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沉默长链非编码RNA HOTAIR对直肠腺癌细胞放射敏感性的影响
目的 探讨沉默长链非编码RNA HOTAIR对直肠腺癌细胞株SW480和HCT116细胞增殖、放射敏感性和凋亡的影响.方法 通过实时荧光定量 PCR检测直肠腺癌细胞株中 lncRNA HOX转录反义RNA (lncRNA HOTAIR)的表达水平.应用RNA干扰技术沉默HOTAIR的表达,分析其在细胞增殖、细胞放射敏感性和凋亡中的作用.对细胞株进行梯度剂量照射后,检测其放射敏感性和细胞凋亡情况.结果 直肠腺癌细胞株SW480和HCT116中的lncRNA HOTAIR的相对表达水平明显高于直肠黏膜细胞系.克隆形成试验结果显示,与对照siRNA转染组比较,在细胞株SW480和HCT116中 siRNA-HOTAIR 的放射增敏比分别为 1. 58 和 1. 33.沉默直肠腺癌细胞中的 lncRNA HOTAIR可增加直肠腺癌 SW480 细胞株的凋亡率及放射敏感性.结论 直肠腺癌中 lncRNA HOTAIR的表达水平与细胞放射敏感性之间存在相关性,其有可能是预测直肠腺癌细胞放射敏感性的指标之一.放射联合应用siRNA-HOTAIR对直肠腺癌细胞株SW480和HCT116有抑制细胞增殖、诱导凋亡和放射增敏的作用.
关键词： 直肠肿瘤 lncRNA HOTAIR 辐射耐受性 细胞增殖 细胞凋亡 -
尼妥珠单抗对食管鳞癌ECA-109和TE-13细胞放射敏感性的影响及其发生机制
目的：探讨尼妥珠单抗对食管癌ECA?109和TE?13细胞放射敏感性的影响及其发生机制。方法体外培养人食管癌ECA?109和TE?13细胞，分为空白组、照射组、药物组和联合组（照射＋药物治疗）。联合组ECA?109、TE?13细胞在照射前24 h给予尼妥珠单抗处理，照射后2 h 收集细胞。克隆形成实验检测尼妥珠单抗对人食管癌ECA?109和TE?13细胞的放射增敏作用。流式细胞术检测各组细胞的凋亡情况。 Western blot 检测表皮生长因子受体（ EGFR ）、磷酸化表皮生长因子受体（p?EGFR）、DNA依赖蛋白激酶催化亚单位（DNA?PKcs）、磷酸化 DNA 依赖蛋白激酶催化亚单位（p?DNA?PKcs）和磷酸化组蛋白 H2AX（γH2AX）的表达。结果 ECA?109细胞联合组的准阈剂量（ Dq ）、平均致死量（ D0）和细胞受到2 Gy照射后的存活分数（ SF2）分别为1．11、1．40和0．42，照射组分别为1．72、2．14和0．66，差异均有统计学意义（均P＜0．05）；TE?13细胞联合组的Dq、D0和细胞受到2 Gy照射后的SF2分别为0．41、0．43和0．40，照射组为0．46、0．65和0．71，差异均有统计学意义（均P＜0．05）。尼妥珠单抗对ECA?109细胞和TE?13细胞的放射增敏比为1．35和1．43。流式细胞仪检测结果显示，ECA?109细胞和TE?13细胞联合组的细胞凋亡率均高于照射组，差异均有统计学意义（均P＜0．05）。 Western blot结果显示，ECA?109细胞和TE?13细胞各组的EGFR和DNA?PKcs的蛋白表达水平均无明显变化（均P＞0．05）。 ECA?109细胞和TE?13细胞中，照射组p?EGFR和p?DNA?PKcs的表达水平均高于空白组，照射组和药物组γH2AX的表达水平均高于空白组，差异均有统计学意义（均P＜0．05）。与照射组和药物组比较，联合组p?EGFR和p?DNA?PKcs蛋白的表达水平均明显降低（均P＜0．05），而γH2AX蛋白表达水平均明显升高（均P＜0．05）。结论尼妥珠单抗可提高食管癌ECA?109和TE?13细胞的放射敏感性，其机制可能与抑制EGFR磷酸化及其下调DNA损伤修复蛋白的表达有关。细胞分化程度越低，尼妥珠单抗放射增敏作用越强。
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下调Chk1和Chk2基因促进射线照射后HeLa细胞凋亡
目的 探讨下调Chk1和Chk2基因对HeLa细胞射线照射后细胞周期和凋亡的影响及其作用机制.方法 应用流式细胞仪检测不同剂量60Co照射引起的HeLa细胞周期和凋亡的动力学变化,以激光共聚焦显微镜和Western blot法检测转染Chk1和Chk2正义寡核苷酸(sODN)和反义寡核苷酸(AsODN)对Chk1和Chk2蛋白表达的影响,以AnnexinV-PI法、凋亡细胞的周期特异性检测法及透射电镜观察单独或联合转染Chk1和Chk2反义寡核苷酸对射线照射后HeLa细胞凋亡的影响.结果 不同剂量的60Co照射可引起Hela细胞小同程度的G2/M期阻滞,15 Gy的60Co照射48 h后,G2/M期细胞可达75.53%±3.72%.当细胞周期阻滞解除后,细胞凋亡明显增加.转染Chk1 AsODN组的早期凋亡、晚期凋亡和死亡细胞共有94.42%±4.78%,明显高于转染Chk1 sODN组(44.35%±2.08%,P<0.0001);转染Chk2 AsODN组的凋亡细胞共有93.08%±5.24%,明显高于转染Chk2 sODN组(48.98%±3.35%,P<0.0001);而共转染Chk1和Chk2 AsODN组的凋亡细胞共有94.26%±4.92%,明显高于共转染Chk1和Chk2 sODN组(42.46%±2.56%,P<0.0001);共转染Chk1和Chk2AsODN组与仅转染Chk1 AsODN或Chk2 AsODN组比较,差异无统计学意义(P>0.05).凋亡细胞的周期特异性检测结果显示,转染Chk1和Chk2 sODN引起的凋亡主要来自于G1期细胞,而转染Chk1 AsODN或Chk2 AsODN后,G1期、S期、G2/M期的凋亡细胞均较对应sODN转染组明显增加,尤其共转染Chk1和Chk2 AsODN组更为显著.结论 射线照射激活细胞周期检测点信号传导通路引起细胞自我保护,是临床上产生放疗抵抗的主要原因,而阻断该信号通路的关键激酶Chk1或Chk2,可显著增强细胞的放射敏感性,其机制在于改变了凋亡细胞的周期特异性,凋亡细胞可以来自G1、S、G2/M各周期的细胞.
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直肠癌术前放疗敏感性相关分子标志物多因素logistic分析及疗效预测模型建立
目的：研究影响直肠癌患者术前放疗敏感性的相关分子标志物，建立logistic回归模型，通过直肠癌术前分子标志物表达水平预测直肠癌术前放疗的敏感性。方法回顾性分析2010年1月至2015年1月直肠癌术前放疗患者33例，收集所有患者放疗前血清癌胚抗原（CEA）、肿瘤血管内皮生长因子（VEGF）、表皮生长因子受体（EGFR）、Ki-67及胸苷酸合成酶（TS）免疫组织化学表达情况以及放疗前影像资料[CT或磁共振成像（MRI）]、术前临床分期、术后病理分期。根据术后病理评价术前放疗疗效，分为有效（完全缓解及部分缓解）、无效（稳定及疾病进展）。运用SPSS 17.0软件将上述分子标志物表达情况与术前放疗效果进行logistic二元回归分析，建立疗效预测模型。结果经单因素及多因素logistic二元回归分析显示，CEA、VEGF、Ki-67为直肠癌术前放疗敏感性的相关因素。建立的分子标志物预测模型为log P＝1.700-0.276×CEA-0.238×VEGF-0.135×EGFR+1.377×TS+0.080×Ki-67。血清CEA水平越高、VEGF的表达越高，患者对放疗的敏感性可能越低；Ki-67表达越高，患者对放疗可能越敏感。结论检测CEA、VEGF、Ki-67的表达水平可能为预测直肠癌术前放疗敏感性相对有效的手段。
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依据体内基因表达数据构建子宫颈癌辅助放疗敏感模型初探
目的 基于子宫颈癌组织基因表达情况构建放疗敏感模型,探讨应用模型判断辅助放疗获益人群的可行性.方法 利用癌症和肿瘤基因图谱(TCGA)子宫颈癌数据库选取行单纯根治性手术切除病例和根治性手术后辅助外放疗的患者.以无复发生存(RFS)时间作为终点,采用多因素Cox回归分析法筛选放疗特异性候选基因.以基因回归系数和表达值乘积之和作为权重放疗敏感指数.应用时间依赖受试者工作特征(ROC)曲线分析该模型对RFS预测的准确性.应用Kaplan-Meier生存曲线联合Log-rank检验分析不同放疗敏感组间RFS的差异.结果 数据库中子宫颈癌临床表型数据集中行根治性手术切除病例155例,其中完成辅助外放疗18例,转录组和微RNA(miRNA)数据库探针过滤后分别有17156个基因和480个miRNA纳入分析.终有23个基因符合统计学标准,经分层聚类分析这些基因为7个聚类,终确立MAT2A、PIGY、SUSD1、ZNF341、TMEM85、HIF1AN和CLEC18A作为构建放疗敏感模型的基因,根据这7个基因构建放疗敏感指数,中位值为0.726(-5.501～9.046).在单纯根治性手术组中,对脉管内癌栓校正后,7个基因敏感指数依然是RFS独立预后因素(HR=1.456,95％CI 1.192～1.780,P<0.01);在根治性手术后辅助放疗组中,对盆腔淋巴结阳性数校正后,7个基因敏感指数依然是RFS独立预后因素(HR=0.572,95％CI 0.328～0.998,P=0.049).时间依赖性ROC曲线分析表明,7个基因放疗敏感指数均优于N分期及脉管内癌栓对3、5年RFS率预测的准确性.结论 依据基因表达数据构建的子宫颈癌辅助放疗敏感模型具有判断术后放疗获益人群的潜在价值.
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食管鳞状细胞癌患者程序性死亡受体配体1表达及其与放疗敏感性及预后的关系
目的 探讨食管鳞状细胞癌(ESCC)组织中程序性死亡受体配体1(PD-L1)的表达与临床病理特征、放疗敏感性以及预后之间的关系.方法 以2012年6月至2015年12月经川北医学院附属医院病理科确诊并完成根治性放疗的90例ESCC患者为研究对象,以20例正常食管黏膜组织作对照.采用免疫组织化学SP法检测PD-L1表达情况.结果 PD-L1在ESCC组织中的阳性表达率高于正常食管黏膜[56.7 %(51/90)和15.0 %(3/20),χ2=11.367,P<0.05].PD-L1表达与患者年龄、性别、肿瘤大直径、病变长度、周围组织侵犯、临床分期及原发肿瘤体积均无关(均P>0.05),与淋巴结转移有关(χ2=4.404,P=0.036).放疗敏感组PD-L1阳性表达率[63.2 %(43/68)]高于放疗抗拒组[39 %(8/22)](χ2=4.888,P<0.05).单因素分析结果显示,肿瘤大直径、放疗敏感性GTV-T与ESCC患者PFS(χ2=6.239,P=0.013;χ2=6.852,P=0.008;χ2=6.312,P=0.012)、总生存(OS)(χ2=8.170,P=0.004;χ2=4.261,P=0.039;χ2=5.003,P=0.025)有关.多因素分析结果显示,放疗敏感性影响ESCC患者PFS(OR=0.512,95 % CI 0.275~0.954,P=0.035);肿瘤大直径影响ESCC患者的OS (OR=0.507,95 % CI 0.266~0.968,P=0.039).结论 PD-L1在ESCC组织中表达高于正常食管黏膜组织.PD-L1不能作为预测食管癌放疗患者预后的指标,可能作为预测食管癌转移潜能和放疗敏感性的生物标志物.
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UHRF1蛋白在乳腺癌组织中的表达及其与局部复发的相关性
目的 分析UHRF1蛋白在乳腺癌组织及癌旁正常组织中的表达及其与局部复发的相关性.方法 采用免疫组织化学方法 检测69例乳腺癌组织及33例癌旁正常组织中UHRF1蛋白的表达.采用χ2检验分析UHRF1蛋白表达与患者临床特征之间的关系.结果 UHRF1蛋白在乳腺癌组织中的阳性表达率为55.1%(38/69),癌旁正常乳腺组织中未见UHRF1蛋白表达.UHRF1蛋白在Ⅲ期患者中的阳性表达率高于Ⅰ~Ⅱ期患者[68.4%(26/38)比38.7%(12/31),P<0.05],在放疗后1年胸壁复发患者中阳性表达率高于未复发患者[83.3%(10/12)比49.1%(28/57),P<0.05],而不同年龄及不同Herb-2表达状态患者间UHRF1蛋白阳性表达率比较,差异均无统计学意义(均P>0.05).结论 UHRF1蛋白在乳腺癌组织中的阳性表达率高于癌旁正常组织,其与分期及放疗后胸壁的局部复发相关.
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基于全基因组拷贝数变异筛查食管鳞状细胞癌放射敏感相关性基因
目的 通过基因芯片技术进行全基因组拷贝数变异(CNV)分析,筛查与食管鳞状细胞癌(ESCC)放射敏感相关性的基因.方法 选择2013年12月至2016年8月安阳市肿瘤医院放疗科接受单纯放疗且该院病理中心留存有活组织检查石蜡标本的ESCC患者,分为放疗敏感组和放疗抗拒组.对两组患者的石蜡标本进行DNA提取,利用美国Affymetrix公司的OncoScan Array平台设计的基因芯片检测人全基因组CNV,筛选两组样本的基因片段差异.结果 共收集到19例ESCC患者的标本进行DNA提取,为方便配对分析,从DNA样品质检合格的患者中选取10例,其中放疗敏感组和放疗抗拒组各5例.两组患者性别、年龄、病变部位、病变长度、放疗剂量差异均无统计学意义(均P>0.05).杂合性缺失(LOH)是主要的CNV类型.放疗抗拒组中,10号染色体q24.32-q24.33区域与18号染色体q21.2-q21.31区域检测到LOH的频率为100％,而在放疗敏感组中未检测到.放疗敏感组中,4号染色体q27-q28.1区域检测到LOH的频率为80％,而在放疗抗拒组中未检测到.结论10q/18q LOH与ESCC放射抗拒相关,4q LOH与ESCC放射敏感相关.
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非小细胞肺癌血管内皮生长因子和胰岛素样生长因子1受体的表达与放射敏感性的相关性研究
目的 研究非小细胞肺癌(NSCLC)中血管内皮生长因子(VEGF)和胰岛素样生长因子1受体(IGF-1R)的表达与放射敏感性之间的关系.方法 对64例行根治性放疗的NSCLC患者,进行近期疗效评价,检测VEGF及IGF-1R结果,明确这两项指标与放射敏感性之间的相关性.结果 近期疗效为CR12例(18.8%),PR30例(46.9%),局部有效率为65.6%.在VEGF表达阴性的24例中放疗达有效者20例(83.3%),阳性40例中达有效者22例(55.0%)(P＜0.05).在IGF-1R表达阴性的12例中放疗达有效者10例(83.3%),高于阳性52例中达有效者32例(58.2%)(P＞0.05).结论 NSCLC中VEGF的阴性表达与肿瘤近期疗效呈正相关,对放射敏感.VEGF表达可作为评估肿瘤放射敏感性的指标之一.
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RNA干扰沉默STAT3基因增强人喉癌细胞放射敏感性的实验
目的 探讨RNA干扰沉默信号转导及转录活化因子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)基因对人喉癌Hep-2细胞放射敏感性的影响.方法 构建STAT3短发夹RNA(short halrpin RNA,shRNA)真核表达质粒pshSTAT3,将PshSTAT3和阴性对照质粒(pshNeg)转染喉癌Hep-2细胞,24小时后以60Co γ射线0、2、4、6、8、10 Gy照射,培养48小时后,MTT法检测细胞增殖状态,流式细胞术检测细胞凋亡率、6 Gy射线照射后的STAT3、p-STAT3、B淋巴细胞2(bcl-2)蛋白的表达.结果 成功构建STAT3重组质粒pshSTAT3,质粒转染人喉癌Hep-2细胞后,pshSTAT3与pshNeg组和空白对照组相比,细胞增殖明显受抑制,凋亡率明显升高(P<0.05).pshSTAT3+照射组STAT3、p-STAT3、bcl-2的蛋白表达量均明显低于空白对照组、单纯照射组、pshNeg组、pshNeg+照射组和pshSTAT3组(P<0.05),p-STAT3蛋白表达与bcl-2表达呈正相关(r=0.974,P<0.05).结论 RNA干扰抑制STAT3基因表达能提高Hep-2细胞对放射线的敏感性,STAT3基因可能是联合放疗治疗头颈肿瘤的理想靶点.
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反义表皮生长因子受体纳米颗粒对小鼠头颈鳞状细胞癌放疗增敏的实验
R纳米颗粒明显抑制EGFR蛋白的表达情况;反义EGFR纳米颗粒与放疗联合降低了肿瘤细胞克隆形成能力及生长能力(P<0.05);肿瘤细胞发生G1期阻滞,细胞凋亡率增加(P<0.05).体内实验发现反义EGFR纳米颗粒组肿瘤生长明显延缓.结论 反义EGFR纳米颗粒通过下调EGFR的表达,使SCC Ⅶ细胞发生G1期阻滞,具有放疗增敏效应.
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染料木黄酮增强喉癌Hep-2细胞放射敏感性的研究
目的：探讨染料木黄酮联合放疗对人喉表皮样癌细胞Hep-2放射敏感性的影响。方法细胞分为对照组、放疗组、木黄酮组和放疗+木黄酮组。5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（5-ethynyl-2'-deoxyuridine，EdU）检测放疗组、木黄酮组和放疗+木黄酮组对Hep-2细胞增殖的短期效应的影响。克隆形成实验检测0、2、4、6、8 Gy X线照射后放疗组和放疗+木黄酮组细胞存活率，Graphpad Prism拟合单击-多靶模型细胞存活曲线，分析比较放疗组和放疗+木黄酮组对细胞增殖性死亡的影响。结果放疗+木黄酮组能明显抑制细胞的增殖活性；10μmol/L木黄酮作用后，放射增敏比（sensitization enhancement ratio，SER）为1.412。结论木黄酮通过抑制DNA合成抑制Hep-2细胞增殖，并且作为放疗辅助药物可以增强Hep-2细胞放射敏感性。
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人喉癌Hep-2细胞株CD133+肿瘤干细胞生物学特性研究
目的 研究喉癌Hep-2细胞株中CD133+肿瘤细胞的干细胞特性及其生物学特性.方法 流式细胞仪分选Hep-2细胞株中CD133+肿瘤细胞,Transwell法检测CD133+肿瘤细胞侵袭能力及三代克隆形成能力；CD133+肿瘤细胞与紫杉醇共培养,10 Gy的直线加速器照射CD133+肿瘤细胞,四甲基偶氮唑蓝法计算其相对存活率和生长抑制率,观察其放化疗抵抗性.结果 CD133+细胞比例为3.1％±0.2％,流式细胞仪分选纯度可达90.2％±5.5％,分选后的CD133+细胞贴壁,呈团块状、克隆球状生长.增殖速度明显较CD133-细胞快；Transwell实验中,相同视野CD133+细胞穿膜细胞数(526±39)个/每视野,而CD133-细胞为(220±20)个/每视野,二者差异有统计学意义(t=22.08,P＜0.01)；CD133+细胞三代克隆形成率分别为30.0％±4.7％、32.2％±3.6％、32.7％±3.4％,CD133-细胞三代克隆形成率分别为15.2％±2.2％、12.0％±2.5％、13.8％±3.3％,同代比较差异有统计学意义(t值分别为8.99、14.66、12.69,P值均＜0.01).在紫杉醇共培养体系中,CD133+细胞24 h、48 h、72 h的相对存活率分别为90.1％±5.9％、85.1％±7.1％、70.3％±6.4％,均高于同时期对照组CD133-细胞(t值分别为5.24、8.18、8.14,P值均＜0.01)；放射线照射后,CD133+细胞生长抑制率30.0％±7.1％,显著低于CD133-细胞的55.0％±6.3％(t=8.30,P＜0.01).结论 CD133+ Hep-2细胞所占比例较小,具有强的增殖、侵袭能力及克隆形成能力,对放化疗有抵抗性,具有干细胞特性.靶向CD133+肿瘤细胞,有望有效杀伤喉癌干细胞.
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微小RNA-15a/16-1重组慢病毒对人鼻咽癌CNE-2Z细胞生物特性的影响
目的 探讨微小RNA(microRNA,rniR)-15a/16-1重组慢病毒对人鼻咽癌CNE-2Z细胞生物特性的影响,并探讨其可能机制.方法 重组慢病毒和空载体慢病毒转染CNE-2Z细胞后筛选绿色荧光蛋白阳性细胞,实时定量PCR (RT-qPCR)检测miR-15a、miR-16-1表达水平；将实验分为对照组、转染组、放射线照射组、转染联合放射线照射组,四甲基偶氮唑蓝法分析各组细胞增殖情况；流式细胞术检测各组细胞凋亡情况；克隆形成实验分析对照组和转染组对放射线敏感性的变化；RT-qPCR、Western blot法检测bcl-2 mRNA及其蛋白的表达水平；分光光度法检测Caspase-2、Caspase-3的活化程度.结果 转染组miR-15a、miR-16-1相对表达量((x)±s,下同)分别为524.80±40.79、466.11±40.96,同对照组比较,差异有统计学意义(t=494.611,t=386.840,P=0.000)；转染联合放射线照射组细胞增殖抑制明显(F =424.255,P=0.000).对照组、转染组、放射线照射组及转染联合放射线照射组的细胞凋亡率分别为(2.2±1.4)％、(9.6±0.8)％、(2.9±1.1)％、(18.6±0.7)％,差异有统计学意义(F=158.519,P=0.000).转染组同等剂量下(2、4、6、8 Gy)存活分数、平均致死剂量(mean lethal dose,Do)、准阈剂量(quasi-threshold dose,Dq)均低于对照组.二者放射增强比(sensitization enhancement ratios,SER) (Do)、SER(Dq)分别为1.473、1.581.转染组、放射线照射组、转染联合放射线照射组bcl-2 mRNA表达相对量组间比较差异无统计学意义(P＞0.05).转染联合放射线照射组bcl-2蛋白表达下降明显,转染组次之；对照组、放射线照射组、转染组、转染联合放射线照射组的Caspase-2活化程度分别为0.12 ±0.01、0.24±0.04、0.35±0.02、0.44±0.04(F=115.500,P=0.000),Caspase-3的活化程度分别为0.13±0.01、0.27±0.01、0.43±0.02、0.83±0.06(F =439.921,P=0.000).结论 重组慢病毒LV-miR15a/16-1可提高CNE-2Z细胞中miR-15a、miR-16-1的表达水平,抑制CNE-2Z细胞的增殖；促进CNE-2Z细胞的凋亡,增强CNE-2Z细胞的放射线敏感性.其可能通过抑制CNE-2Z细胞中bcl-2蛋白的表达,促进Caspase-2、Caspase-3的活化以实现对鼻咽癌细胞CNE-2Z生物学特性的调控.
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3-甲基腺嘌呤对人下咽癌细胞的放射增敏效应及其机制研究
目的 探讨自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-methyladenire,3-MA)对人下咽癌细胞(Fadu 细胞)的放射增敏作用及其机制.方法 用5mmol/L的3-MA联合2 Gy、4 Gy剂量X线照射作用于Fadu细胞,克隆形成实验和单细胞凝胶电泳技术分别检测各处理组的细胞存活率(克隆形成率)和DNA损伤程度(尾矩),采用两组独立样本的t检验分析各组间差异；用不同浓度的3-MA(1、2、5、10 mmol/L)分别作用于细胞,流式细胞仪检测各组细胞周期并应用单因素方差分析比较组间差异.Western blot检测各组p62和CyclinB1的蛋白表达水平.结果 单独使用3-MA对细胞存活率和DNA 损伤程度无明显影响；与不加3-MA组相比,加3-MA组细胞在2 Gy和4 Gy剂量的X线作用下细胞存活率显著降低(t值分别为13.41、13.98,P值均＜0.001),DNA损伤程度明显加重(t值分别为7.07、6.91,P值均＜0.001).对照组和1、2、5、10 mmol/L浓度3-MA作用后的G2/M期细胞百分数分别为(17.10±1.20)％、(23.30±2.36)％、(39.90±3.12)％、(58.47±1.65)％、(76.13±3.51)％,组间差异有统计学意义(F=278.4,P＜0.001).Western blot方法检测,3-MA作用于细胞后,p62蛋白表达水平呈剂量依赖性上升,CyclinB1蛋白表达水平呈剂量依赖性下降.结论 自噬抑制剂3-MA能加强X线对人下咽癌细胞的致DNA损伤作用和引起G2/M期阻滞,从而具有放射增敏效应.
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塞来昔布联合放射对鼻咽癌细胞株凋亡的影响
目的 探讨塞来昔布联合放射对人鼻咽癌细胞株CNE-2Z凋亡的影响及其可能的机制.方法 实验分4组进行,分别为对照组、药物组(25μmol/L塞来昔布)、照射组(8 Gy X线)和实验组(25 μmol/L塞来昔布+8 Gy X线照射).克隆形成实验检测塞来昔布对CNE-2Z细胞的放射增敏作用;流式细胞仪检测肿瘤细胞凋亡率;免疫细胞化学染色检测B淋巴细胞-2(Bcl-2)、凋亡活化基因(Bax)蛋白表达;Western blot技术检测Caspase-3蛋白表达.结果 塞来昔布对人鼻咽癌细胞CNE-2Z有放射增敏作用,实验组中CNE-2Z细胞平均存活分数为0.50,细胞平均致死剂量为2.36,与对照组比较差异有统计学意义(P值均＜0.01);塞来昔布联合放射能够上调Bax的蛋白表达,对照组Box表达评分为1.221 ±0.116,实验组为2.758±0.256;同时抑制Bcl-2蛋白表达,对照组Bel-2表达评分为2.559±0.144,实验组为1.253±0.114,差异均有统计学意义(P值均＜0.05);并明显增加肿瘤细胞的凋亡率(F=7.63,P＜0.01),差异有统计学意义;Western blot结果显示实验组Caspase-3蛋白表达增强.结论 Cox-2抑制剂塞来昔布联合放射能诱导人鼻咽癌细胞株CNE-2Z凋亡,具有放射增敏作用.
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大非毒性剂量汉防己甲素对人鼻咽癌细胞放疗增敏作用的研究
目的 探讨大非毒性剂量汉防己甲素(tetrandrine,Tet)对人鼻咽癌细胞株CNE1和CNE2的放射增敏作用.方法 采用单纯放射线照射和Tet联合放射线照射对CNE1和CNE2细胞株进行处理,中性彗星电泳检测不同方式处理组中CNE1和CNE2细胞DNA损伤,流式细胞仪检测细胞周期和细胞凋亡率.结果 单纯放射线照射组CNE1和CNE2细胞平均彗星尾矩(tail moment,TM)分别为(7.13±3.70)(x-±s)、(11.52±4.04),Tet联合放射线照射组平均TM分别为(13.61 ±5.45)、(18.85±6.18),差异有统计学意义(t值分别为2.784和3.089,P值均＜0.05).单纯放射线照射组CNE1和CNE2细胞周期以G2期为主,分别为(42.62±2.07)％、(34.82±2.74)％,Tet联合放射线照射组分别为(17.02±1.87)％、(19.64±4.82)％,差异有统计学意义(t值分别为23.173和16.500,P值均＜0.01).单纯放射线照射组CNE1和CNE2细胞凋亡率分别为(17.24％±0.99)％、(16.68％±0.27)％,Tet联合放射线照射组分别为(19.11±1.24)％、(18.51±2.41)％,差异无统计学意义(P值均＞0.05).结论 大非毒性剂量Tet能增加人鼻咽癌细胞株CNE1和CNE2的放射敏感性,其机制可能与去除放射线照射诱导的G2/M期阻滞,降低细胞修复DNA双链断裂能力有关.
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放射线照射诱导鼻咽癌细胞上皮-间质转化的作用研究
目的 体外实验探讨放射线照射对鼻咽癌细胞上皮-间质转化的影响.方法 采用梯度递增放射线照射筛选构建鼻咽癌CNE-2放疗抵抗细胞(CNE-2 with radio resistance,CNE-2-Rs),并通过CCK-8法、克隆形成实验、流式细胞术验证CNE-2-Rs细胞的放疗抵抗性.显微镜下观察照射过程中,CNE-2细胞的形态学改变；Western blot检测不同照射时期CNE-2细胞上皮细胞标志物钙黏蛋白和间质细胞标志物波形蛋白的表达情况.结果 CCK-8结果表明,CNE-2-Rs细胞在同一时间点(第4天)不同照射剂量(4、6、8 Gy)以及同一照射剂量(4 Gy)不同时间点(2～5 d)下的存活率均高于其亲本细胞(P值均＜0.05)；4 Gy放射线照射前细胞增殖能力基本一致,放射线照射后CNE-2增殖能力明显低于CNE-2-Rs；CNE-2-Rs细胞放射线处理后,集落形成能力强于亲本细胞(P值均＜0.05)；拟合多靶单击模型和线性二次模型细胞存活曲线,结果表明,平均致死剂量(mean lethal dose,D0)、准阈剂量(quasi-threshold dose,Dq)、2 Gy细胞存活分数(survival fraction,SF2)和平均灭活剂量(mean inactivation dose,MID)增加,α和α/β值减少(P值均＜0.05)；CNE-2-Rs细胞接受4Gy射线后,相对于CNE-2细胞出现S期、G2期细胞比例增多(P值均＜0.05).CNE-2-Rs细胞在形态上出现呈梭形、伪足伸出和细胞间连接变松散等上皮-间质转化形态学改变.照射总剂量达24 Gy后,CNE-2细胞钙黏蛋白表达下调和波形蛋白表达升高(P值均＜0.01).结论 鼻咽癌细胞在放射线照射过程中出现典型的上皮-间质转化形态学及分子标志物改变,提示上皮-间质转化可能在鼻咽癌放疗抵抗中发挥了重要作用.
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人鼻咽癌细胞株CNE1和CNE2放射生物学特性及MRN复合体表达的研究
目的 探讨人鼻咽癌细胞株CNE1和CNE2的放射生物学特性及其MRN(Mre11-Rad50-Nbs1)复合体放射线照射前后的表达改变.方法 电子直线加速器照射对数生长期CNE1和CNE2细胞,克隆形成实验和四甲基偶氮唑蓝(MTT)法绘制细胞增殖曲线了解两株细胞的放射生物学特性；免疫印迹实验检测两株细胞MRN复合体天然表达及放射线照射后表达情况.结果 CNE1细胞株的2 Gy照射后存活分数(survival fraction at 2 Gy,SF2)、准阈剂量(quasi-threshold dose,Dq)和平均致死剂量(mean lethal dose,Do)分别为0.56、1.449 Gy和1.480 Gy; CNE2细胞株的SF2、Dq和Do分别为0.44,0.776 Gy和1.685 Gy.4 Gy放射线照射后两株细胞增殖曲线与对照组相比差异有统计学意义(F=881.70,F=858.18,P值均＜0.05),至第6天时CNE1存活分数为0.59,CNE2为0.79.Western blot法显示两株细胞均天然表达MRN复合体3个组分(Mre11,Rad50,Nbs1)；4 Gy放射线照射后,CNE1细胞Rad50蛋白表达上调(t=8.13,P＜0.05),CNE2细胞Mre11、Rad50和Nbs1蛋白表达均上调(t值分别为5.54,9.49和13.08,P值均＜0.05).结论 CNE1和CNE2细胞株均对放射线照射总体敏感,但本株CNE2中可能存在对放射线照射抵抗的亚群；CNE1和CNE2细胞均天然表达MRN复合体,放射线照射后,两株细胞均上调MRN复合体组分的表达进行损伤修复.
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三种不同辐照度的460～480 nm波长光对SD大鼠视网膜组织结构的影响
目的 探讨健康成年SD大鼠视网膜对波长为460 ～ 480nm的蓝光照射的耐受性.方法 实验研究.选取健康6周龄SD雄性大鼠76只,分为正常对照组(4只)和实验组(18组,每组4只).选取460 ～ 480nm波长照射光,以辐照度0.6、1.5、10.0W/m2分别照射实验组动物3h和12h,于光照后4、24h和3d处死动物并取视网膜.通过HE染色、原位末端转移酶标记法染色、免疫荧光染色观察SD大鼠视网膜全层组织结构改变,并检测各层细胞凋亡情况及Müller细胞相关蛋白表达水平的变化.对不同取材时间各光照组视网膜神经节细胞数目进行单因素方差分析,各组间神经节细胞数目比较采用LSD-t检验分析.结果 当光辐照度为0.6W/m2,光照时问为3h或12h时,大鼠视网膜各层组织结构均未见损伤.当光辐照度为10.0W/m2,光照时问为3h或12h时,大鼠视网膜各层均有损伤,以光感受器细胞及视网膜色素上皮细胞为主,同时内核细胞层Müller细胞亦有损伤,损伤主要表现为细胞凋亡,凋亡于光照后4h开始,24h达到强.当光辐照度为1.5W/m2,光照3h时,大鼠视网膜各层组织结构未见损伤；光照12h时,大鼠视网膜各层可观察到轻微损伤改变,程度较光辐照度为10.0W/m2组明显减轻.无论光照时间为3h或12h,光照结束后3d取材时,各组神经节细胞数目组间差异均有统计学意义[0.0、0.6、1.5、10.0W/m2组光照时间为3h时视网膜神经节细胞数目分别为(41.42±0.17)、(40.58±0.50)、(40.92 ±0.32)、(22.83 ±0.79)个；F=1305.86,P=0.000:0.0、0.6、1.5、10.0W/m2组光照时间为12h时视网膜神经节细胞数目分别为(41.42±0.17)、(40.83 ±0.69)、(41.08±0.17)、(22.75 ±0.83)个；F=1095.78,P=0.000].辐照度为10.0W/m2组的神经节细胞较正常组明显减少,差异有统计学意义(光照时问为3h时:t=52.32,P=0.000;光照时问为12h时:t=47.58,P=0.000).结论 波长为460 ～ 480nm蓝光,辐照度为0.6W/m2时,不引起SD大鼠视网膜组织结构损伤的安全照射时问为12h.辐照度升高至1.5W/m2时,安全照射时问缩短至3h.
