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融合蛋白GST-反式转录激活因子蛋白-增强型绿色荧光蛋白表达及对血迷路屏障作用
目的：表达并纯化融合蛋白GST-反式转录激活因子蛋白-增强型绿色荧光蛋白（GST-transactivator of transcription- enhanced green fluorescence protein，GST-TAT-EGFP），并研究其是否能跨越血迷路屏障（blood labyrinth barrir，BLB）进入内耳。方法用基因重组技术将编码TAT蛋白11个氨基酸短肽基因和EGFP基因重组，分别构建pGEX-6p-1-TAT-EGFP和pGEX-6p-1-EGFP表达载体，将载体分别转化大肠杆菌BL21（DE3），经IPTG诱导表达融合蛋白，用GST树脂柱亲和层析纯化融合蛋白。将10只豚鼠随机分为两组，分别肌肉注射GST-EGFP和GST-TAT-EGFP；2～4 h后豚鼠经麻醉、断头取耳蜗等组织。用2%多聚甲醛固定，耳蜗经10%EDTA（pH7.4）脱钙、OCT包埋，制备颞骨冰冻切片，采用免疫组化技术和荧光显微镜技术观察TAT短肽是否可以携带分子量55 kD的GST-EGFP跨越BLB进入内耳。结果 GST-TAT-EGFP进入内耳后主要分布于血管纹和螺旋器，而对照组EGFP不能进入内耳。结论短肽TAT可转导大分子蛋白通过BLB进入内耳，为外源性蛋白药物治疗内耳疾病提供新手段。
关键词： 重组融合蛋白质类 迷路 血迷路屏障 反式转录激活因子蛋白 增强型绿色荧光蛋白 -
236内耳基因转导的研究进展
基因治疗是指在体细胞中转入具有治疗价值的新的遗传物质,使其在体内稳定表达,在一段时期内持续提供蛋白药物可达到治疗目的.对于一些日常用药物难以奏效的内耳疾病来说无疑是一种有潜力的治疗方法.由于内耳存在血迷路屏障,使得一些如生长因子、细胞因子和酶类等大分子难以通过血迷路屏障并输送到靶部位而发挥生物学作用.另外,由于这些蛋白质分子的半衰期短,因而需要重复多次耳蜗内注射及微泵灌注,技术上的复杂性大大限制了这类分子在内耳中的应用.故基因治疗的关键是建立有效的基因转移方法,以使目的基因得到高效率及长时间的表达.同时还要具备相应的调控手段.
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耳蜗微血管内皮细胞通透性体外模型的研究
目的建立豚鼠耳蜗微血管内皮细胞通透性体外模型.方法采用活体组织细胞分离及培养技术,获取培养的豚鼠耳蜗微血管单层融合内皮细胞,免疫组化法检测内皮细胞标志物Ⅷ因子鉴定培养细胞的性质及其纯度,小池技术构建通透模型,以脑微血管内皮细胞通透模型为阳性对照、肺微血管内皮细胞通透模型为阴性对照和无内皮细胞的小池为空白对照,125I标记牛血清白蛋白检测本模型的通透性特点.结果①耳蜗血管纹组织块培养后2 d,边缘即有细胞生长,之后细胞数量逐渐增多,10 d左右细胞增殖成数个细胞集落;纯化后,单个培养细胞一般呈梭形,传代细胞培养8 d后,细胞增殖形成片状单层,紧密排列,显微镜下呈现培养内皮细胞典型的"铺路石" 样外观.免疫组化检查,95%以上的培养细胞胞浆有桔黄色着色,呈阳性反应,而对照组无此着色.②实验组对牛血清白蛋白的通透性大于阳性对照组(P<0.05),小于阴性对照组和空白对照组(P<0.01).结论建立的豚鼠耳蜗微血管内皮细胞通透性体外模型适合于耳蜗微血管内皮细胞通透性的研究,为今后研究血迷路屏障通透性及其调控机理奠定了良好的基础.
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用MRI体内观测钥孔嘁血蓝素中耳免疫诱导的内淋巴积水的初步探讨
目的用磁共振成像方法研究中耳免疫反应诱导的动物内淋巴积水.方法将9只豚鼠分为2组,中耳免疫组(4只)和磷酸盐缓冲液(Phosphate buffered saline,PBS)对照组(5只).先用KLH加福氏完全佐剂行四肢趾蹼免疫,2周后将KLH投放至中耳进行局部免疫.另外5只豚鼠中耳放置PBS作为对照组.用gadolinium增强的磁共振成像观察内耳淋巴液的动态变化,用耳蜗电图评估听功能改变.结果在KLH中耳免疫的动物中,2只发生内淋巴积水,3只血迷路屏障通透性增加,2只听力损失大于10dB.结论磁共振成像可以显示KLH中耳免疫反应的耳蜗改变,内淋巴积水和血迷路屏障通透性的增加提示存在着一个"漏的迷路",将有可能为内耳疾病的诊断提供更加精确的依据.
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1400W对内毒素损伤豚鼠血迷路屏障的保护作用及机制初探
目的 观察一氧化氮合酶抑制剂1400W(N-(3-(氨甲基)-苄基)乙脒)对内毒素(endotoxin,ETX)所致的豚鼠血迷路屏障损伤的保护作用,并初步探讨其可能机制.方法 将豚鼠分3组,每组分别于听泡内各注入无菌生理盐水、ETX和ETX加1400W,光镜观察耳蜗形态变化;以伊文思蓝(Evans Blue,EB)为示踪剂,测量EB通过耳蜗血迷路屏障的渗出量;用硝酸还原酶法检测各组耳蜗组织一氧化氮(NO)含量的变化.结果 ETX组EB渗出量增加,同时有NO含量增加;ETX加1400W组和ETX组比较,EB渗出量减少(P<0.05),NO生成亦减少(P<0.05).无菌生理盐水组无EB通过,亦无NO含量增加.结论 ETX可能通过诱导NO生成而引起血迷路屏障通透性增加,此作用可以被1400W抑制,后者可能减轻中耳炎引起的内耳损害.
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酶消化及差速贴壁法原代培养新生C57小鼠耳蜗膜蜗管外侧壁成纤维细胞
背景:目前对耳蜗膜蜗管外侧壁成纤维细胞的培养没有特定的方法.目的:采用酶消化与差速贴壁相结合的方法,原代培养新生C57小鼠膜蜗管外侧壁成纤维细胞,提供良好的体外细胞模型.方法:显微解剖分离新生C57小鼠膜蜗管外侧壁组织,对膜蜗管外侧壁组织进行胰蛋白酶消化与差速贴壁相结合的方法培养成纤维细胞,倒置相差显微镜下观察细胞生长状态,苏木精-伊红染色,绘制细胞生长曲线,免疫组织化学染色鉴别细胞来源.结果与结论:膜蜗管外侧壁组织来源传代纯化的成纤维细胞呈梭形和三角形,生长曲线成S形,免疫组织化学检测波形蛋白,细胞胞浆中呈棕黄色阳性反应.结果证实培养出小鼠膜蜗管外侧壁成纤维细胞.
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内耳血迷路屏障概念及中医药研究进展
1血迷路屏障概念及内涵1.1 血迷路屏障定义众所周知,内耳必须维持其内环境的相对稳定才能保持正常的生理功能.内耳液体依靠自身调节机制维持其动态的平衡来实现内环境的稳定,其所涉及的系统和机制包括离子转运系统、血迷路屏障及稳定的血供.Hawkins早提出内耳屏障系统的假设,用以解释血液系统成分随全身条件改变时迷路液体成分的稳定,并称之为血耳屏障,现在也称为血一内耳或血迷路屏障(blood labyrinth barrier,BLB).近年来发现,内耳液体组成的调节过程牵涉几个不同的屏障系统,包括血-内淋巴、血-外淋巴和内-外淋巴之间的屏障,它们的功能都是保证内耳微环境的稳定,一般意义的BLB不包括内-外淋巴屏障.内耳高度调节的离子出入转运维持了听传导必需的内耳液体组成.其中任一种机制紊乱都会破坏动态平衡,表现为各腔隙之间离子、渗透性和代谢的不平衡.自由基、压力、激素、噪声暴露和氨基糖苷类抗生素都会影响短期和长期的听力和/或前庭的细胞功能,成为内耳液体离子动态平衡急剧功能紊乱的诱发机制,使内耳功能发生障碍[1].
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病理条件下碱性成纤维细胞生长因子肌内注射后在豚鼠内耳的分布
目的:探讨病理条件下碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)肌内注射在豚鼠内耳的分布.方法:25只豚鼠分5组,每组5只.正常组:肌内注射125I-bFGF 原液0.1 ml;生理盐水组:肌内注射生理盐水0.1 ml;125INa组:肌内注射125INa 0.1 ml;急性缺氧组:豚鼠置于密闭容器中,通入体积分数8%氧气和92%氮气的混合气体,2 h后出仓,检测听觉脑干诱发电位(ABR),抽动脉血测定动脉血氧分压(pO2及血氧饱和度(x(O2),同时肌内注射125I-bFGF原液 0.1 ml,立即返仓;药物性聋组:肌内注射丁胺卡那霉素,连续用药7 h,ABR测试后,肌内注射125I-bFGF原液 0.1ml.各动物分别于注射125I-bFGF、生理盐水、125INa 1 h后心内抽血、取肝脏、甲状腺、脑组织、耳蜗、外淋巴组织,测量各组织γ放射计数,并观察耳蜗放射性自显影.结果:缺氧组缺氧后ABR阈值升高(P＜0.000 1,pO2、x(O2均降低(P＜0.01.肌内注射125I-bFGF 后,正常组、急性缺氧组、药物性聋组动物的血液和肝脏组织中γ放射性计数高于本底,耳蜗放射性自显影图谱可见显影颗粒;而脑组织、耳蜗及外淋巴γ放射性计数与本底比较无差异,耳蜗放射性自显影图谱未见显影颗粒.结论:生理情况下,bFGF肌内注射难以通过血脑屏障和血-迷路屏障;病理情况下,如急性缺氧、氨基甙类抗生素耳中毒时bFGF肌内注射也难以通过血脑屏障和血-迷路屏障到达内耳.
关键词： 碱性成纤维细胞生长因子 耳蜗 血迷路屏障 放射自显影 豚鼠 -
噪声对豚鼠耳蜗血管纹紧密连接蛋白claudin-5表达及血迷路屏障通透性的影响
目的 研究噪声对豚鼠耳蜗血管纹紧密连接蛋白claudin-5表达及血迷路屏障功能的影响.方法 40只豚鼠随机分为正常对照组(20只)和噪声暴露组(20只),噪声暴露组给予声强为115 dB SPL白噪声暴露,每天6小时,连续两天,对照组不予噪声暴露.于实验前及噪声暴露后次日对两组豚鼠行ABR检测,第二次ABR检测后对两组豚鼠耳蜗基底膜行鬼笔环肽-异硫氰酸荧光素(Phalloidin-FITC)染色;用硝酸镧透射电镜和常规透射电镜观察两组豚鼠内耳血迷路屏障通透性和紧密连接的变化;Western blot和免疫组织化学染色观察两组豚鼠耳蜗血管纹和螺旋韧带处claudin-5的表达.结果 噪声暴露组豚鼠ABR波Ⅲ反应阈较正常对照组阈移40 dB以上,差异有统计学意义(P<0.05); 基底膜铺片FITC染色示噪声暴露组底回基底膜毛细胞大量缺失,其余部分毛细胞纤毛排列紊乱并出现融合,而对照组毛细胞排列整齐,其纤毛呈V或W型,两组间外毛细胞计数比较差异有统计学意义(P<0.05);透射电镜下,可见噪声暴露组血管内皮细胞间和边缘细胞间的紧密连接均遭到破坏,细胞间隙增大;硝酸镧透射电镜下,大量镧颗粒从血管腔内渗漏到管腔外的组织间隙,而对照组镧颗粒仅局限于血管腔内;Western blot结果示,两组耳蜗外侧壁血管纹均有claudin-5表达,但噪声暴露组的表达量明显低于正常组;免疫组织化学染色也表明,两组豚鼠耳蜗外侧壁毛细血管内皮细胞、边缘细胞等处均有claudin-5阳性表达,但噪声组表达量显著低于正常组(P<0.05).结论 噪声通过下调紧密连接蛋白claudin-5的表达,破坏细胞间紧密连接,增加豚鼠血迷路屏障的通透性,从而导致内耳微环境的破坏,是噪声性聋可能的发病机制之一.
关键词： 紧密连接蛋白claudin-5 紧密连接 噪声性聋 血管纹 血迷路屏障 -
耳蜗血－迷路屏障与噪声性听力损伤
噪声对听力的损害已被人们广泛认识，其对耳蜗的损伤程度取决于噪声的强度和噪声暴露持续时间，高强度的脉冲噪声能够直接导致耳蜗的机械性损伤，而较低强度的噪声可引起内耳感觉细胞的代谢变化并终启动细胞凋亡［1，2］。噪声性聋的代谢障碍学说认为噪声暴露后，体内自由基产生过多、钙超载、谷氨酸堆积和血－迷路屏障（blood － laby‐rinth barrier ，BLB）通透性增加是噪声性听力损失的主要原因［3，4］。血迷路屏障位于耳蜗外侧壁，对维持耳蜗内电位（endocochlear potential ，EP）、调控内耳离子转运和调节内耳体液平衡具有重要的作用。自由基和谷氨酸过量、毛细胞钙超载与血－迷路屏障破坏均可引起内耳微环境改变，使内耳缺血缺氧，加剧了毛细胞的损伤，导致噪声性聋的产生。本文对耳蜗血－迷路屏障与噪声性听力损伤的研究进展综述如下。
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类固醇激素鼓室内给药治疗内耳疾病的基础与临床研究
随着梅尼埃病和突发性感音神经性聋等内耳疾病的患病人群日益增加,经鼓室内给予类固醇激素治疗内耳疾病越来越受到临床医生的重视.该方法优于胃肠道或静脉给药,可以避开血迷路屏障直接进入内耳,达到较高的药物浓度,同时避免全身用药的不良反应.本文对类固醇激素鼓室内给药治疗内耳疾病的基础理论和研究进展,如一些新的给药方法、动物及临床试验结果等综述如下.
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跨屏障内耳局部给药研究进展
1 内耳的结构特点及其局部给药的解剖基础由于血迷路屏障的存在,与其他器官相比,内耳与身体其他部分是相对独立的.圆窗膜的半渗透性使得某些药物通过圆窗直接渗透进入鼓阶外淋巴液.耳蜗的骨质结构既可为局部给药和固定提供条件,又可防止药物向周围组织器官扩散,而内耳淋巴液的流动性能使药物很快均匀分布,不会在注射部位蓄集.从某种意义上说,内耳局部给药的实质是一种跨血-迷路屏障的治疗模式,对某些不能通过血脑屏障、系统使用毒性大、半衰期短的药物,跨屏障局部用药具有显著的优越性.
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大鼠耳蜗血管纹内皮细胞的原代培养
目的:原代培养大鼠耳蜗血管纹血管内皮细胞,为血迷路屏障研究提供体外细胞模型.方法:显微解剖分离新生Wistar大鼠耳蜗血管纹组织,运用胰蛋白酶消化与机械分离组织块相结合的方法培养细胞,免疫组织化学染色鉴别细胞来源.结果:部分血管纹组织块培养48 h后,自边缘生长出零散的细胞,逐渐增殖并形成致密融合的单层多边形细胞的细胞集落,经传代纯化的细胞具有内皮细胞培养典型的"铺路石样"外观,免疫组织化学检测内皮细胞标志性抗原Ⅷ因子,细胞胞浆中呈棕黄色阳性反应.结论:本实验培养出大鼠耳蜗血管纹血管内皮细胞,为血迷路屏障体外研究提供了细胞模型.
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TNF-α对体外培养豚鼠耳蜗血管纹微血管内皮细胞通透性的影响
目的 研究TNF-α对体外培养豚鼠耳蜗血管纹微血管内皮细胞通透性的影响.方法 体外分离培养豚鼠耳蜗血管纹微血管内皮细胞并建立耳蜗血管纹微血管内皮细胞通透性体外模型,实验分TNF-α组和对照组.依据作用时间和浓度不同,检测其对伊文思蓝的通透率变化.结果 TNF-α能显著增加耳蜗血管纹微血管内皮细胞的通透性,使伊文思蓝的通透率显著升高(P＜0.01),且随TNF-α浓度升高和作用时间的延长而升高.结论 TNF-α可以显著的增加耳蜗血管纹微血管内皮细胞的通透性.
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内毒素致豚鼠血迷路屏障通透性及其超微结构观察
目的研究内毒素(ETX)致豚鼠血迷路屏障的动态变化情况.方法采用听泡内注入内毒素,以伊文思蓝(Evans Blue,EB)为示踪剂,测量EB通过耳蜗血迷路屏障的渗出量,应用透射电镜观察耳蜗外侧壁形态学的变化.结果内毒素使耳蜗血迷路屏障EB渗出量随时间的变化而变化,12 h开始有EB渗出,24 h达高峰,与12、72 h比较,有显著性差异.生理盐水组超微结构无变化,内毒素组血管纹血管内皮细胞呈不同程度的损伤,细胞间的间隙增宽,有炎性细胞浸润.结论内毒素能使血迷路屏障通透性增加,其原因主要是由血管纹微血管内皮细胞连续性中断及细胞间的紧密连接开放所致.
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噪声暴露对豚鼠血迷路屏障通透性的影响及其可能机制
为了探讨噪声暴露对豚鼠血迷路屏障通透性的影响及ERK1/2磷酸化在此过程中的作用,本文将豚鼠随机分为噪声暴露组和对照组;暴露组又分为两组,暴露时间分别为4 h和6 h.然后用Evans蓝染色和硝酸镧示踪法检测血迷路屏障的通透性,Western blot方法检验耳蜗组织中ERK1/2及其磷酸化蛋白的表达.结果显示:噪声暴露后4 h和6 h,耳蜗组织Evans蓝的染色强度均显著高于对照组(P＜0.05);对照组镧颗粒仪滞留在血管纹毛细血管腔内,噪声暴露组镧颗粒分别见于毛细血管腔、血管内皮细胞和血管周围组织内;另外,噪声暴露组(4 h和6 h)耳蜗组织ERK1/2水平与对照组接近,但ERK1/2的磷酸化程度明显增加;两种噪声暴露处理对豚鼠血迷路屏障通透性及ERK1/2磷酸化水平的影响存在明显的剂量依赖效应;ERK1/2抑制剂PD98059可部分降低血迷路屏障的通透性.以上结果提示噪声暴露可增加血迷路屏障的通透性,其机制可能是通过诱导ERK1/2磷酸化来实现的.
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紧密连接蛋白occludin和ZO-1在豚鼠耳蜗外侧壁血管纹中的表达
目的:研究紧密连接蛋白occludin,ZO-1在豚鼠耳蜗外侧壁血管纹中的表达.方法:成年健康杂色豚鼠,耳廓反射灵敏,分别取耳蜗、脑、肺三组组织,免疫组织化学法及Western Blot研究紧密连接蛋白occludin,ZO-1在耳蜗外侧壁血管纹中的表达,以脑组、肺组为阳性对照.结果:光镜下可见豚鼠耳蜗外侧壁血管纹毛细血管内皮细胞等边缘细胞中均强阳性颗粒表达,脑组、肺组毛细血管内皮细胞内壁也均有明显阳性表达;Western Blot下occludin, ZO-1在耳蜗组中高表达,并且明显高于脑组与肺组.结论:occludin,ZO-1在豚鼠耳蜗外侧壁血管纹紧密连接中的高浓度表达,与维持血迷路屏障结构、功能密切相关.
关键词： occludin蛋白 ZO-1蛋白 连接蛋白类 耳蜗 血迷路屏障 -
豚鼠血迷路屏障通透性的体外模型
目的研究豚鼠血迷路屏障通透性体外模型的建立方法及其通透性特征. 方法① 用组织块贴壁培养法分离培养豚鼠耳蜗微血管内皮细胞,免疫组化法进行鉴定;②用小池技术建立起内皮细胞通透性的体外模型,并研究该模型中耳蜗、脑及肺3种内皮细胞对125I-牛血清白蛋白的通透性;③研究豚鼠血迷路屏障对125I-牛血清白蛋白的通透性. 结果①培养细胞致密融合时具有内皮细胞培养时典型的"铺路石样"外观,经免疫组化检测其内皮细胞标志性抗原Ⅷ因子,95%以上的培养细胞的胞质中呈棕黄色阳性反应;②耳蜗、脑及肺3种内皮细胞的体外模型中加入125I-牛血清白蛋白后,贝克-时间变化图均呈抛物线型上升曲线, 90 min内几乎呈直线;③豚鼠血迷路屏障对125I-牛血清白蛋白的通透性曲线与体外模型相似. 结论血迷路屏障的体外模型能大体反映在体时的通透性特征.
