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Survivin干扰RNA载体的构建及其在HEK293细胞中的表达
目的:探索合成survivin siRNA和RNAi载体的构建,及其在HEK293细胞中的表达.方法:分别采用化学合成的针对survivin的siRNA和shRNA载体(pGCsi载体),转染HEK293细胞后观察HEK293细胞中survivin的RNA及蛋白表达.结果:不同序列的siRNA和shRNA转染人HEK293细胞后,survivin的RNA及蛋白表达出现不同程度的下降.结论:化学合成与shRNA载体均可有效抑制HEK293细胞的survivin基因表达,为利用survivin作为靶点治疗胰腺癌等恶性肿瘤提供了技术基础.
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小干扰RNA及其在椎间盘退变机制和治疗学研究中的应用进展
小干扰RNA是近年来发展的一种基因沉默工具,它能在转录水平、转录后水平和翻译水平上阻断目的 基因表达,使该目的 基因功能丧失,且具有高效性和特异性等特点.目前该技术在肿瘤、血液病、遗传及退行性疾病研究中得以广泛应用,并取得诸多成果,文章简介干扰RNA技术,并就小干扰RNA在椎间盘退变机制研究、治疗学探索等方面新进展做一综述.
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人肾脏系膜细胞内mRNA稳定因子HuR蛋白对细胞周期蛋白cyclinD1转录后表达的调节
目的 观察人肾脏系膜细胞在血管紧张素Ⅱ( AngⅡ)刺激下mRNA稳定因子人类抗原R(HuR)蛋白对细胞周期蛋白D1( cyclinDl)蛋白的作用.方法 体外培养人肾脏系膜细胞,根据AngⅡ对其的刺激时间即0、3、6、9、24 h分别记为0A、3A、6A、9A、24A组.应用流式细胞仪检测0A组与24A组细胞周期；免疫细胞化学方法观察各组HuR蛋白的亚细胞定位变化；Western blot方法检测各组全细胞与胞质内HuR蛋白及全细胞cyclinD1表达水平；RT-PCR方法检测各组cyclinD1的RNA水平.干扰RNA方法观察抑制HuR蛋白表达后AngⅡ刺激下对全细胞cyclinD1表达的保护效应.结果 与0A组比较,24A组细胞增殖趋势明显；HuR蛋白亚细胞定位从胞核转移到胞质,其中3A组变化显著；全细胞HuR蛋白表达水平不变,胞质内HuR蛋白表达增强,其中3A组显著(P＜0.05)；cyclinD1蛋白表达增强,其中24A组显著(P＜0.05),而RNA水平保持不变(P＞0.05).与转染前相比,干扰RNA转染后3A组胞质HuR蛋白表达明显减弱(P＜ 0.05)；24A组cyclinD1蛋白表达明显减弱(P＜0.05),而RNA水平不变(P＞0.05).结论 ①AngⅡ可刺激人肾小球系膜细胞增殖；②AngⅡ刺激下人肾脏系膜细胞核内HuR蛋白向胞质内转移；③HuR蛋白参与AngⅡ刺激下cyclinD1蛋白表达过程.
关键词： 人肾脏系膜细胞 血管紧张素Ⅱ HuR蛋白 CyclinD1蛋白 干扰RNA -
G250基因siRNA表达载体的构建与鉴定
目的 构建肾癌相关抗原G250小分子干扰RNA(siRNA)表达载体,通过抑制G250基因的表达,探索肾癌基因治疗的新途径.方法 根据基因库上的肾癌相关抗原G250 mRNA序列,设计并合成两端含有酶切位点的75个碱基的寡核苷酸链.寡核苷酸链退火后用T4DNA连接酶连接至线性化的质粒pRNAT-U6.1/Neo中,构建成重组质粒(命名为pshRNA-0250a,pshRNA-G250b),进行酶切及序列鉴定.结果 pshRNA-G250表达载体克隆构建成功,插入片段测序结果与合成的siRNA序列一致.结论 成功构建pshRNA-G250表达载体,为进一步的研究及探索.肾癌基因治疗奠定了基础.
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聚合酶Ⅰ和转录物释放因子在非小细胞肺癌中表达水平和对迁移侵袭的影响
目的 探讨聚合酶Ⅰ和转录物释放因子(PTRF)在非小细胞肺癌中的功能.方法 使用干扰RNA质粒构建的方法构建2条短发卡RNA(shRNA)s和1条对照shRNA,构建成功后进行空白组、对照组、2组实验组(A组、B组)的转染,使用反转录-聚合酶链反应(RT-RCR)进行目的PTRF的基因水平检测,同时使用蛋白印迹的方法(Western blot)进行蛋白表达水平的检测.然后对A549细胞株进行划痕实验和细胞侵袭实验(Transwells),比较沉默PTRF后对细胞株迁移和侵袭的能力的影响.结果 癌旁组织的PTRF的mRNA和蛋白表达明显高于癌组织,差异有统计学有意义(P=0.003、0.016).shRNA-A组和shRNA-B组PTRF的mRNA相对表达水平显著低于对照组,差异有统计学意义(P =0.009、0.012).shRNA-A组和shRNA-B组PTRF蛋白的相对表达水平显著低于对照组,差异有统计学意义(P =0.002、0.005).转染A549后,使用划痕实验和Transwell侵袭实验进行比较,shRNA-A组和shRNA-B组的细胞迁移和侵袭能力均出现明显的增强,差异有统计学意义(P =0.018、0.029和P=0.024、0.038).结论 非小细胞肺癌通过抑制PTRF的表达促进迁移侵袭.
关键词： 聚合酶Ⅰ和转录物释放因子 非小细胞肺癌 迁移 干扰RNA -
基因水平下调PP2A水平可显著抑制海马神经元轴突生长
目的 探讨基因水平下调PP2A对胎鼠海马神经元轴突生成的影响.方法 选取体外培养原代海马神经元为研究模型,首先构建PP2A催化亚基特异性干扰RNA及其对照(si-PP2A/ssi-PP2A)质粒,选择在种植前下调PP2A水平,观察其对海马神经元轴突生成是否有作用;原代细胞采用Amaxa大鼠神经元核电转试剂盒分别转染EGFP-ssiPP2Ac和EGFP-siPP2Ac,神经元种植培养48 h后固定做免疫荧光双标,分别标记轴突特异性标记物Tau-1和树突特异性标记物MAP-2,观察基因下调PP2A水平对神经元轴突生成的影响.结果 原代海马神经元转染48 h后对照转染组海马神经元神经元轴突和树突均已形成,而干扰RNA转染组神经元轴突生长受到显著抑制,而树突生长未受到明显影响;si-PP2A转染组(干扰转染组)神经元轴突长度仅为对照转染组的38%,单个神经元的平均轴突数目也从正常1.0/neuron下降到0.5/neuron.结论 基因下调PP2A水平显著抑制了原代海马神经元轴突生成,结合前期药物下调研究结果提示维持细胞内正常PP2A水平在海马神经元轴突生成中起重要作用.
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siRNA真核表达载体的构建及其对CXCR4基因的沉默效应
目的 构建趋化因子受体(CXCR4)特异性siRNA(small interfere RNA)真核表达载体,体外观察对CXCR4基因的沉默作用.方法 采用基因克隆技术,将合成的特异性CXCR4 RNA干扰寡核苷酸序列插入真核表达载体pSUPER,构建CxCR4 siRNA真核表达载体.以脂质体法将pSUPER空载体和2个(pSUPER/CXCR4-siRNA0和pSUPER/CXCR4-siRNA1)重组质粒分别导入具有高转移特性的MDA-MB-231乳腺癌细胞系,检测各组乳腺癌细胞内CXCR4 mRNA及蛋白的表达情况.结果 成功构建CXCR4 siRNA真核表达载体.转染CXCR4 RNA干扰片段的乳腺癌细胞,72 h后CXCR4mRNA及蛋白表达下调,抑制作用明显.结论 构建的RNA干扰真核表达载体能明显下调CXCR4 mRNA及蛋白的表达,为应用于乳腺癌的治疗研究提供了一定的实验基础.
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线粒体加工肽酶干扰RNA真核表达载体转染 PC12细胞系的构建及鉴定
目的 利用干扰RNA技术构建线粒体加工肽酶(MPPs)的干扰RNA真核表达载体,稳定转染大鼠PC12细胞来抑制MPPs基因的表达,为研究MPPs蛋白的功能提供实验基础.方法 脂质体转染已经构建好的4个MPPs干扰RNA真核表达载体和阴性对照干扰RNA真核表达载体到大鼠PC12细胞株,G418筛选阳性转染细胞克隆,制备稳定转染5个MPPs干扰RNA真核表达载体的PC12细胞系.用RT-PCR检测MPPs基因表达.结果 获得稳定转染5个MPPs干扰RNA真核表达载体的PC12细胞系,RT-PCR证实所有4个干扰组(siRNA1,siRNA2,siRNA3 and siRNA4)MPPs-mRNA表达均下调,分别达到28%、38%、26%、16%.结论 成功建立稳定转染MPPs干扰RNA的PC12细胞系.通过RT-PCR等相关方法证实MPPs干扰RNA真核表达载体转染PC12细胞成功.
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GAS41基因RNA干扰慢病毒载体的构建
目的:构建GAS41-shRNA慢病毒载体.方法:合成GAS41干扰序列,构建GV118-GAS41-RNAi慢病毒干扰载体,连同包装质粒pHelper1.0和包膜质粒pHelper2.0共同转染293T细胞,收集储存病毒颗粒并进行滴度测定.结果:构建的GAS41干扰慢病毒载体GV118-GAS41-RNAi经PCR和测序鉴定,结果与设计序列相符,收获病毒颗粒,测定滴度为5×108TU/mL.结论:成功构建了GAS41-shRNA慢病毒载体,为后续进一步研究GAS41基因在视神经胶质瘤(optic nerve glioma,ONG)中的作用奠定了基础.
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KCTD10基因干扰RNA慢病毒载体的构建
目的:构建KCTD10干扰RNA慢病毒载体.方法:合成KCTD10干扰序列,构建GV248-KCTD10-RNAi慢病毒干扰载体,利用PCR与测序验证阳性克隆.将KCTD10 siRNA干扰病毒载体与质粒pHelper1.0和质粒pHelper2.0三个载体共同转染293T细胞,使细胞合成并分泌释放病毒颗粒.收集病毒颗粒并检测病毒滴度.结果:GV248-KCTD10-RNAi慢病毒载体成功被连接转化,测序结果与设计序列一致;共转后收获KCTD10 siRNA慢病毒颗粒,检测其滴度为5×108TU/mL.结论:成功包装了KCTD10 siRNA慢病毒颗粒,为后续进一步研究KCTD10基因在糖尿病视网膜病变中的作用奠定了基础.
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三结构域包含蛋白29对鼻咽癌细胞生长和迁移的影响
目的 研究三结构域包含蛋白(TRIM 29)、死骨片蛋白-1(SQSTM 1)、根蛋白(RDX)基因在不同转移潜能鼻咽癌细胞系中的表达水平,了解其与鼻咽癌细胞侵袭转移的关系,揭示TRIM 29在鼻咽癌细胞侵袭转移中的作用.方法 ①采用qRT-PCR(quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction)和蛋白印迹法(Western blot)检测高转移潜能鼻咽癌细胞系5-8F和低转移潜能鼻咽癌细胞系6-10B中TRIM 29、SQSTM 1、RDX基因的mRNA和蛋白表达水平;②脂质体转染法将TRIM 29特异性siRNA载体和空白载体转染5-8F细胞,建立稳定转染细胞系;③采用Western blot检测细胞中TRIM 29蛋白表达水平的变化,MTT法检测细胞增殖能力的变化,流式细胞仪检测细胞周期分布的变化,划痕实验观察细胞迁移能力的变化.结果 ①5-8F细胞中TRIM 29、SQSTM 1的表达水平明显高于6-10B细胞,而RDX的表达水平低于6-10B细胞;②建立了TRIM 29低表达的5-8F细胞系及其空白载体稳定转染细胞系;③与空白载体转染的5-8F细胞和未转染5-8F细胞比较,特异性siRNA转染的TRIM 29低表达5-8F细胞的增殖能力降低,G0/G1细胞增加,而S期细胞减少,细胞迁移能力降低.结论 ①siRNA干扰TRIM 29表达抑制鼻咽癌5-8F细胞的生长和迁移;②TRIM 29、SQSTM 1与鼻咽癌转移密切相关,有望成为预警鼻咽癌转移的分子标志物,但RDX与鼻咽癌转移关系不确定.
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lncRNA HOTAIR在宫颈癌组织及HeLa细胞中的表达及其生物学功能研究
目的 探讨长链非编码RNA HOTAIR在宫颈癌组织中的表达及其生物学功能.方法 选取简阳市人民医院2014年8月至2016年7月收治并手术治疗的宫颈癌患者47例,采用实时荧光定量PCR检测患者癌组织及癌旁正常宫颈组织中HOTAIR RNA的相对表达量;以人宫颈癌Hela细胞为研究材料,应用小RNA干扰技术下调宫颈癌Hela癌细胞HOTAIR RNA表达,分别应用CCK-8实验、Wound Healing实验检测小干扰RNA下调HOTAIR表达前后Hela细胞增殖和迁移能力变化情况.结果 HOTAIR在宫颈癌患者癌组织与癌旁正常宫颈组织中的相对表达量分别为(6.89±2.12)与(4.02±1.89),癌组织显著高于癌旁组织,差异有统计学意义(P<0.05);与对照组细胞相比,外源性小干扰RNA可显著敲低Hela细胞中HOTAIR的表达并影响其增殖和迁移(P<0.05).结论 宫颈癌患者癌组织中HOTAIR表达水平高于癌旁正常宫颈上皮;HOTAIR可能参与了宫颈癌细胞增殖和迁移等生物学功能.
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新靶点CyclinE干扰RNA真核表达载体的构建
目的：构建4个新靶点的人CyclinE干扰RNA真核表达载体，转染人脑胶质细胞瘤U251细胞，经反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测mRNA表达，获得干扰效果好的真核表达载体，为CyclinE成为人脑肿瘤标志物提供有价值的资料。方法（1）构建4个新靶点CyclinE干扰RNA的真核表达载体后，用双酶切和碱基序列测定的方法鉴定载体构建成功与否；（2）用Lipofectamine 2000转染4个成功构建的载体到胶质瘤 U251细胞株；（3）通过 RT-PCR的结果检测转染后CyclinEmRNA表达量，选出干扰效果好的1个。结果（1）成功构建了4个新靶点的CyclinE干扰RNA真核表达载体即PCyclinE-1、PCyclinE-2、PCyclinE-3、PCyclinE-4。（2）CyclinEmRNA 表达明显受到抑制，并获得效果好的CyclinE干扰RNA真核表达载体。结论成功构建并筛选出效果好的新靶点Cy-clinE干扰RNA真核表达载体，使U251细胞的CyclinE mRNA表达明显降低。
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CDK2 RNA干扰后HepG2细胞蛋白表达的变化
目的 探讨稳定转染CDK2干扰RNA对人肝癌细胞株HepG2细胞生物活性及细胞核蛋白质的改变.方法 构建稳定转染pGenesil-1-CDK2的HepG2细胞系,MTT法检测细胞增殖、流式细胞术检测细胞周期的改变.通过RT-PCR和双向凝胶电泳-质谱技术-数据库搜索,比较转染前后CDK2 mRNA的表达和细胞核蛋白质的变化.并通过Western blot法对显著差异蛋白进行验证.结果 与空质粒组PHK-siRNA-HepG2细胞和未转染组HepG2细胞相比,pCDK2-siRNA-HepG2组细胞的生长速度减慢(P＜0.01),稳定转染CDK2 RNAi组细胞的CDK2 mRNA表达水平显著下降.通过双向电泳-质谱技术得到4个稳定转染CDK2 siRNA的HepG2细胞不表达的蛋白质,Westem blot法证实双向电泳结果的可信性.结论 CDK2干扰RNA可明显降低HepG2细胞CDK2 mRNA的表达,抑制HepG2细胞的增殖,干扰后的HepG2细胞不表达的蛋白质分别是类核糖体蛋白S12、β-肌动蛋白、锌指蛋白276和伴侣蛋白10相关蛋白.
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人醛缩酶A干扰RNA真核表达载体的构建
目的 构建4个人醛缩酶A (aldolaseA,ALDOA)公共序列的干扰RNA真核表达载体,转染人脑神经胶质细胞U251细胞,为醛缩酶A成为人脑肿瘤标志物提供实验基础和有价值的资料.方法 ①构建4个新靶点醛缩酶A干扰RNA真核表达载体并用双酶切和测序鉴定;②用脂质体法瞬时转染上述4个载体到U251细胞株.结果 ①成功构建了4个新靶点的醛缩酶A干扰RNA真核表达载体即pGPU6/GFP/Neo-ALDOA-1,pGPU6/GFP/Neo-ALDOA-2,pGPU6/GFP/Neo-ALDOA-3和pGPU6/GFP/Neo-ALDOA-4;②在U251细胞中有绿色荧光蛋白表达.结论 成功构建并筛选出效果好的新靶点MBP干扰RNA真核表达载体.
关键词： 干扰RNA 醛缩酶A 神经胶质细胞U251 -
肿瘤相关基因LncRNA H19的研究进展
长链非编码RNA(LncRNA)是一种转录本超过200个核苷酸,没有蛋白编码功能的特殊RNA分子.近年来对LncRNA的研究显示,LncRNA与多种疾病及肿瘤的发生发展密切相关.分子生物学水平的研究发现,LncRNA作为重要的调控分子参与生命活动的整个过程,并且在各种疾病及肿瘤中发挥调控作用,部分LncRNA在肿瘤中甚至可直接作为抑癌或致癌基因.LncRNA H19是早发现的长链非编码RNA之一,研究发现其与多种肿瘤关系密切,在不同肿瘤中通过不同的途径发挥其致癌或抑癌的生物学功能,本文就肿瘤相关基因LncRNA H19的研究进行简单综述.
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构建人促红细胞生成素干扰载体
目的 利用干扰RNA技术,构建人促红细胞生成素(Erythropoietin,EPO)新靶点的干扰RNA真核表达载体,沉默转染该载体的胶质瘤细胞中的人促红细胞生成素基因,为EPO在肿瘤、新生儿缺氧、贫血等疾病中的作用机理奠定实验基础.方法 构建EPO干扰RNA的真核表达载体后,用碱基序列测定和双酶切测定,在U251细胞中转染EPO干扰RNA的真核表达载体,查看荧光蛋白表达量.结果 成功构建了新靶点的EPO干扰RNA真核表达载体即PEPO,而且成功转染U251细胞.结论 本实验构建了新靶点EPO干扰RNA真核表达载体.
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通过PEI@Fe3O4纳米载体介导si-hTERT对A549细胞的体外影响
目的 利用PEI@Fe3O4纳米载体介导人端粒酶逆转录酶(hTERT)siRNA进入A549肺癌细胞,检测该方法对A549体外增殖、迁移的影响.方法 PEI@Fe3O4介导hTERT siRNA转染后,逆转录-聚合酶链反应(RT-qPCR)和蛋白免疫印迹法(Western blot)分别检测细胞检测hTERT mRNA和蛋白的表达情况;MTT法和划痕实验检测细胞增殖与侵袭迁移能力;流式细胞术检测细胞凋亡的改变;高通量测序检测hTERT抑制后差异表达的基因.结果 PEI@Fe3O4可以有效介导si-hTERT降低hTERT mRNA和蛋白水平;转染后细胞增殖和侵袭迁移能力减弱明显;同时增强了A549细胞凋亡的发生.结论 hTERT的沉默可以通过多通路抑制A549细胞的增殖、迁移并促进凋亡,PEI@Fe3O4纳米粒子可以作为潜在的临床应用载体递送siRNA进入细胞.
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治疗肝炎的新武器: RNA干扰
据统计,世界上大约有1.7亿人感染丙型肝炎病毒(HCV)和3.5亿慢性乙肝病毒(HBV)携带者.尽管用α-干扰素(IFN-α)和病毒唑联合治疗显著地提高了临床治疗效果,但是只有少于一半人对这种治疗有反应,因此需要一种新的治疗肝炎的方法.许多体内外试验发现RNA干扰能有效的抑制肝炎病毒的复制,为肝炎治疗带来新的希望.本文对RNA干扰在丙肝及乙肝方面的应用进展进行综述.
