究
目的 观察糜酶在糖尿病大鼠肾损害过程中的作用. 方法 将大鼠随机分为正常对照(NC)组、DM组、应用糜酶抑制剂的DM(Chy-I)组,Chy-I组予糜酶抑制剂治疗12周. 结果 与DM 组比较,Chy-I组UAlb/Cr明显降低[(0.34±0.15)vs(1.38±0.95) g/μmol,P＜0.05],高胆固醇血症得到显著改善[(1.95±0.31) vs (2.31±0.30) mmol/L,P＜0.05],纤维粘连蛋白(FN)和Ⅳ型胶原(ColⅣ)基因表达下调(0.53vs0.71,P＜0.01；0.48vs0.58,P＜0.01). 结论 糜酶参与了大鼠DN的发生发展.
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糜酶与传统心血管危险因素的交互作用及其与糖尿病的相关性研究
目的 探讨糜酶与传统心血管危险因素的交互作用及其与糖尿病的相关性. 方法 选择城市社区55～75岁常住居民1197名,检测空腹与餐后血糖,根据检测结果选择血糖正常者71名、IGR者189例和糖尿病者80例行生化与免疫指标检测. 结果 校正年龄、性别、BMI与BP因素后,年龄、性别、超重、稳态模型评估的胰岛β细胞功能指数(HOMA-β)和稳态模型的胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)与糖尿病呈正相关;糜酶与年龄、性别、BMI、中心性肥胖、TC、TG、高胰岛素水平、HOMA-β和HOMA-IR的交互作用与糖尿病相关. 结论 传统心血管因素与糖尿病相关,糜酶及传统心血管危险因素的交互作用与糖尿病相关.
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从糜酶和肾素的转基因研究探索RAS在心肌重塑中的作用
心肌肥厚是多种心血管疾病中的一种病理改变,主要表现为心脏重塑包括心肌细胞肥大和间质成分的改变.心脏的结构与功能受到生理因素,血液动力学因素和神经体液因素等多种因素的调控,这些因素异常改变均可使心脏发生生理或病理的改变.在所有这些因素中,以肾素血管紧张素系统(RAS)及其受体为引人关注.RAS早作为循环内分泌系统被认识,主要参与血压调节.近年来发现在心脏等组织存在局部RAS,以自分泌,旁分泌和胞内分泌形式参与许多生理和病理过程.RAS在心脏中的作用主要通过可溶性多酶体系的级联反应形成的终末产物AngⅡ和其受体所介导.近年来关于心脏局部RAS在心脏重塑中的作用及机制研究已成为RAS研究的热点问题,但其详细作用机制尚不十分清楚,诸如:1.心脏局部RAS是否真实存在?2.心脏组织AngⅡ形成是否存在糜酶途径,该途径与ACE途径的相对贡献如何?3.糜酶与ACE途径是否存在时相性?4.糜酶对心脏重塑中是否有作用?5.肾素是心脏组织AngⅡ形成的限速因子吗?6.心脏组织中AngⅡ通过何种途径刺激心脏重塑?对上述问题的回答是揭示心脏局部RAS在心脏重塑中机制关键,针对这些研究热点我们从分子、细胞、整体动物模型等多个层次,从动态的观察角度对这些问题进行了探索.
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糜酶途径对人脐动脉平滑肌细胞增殖及细胞内ERK1/2表达的影响
目的 从细胞和分子水平探讨糜酶途径对平滑肌细胞(SMC)增殖的影响及其可能机制.方法 以血管紧张素Ⅰ(AngⅠ)刺激SMC的生长,并通过卡托普利、糜酶抑素及氯沙坦分别阻断血管紧张素转换酶途径、糜酶途径及ATI受体,用MTT法检测各组SMC的增殖情况,用Western blot检测各组SMC内细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)的表达变化.结果 Ang Ⅰ组、卡托普利组、糜酶抑素组、氯沙坦组与对照组相比SMC均增殖活跃(P<0.05),糜酶抑素组、氯沙坦组与Ang Ⅰ组相比明显抑制SMC的增殖(P<0.05).各组SMC内ERK1/2表达量无明显变化(P>0.05).结论 糜酶对SMC的增殖起重要作用.其分子机制有待进一步研究.
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潜阳解毒通络方对自发性高血压大鼠心肌纤维化的影响
目的：观察潜阳解毒通络方在自发性高血压大鼠(SHR)心肌组织胶原合成和心肌纤维化中的作用。方法12周龄雄性自发性高血压大鼠（SHR）分为SHR应用潜阳解毒通络方组（QYTL组）、SHR应用糜酶抑制剂组（Chy-I组）、SHR应用潜阳解毒通络方及糜酶抑制剂组（QY& Chy-I组）、SHR组，另设10只12周龄的雄性Wistar-Kyoto大鼠（WKY）为正常对照组。检测各组大鼠的收缩压、心肌胶原容积分数（CVF）、心肌血管周围胶原面积比（PVCA）和心肌糜酶及I、III型胶原mRNA表达水平。结果 QYTL组、QY& Chy-I组和Chy-I组心脏CVF、PVCA与SHR组比较显著下降（P＜0.01），与WKY组比较无显著差异。QYTL组、QY& Chy-I组和Chy-I组心肌组织I、III型胶原和糜酶mRNA表达相对含量均低于SHR组（P＜0.01），与WKY组比较无显著性差异。QYTL组、QY& Chy-I组大鼠血压与SHR比较有显著改变，Chy-I组大鼠血压与SHR比较无显著改变。结论心肌组织糜酶参与胶原的合成及细胞外基质的形成和降解，潜阳解毒通络方可能通过抑制糜酶途径改善心肌纤维化。
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超声成像技术分析糜酶转基因小鼠心脏功能
目的 应用小动物高频超声技术对糜酶转基因小鼠的心功能进行分析,以探索糜酶基因对心脏结构和功能的影响.方法 通过VisualSonics(R) Vevo770(R)高分辨率小动物超声系统检测不同年龄的转基因小鼠及对照小鼠包括心壁厚度、主动脉血流速度、左心室内径、左心室容积、每搏输出量、射血分数、短轴缩短率和心输出量等的心脏功能指标的改变进行比较分析.结果 随着小鼠年龄的增大,转基因阳性小鼠心壁厚度和主动脉血流速度逐渐增加,至6月龄时,转基因小鼠的左心室前壁收缩期厚度增加37%,增长率是对照小鼠的1.2 倍(P＜0.05);主动脉血流速度比对照小鼠高29%(P＜0.05);转基因阳性小鼠的左心室内径、左心室容积、每搏输出量、射血分数、短轴缩短率和心输出量等的心脏功能指标表现出和以上变化相一致的表型.结论 转基因小鼠糜酶表达水平升高,引起心脏AngⅡ形成增多,可使心肌细胞的收缩力提高;心肌细胞肥大,心壁增厚;且有随年龄增加的趋势, 可研究建立慢性、老年性肥厚型心脏病模型.
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从糜酶和肾素的转基因研究探索RAS在心肌重塑中的作用
立项背景心脏的结构与功能受到生理因素血液动力学因素和神经体NN素等多种因素的调控,这些因素异常改变均可使心脏发生生理或病理改变.在所有这些因素中,以肾素血管紧张素系统(RAS)及其受体为引人关注.RAS早作为循环内分泌系统被认识,主要参与血压调节.
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糜酶介导心脏成纤维细胞增殖的信息交流机制
目的 探讨糜酶介导大鼠心脏成纤维细胞(CFs)增殖的细胞内信息交流机制.方法 采用胰酶消化法分离、培养新生大鼠的CFs,通过四氮唑盐(MTT)比色法(A490值)测定细胞数目,免疫印迹法(Western blot)检测转化生长因子-β1(TGF-β1)、p-Smad2/3和过氧化物酶体增殖物激活受体α(PPARα)的蛋白表达水平.结果 糜酶促使CFs数目增加并呈剂量依赖性,15、30和60 μg/L组的A490值分别为0.263 ± 0.033、0.348 ± 0.031和0.387 ± 0.026,均较对照组(0.201 ± 0.019)显著增多(P<0.01).15、30和60 μg/L糜酶组的TGF-β1蛋白表达水平分别为0.968 ± 0.069,1.782 ± 0.058和2.656 ± 0.085,p-Smad2/3蛋白表达水平分别为0.506 ± 0.019,0.629 ± 0.038和0.883 ± 0.031,均明显高于对照组(0.333 ± 0.023和0.287 ± 0.016,P<0.05或<0.01).糜酶可减低CFs的PPARα蛋白表达水平,15、30和60 μg/L糜酶组的PPARα蛋白表达分别为0.430 ± 0.025、0.289 ± 0.026和0.165 ± 0.013,均较对照组(0.740 ± 0.041)显著减少(P<0.05或<0.01).结论 糜酶能促进大鼠CFS 增殖,其机制与TGF-β1和p-Smad2/3蛋白表达增加、PPARα蛋白表达减少有关,提示TGF-β1/Smad和PPARα信号通路存在信息交流.
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糜酶和传统心血管危险因素的交互作用与糖尿病前期关系的研究
目的 探讨糜酶和传统心血管危险因素的交互作用与糖尿病前期(PDS)的关系,为糖尿病(DM)的机制研究提供依据.方法 2009年7-9月采用简单随机抽样方法抽取我市社区1 197例55~75岁的常住居民进行空腹血糖(FBG)与餐后2 h血糖检测,根据结果再随机抽取71例糖耐量正常者(NG组)和189例PDS者(PDS组)进行生化及免疫指标的检测与比较,并对糜酶和传统心血管危险因素的交互作用与PDS的关系进行分析.结果 (1)PDS组的FBG、餐后2 h血糖、空腹胰岛素、胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)、收缩压(SBP)、腰围、腰臀比均高于NG组,而PDS组的β细胞敏感性指数(HOMA-β)低于NG组(P＜0.05).(2)单因素Logistic回归分析显示:年龄(60~64岁)、高血压、中心性肥胖(是)、胰岛素升高(中)、HOMA-β降低(＞85.96)和HOMA-IR升高(中、高)与PDS呈正相关,且不同的血压、HOMA-β和HOMA-IR存在线性趋势.多因素Logistic回归分析显示:中心性肥胖(是)、胰岛素升高(中)、HOMA-β降低(＞85.96)和HOMA-IR升高(中、高)与PDS呈正相关,且不同的年龄、血压、体质指数(BMI)、HOMA-β、HOMA-IR和糜酶水平存在线性趋势.(3)相关性分析显示:糜酶＜21.16 μg/ml且BMI≥24 kg/m2、糜酶≥21.16 μg/ml且中心性肥胖、糜酶≥21.16 μg/ml且TC≥5.20 μg/ml、糜酶≥21.16 μg/ml且胰岛素≥6.00 mU/L、糜酶≥21.16 μg/ml且HOMA-β＜57.82、糜酶＜21.16 μg/ml且HOMA-IR≥1.58、糜酶≥21.16 μg/ml且HOMA-IR≥1.58的交互作用与PDS存在相关性.结论 传统心血管因素与PDS存在相关性,糜酶和传统心血管危险因素的交互作用与PDS存在相关性,糖尿病的一些危险因素在PDS就已存在.
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慢性乙型肝炎肝组织糜酶活性与肝纤维化相关性研究
目的 探讨慢性乙型肝炎患者肝组织糜酶活性与肝纤维化相关性.方法 收集2009年1月至2012年3月延边大学附属医院消化科住院的慢性乙型肝炎患者46例,按肝脏病理肝纤维分级(S1～S4)进行分组,S1组10例,S2组15例,S3组15例,S4组6例；采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测肝组织中糜酶活性,采用胃酶酸解法测定肝组织胶原纤维及羟脯氨酸(HYP)含量,经Masson染色后直接测量胶原纤维面积与视野总面积比值,以该比值作为胶原纤维的相对含量.观察比较各组肝组织糜酶活性、胶原纤维含量和HYP含量.结果 S3组和S4组肝组织糜酶活性、肝脏胶原纤维含量及HYP含量均较S1组、S2组明显升高,差异有统计学意义(P＜0.01),且纤维化程度重组(S3+S4)肝组织糜酶活性、胶原纤维含量及HYP含量明显高于纤维化轻组(S1+S2)(P＜0.01)；肝组织糜酶活性与肝组织胶原氨酸含量和HYP含量呈正相关,相关系数分别为0.685(P ＜0.05)和0.702(P＜0.01).结论 慢性乙型肝炎患者肝组织中糜酶活性与肝组织胶原纤维含量和HYP含量呈正相关,可作为肝纤维化的评价指标之一.
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肝组织中糜酶浓度在慢性肝炎肝纤维化中的意义
目的:为探讨肝组织中糜酶(Chymase)浓度在慢性病毒性肝炎肝纤维化中的意义.方法:采用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测45例慢性肝炎肝组织中Chymase浓度,观察不同的纤维化分期(S1-S4),其肝组织中Chymase浓度;用免疫组织化学染色法观察Chymase单克隆抗体标记的肥大细胞分布情况.结果:慢性肝炎纤维化分期重的S3和S4患者,其肝组织中Chymase浓度(S3+S4=31.3±24.6 ng/mg)明显高于纤维化轻的S1和S2患者(S1+S2=5.7±4.8 ng/mg),P＜0.01;免疫组化染色结果,Chymase标记的肥大细胞主要分布于纤维化旺盛的汇管区与类洞壁,其分布与纤维化部位相一致,且肝组织中Chymase浓度高的患者,其肝组织内Chymase标记的肥大细胞分布增多.结论:肝组织中Chymase浓度可能与慢性肝炎肝纤维化关系密切.
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抑糜酶素对急性心肌缺血大鼠室性心律失常的影响
目的：探讨抑糜酶素（ chymostatin ）对急性心肌缺血－再灌注室性心律失常的影响。方法 SD大鼠冠状动脉前降支结扎20 min后再灌注20 min，于建模前30 min腹腔注射抑糜酶素或生理盐水。采集心电图和心外膜电位图测定心率、90％单相动作电位复极时程（90％repolarization of action potential duration ， APD90）、动作电位离散度（APD dispersion， APDd），以积分法分析室性心律失常。放射免疫化学测定血管紧张肽Ⅱ（ angiotensinⅡ，AngⅡ），生物化学测定血管紧张肽Ⅰ转化酶（ angiotensin converting enzyme ， ACE）和糜酶活性。组织免疫荧光观察糜酶在心肌组织中表达。结果心肌缺血引起室性心律失常，APD90缩短及APDd增加，抑糜酶素降低室性心律失常积分，减轻缺血引起的APD90缩短及APDd扩大（P＜0．05）；心肌缺血时心肌组织局部糜酶和ACE活性，血浆和组织AngⅡ水平明显升高，抑糜酶素抑制组织糜酶活性并降低心肌组织AngⅡ（P＜0．05），对ACE活性、血浆AngⅡ水平无明显影响（P＞0．05）。结论抑糜酶素具有改善APD离散度及抗缺血性室性心律失常作用，其机制可能与抑制缺血心肌组织局部糜酶依赖性AngⅡ生成有关。
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心脏糜酶在自发性高血压大鼠心肌纤维化中的作用
目的观察心脏糜酶在自发性高血压大鼠(SHR)心肌组织胶原合成和心肌纤维化中的作用.方法应用病理检查、计算机分析结合逆转录-聚合酶链式反应等方法,检测SHR应用糜酶抑制剂(Chy-Ⅰ)组、SHR(SHR)组及对照组(WKY)组收缩压、心肌胶原容积分数(CVF)、心肌血管周围胶原面积比(PVCA)和心肌糜酶及Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA表达.结果 Chy-Ⅰ组心脏CVF、PVCA分别为(26.8±8.7)%和0.4±0.1,SHR组分别为(46.4±7.8)%和1.9±0.9,WKY组为(24.4±10.7)%和0.4±0.1,Chy-Ⅰ组比SHR组明显下降(P＜0.01),与WKY组无明显差别(P＞0.05).Chy-Ⅰ组心肌组织Ⅰ、Ⅲ型胶原和糜酶mRNA表达相对含量均明显低于SHR组(P＜0.01),与WKY组无明显差别(P＞0.05).应用Chy-Ⅰ后大鼠血压无改变.结论心肌组织糜酶参与胶原的合成,参与细胞外基质的形成和降解,促进自发性高血压大鼠心肌纤维化.
