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利用液相色谱对原粮的真菌毒素检测——HPLC法测定玉米赤霉烯酮
真菌毒素是一种真菌产生的有毒代谢产物.常见的污染粮食的真菌毒素包括:玉米赤霉烯酮(zearalenone, ZEN)、赭曲霉毒素A(ochratoxin A, OTA)、黄曲霉毒素B1(aflatoxins, AFB1)、黄曲霉毒素B2(AFB2)、黄曲霉毒素G1(AFG1)、黄曲霉毒素G2(AFG2)、呕吐毒素(deoxynivalenol,DON)以及T-2毒素等.根据大量研究文献及实验室的长期监测数据,出现很多粮食中同时遭到多种真菌毒素污染的情况.
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HPLC法测定玉米中的玉米赤霉烯酮含量
玉米赤霉烯酮又称F-2毒素、ZEA,主要会污染玉米、小麦、大麦、小米、大米和燕麦等谷物.本文主要通过对国标检测方法的优化,对浓缩重溶等方式建立分析方法,保证了上机检测浓度,提高了检测效率,使回收率和精密度均满足国标GB/T 27404-2008的要求.
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粮食中玉米赤霉烯酮检测方法的研究进展和展望
玉米赤霉烯酮（ZEN）起初发现于玉米赤霉病之中，由禾谷镰刀菌等菌种产生的，后经突变衍生出多种毒素种类。玉米赤霉病烯酮作用危害主要是自身的雌激素导致，其会对动植物造成生殖毒害与致畸突变，必须严格控制粮食中ZEN的含量。玉米赤霉烯酮检测是控制粮食中ZEN含量有效方法，现可行的检测方法有多种，总体上可分为三类，即化学检测、免疫胶体检测以及其他方法。
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粮食及其制品中真菌毒素的检测方法
真菌毒素是真菌产生的有毒次级代谢物，它广泛存在于粮油食品和饲料中，对人类和动物有害。一种真菌可能产生多种毒素，多种真菌可能产生同一种毒素。通常粮食或饲料中的真菌毒素并非单独存在，可能以一种或数种毒素为主，当不同毒素同时存在时，真菌毒素的毒性有累加效应（如黄曲霉毒素和赭曲霉毒素、呕吐毒素和玉米赤霉烯酮等），但并非是相加或相乘的关系。真菌毒素的毒性变化很大，它取决于毒素的种类、数量、摄入量、持续摄入时间、环境因素（包括环境卫生、空气质量、温度、湿度）等。目前，全世界已经发现了400多种结构不同的真菌毒素，其中已经被分离鉴定的有20多种，危害较大的主要有黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、呕吐毒素、赭曲霉毒素A、伏马毒素和T2/HT2毒素等。其中，黄曲霉毒素是天然物中致癌性强的毒素，被世界卫生组织（W H O）的癌症研究机构划定为1类致癌物，也是世界各地农产品及食品中易受其污染的一种真菌毒素。据联合国粮农组织估计，全世界谷物供应的25%受真菌毒素污染，这些真菌毒素会通过被污染的谷物、饲料和由这些饲料喂养的动物所提供的动物性食品进入人们的食物链，从而对人畜表现出致癌性、遗传毒性和致畸性。目前，全世界已有100个国家规定了粮食中主要真菌毒素的限量，我国GB 2761-2011也明确规定了食品中真菌毒素的限量。因此，准确检测真菌毒素含量的技术手段变得极为重要。
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玉米赤霉烯酮对MCF-7和T47D细胞凋亡的抑制作用
玉米赤霉烯酮(ZEA)是一种霉菌毒素[1],在奶制品及霉变谷类食物中含量较高.据报道,ZEA在结构上与内源性雌激素有相似之处,通过与雌激素受体结合而模拟雌激素效应,增加女性体内雌激素负荷,与乳腺癌发病率的升高有关[2].本实验室前一阶段的研究表明[3],ZEA可模拟雌激素作用,促进雌激素依赖性乳腺癌细胞MCF-7及T47D细胞增殖,促进细胞DNA合成,并推进细胞进入S期和G2/M期,是一种有效的促有丝分裂因子.本次实验集中探讨ZEA的这一作用是否与细胞的凋亡现象有关.
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玉米赤霉烯酮对小鼠胚胎体外发育的影响
目的 研究玉米赤霉烯酮(F-2毒素)对小鼠胚胎体外发育的影响.方法 将(8只/批)6～8周龄清洁级昆明妊娠4d小鼠处死,挑选形态良好的8-细胞(8-细胞期是早期胚胎发育过程中便于观察及深入开展胚胎在发育生物学、胚胎移植、转基因动物等领域研究工作的佳阶段).胚胎,采用微滴培养法,将形态良好的8-细胞胚胎(10 ～ 15个/孔)移入0(溶剂对照)、10-8、10-6和10-4 mol/L的F-2毒素培养液(含5％人输卵管液+10％胎牛血清)中,记录囊胚形成数及囊胚脱带数,并计算囊胚形成率和囊胚脱带率.每个剂量设5个平行.结果 与溶剂对照组比较,F-2毒素浓度在10-4和10-6 mol/L时囊胚形成率较低,差异均有统计学意义(P ＜0.05)；F-2毒素浓度在10-8、10-6和10-4 mol/L时,囊胚脱带率较低,差异均有统计学意义(P＜0.05).囊胚形成率和囊胚脱带率均随着F-2毒素浓度的升高呈下降趋势.结论 F-2毒素在小鼠胚胎发育过程中具有毒性作用.
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玉米赤霉烯酮对细胞间隙连接通讯的影响
目的了解真菌性雌激素玉米赤霉烯酮(ZEA)对细胞间隙连接通讯(GJIC)的影响.方法用荧光漂白后恢复(fluorescence redistribution after photobleaching,FRAP)技术,在激光扫描共聚焦显微镜下观察ZEA对HaCaT细胞GJIC功能的影响.结果ZEA在0.1 μmol/L对HaCaT细胞的GJIC没有明显影响,但在1～100 μmol/L浓度下都有明显的抑制作用.ZEA不能有效地拮抗TPA引起的GJIC抑制.结论ZEA在1 μmol/L以上就能抑制GJIC功能,提示它在一定条件下可能有促癌作用.
关键词： 玉米赤霉烯酮 细胞间隙连接通讯 激光扫描共聚焦显微镜 -
玉米赤霉烯酮的毒理学研究进展
玉米赤霉烯酮( zearalenone,ZEN),又名F-2毒素,是一类结构相似的二羟基苯酸内酯化合物,主要由禾谷镰刀菌、黄色镰刀菌、木贼镰刀菌等镰刀菌属真菌产生[1].ZEN广泛存在于霉变的玉米、高梁、小麦等谷类作物中,是世界范围内粮食饲料的污染物之一,在奶类、肉类和蛋类也被检出,污染率较高.研究表明,ZEN对畜禽具有很强的生殖毒性和致畸作用,导致生长下降,免疫抑制,繁殖障碍,给畜牧业带来巨大的经济损失.ZEN进入人体,能诱发肿瘤等毒害现象,给人类健康造成极大的危害.由于受到不同因素的影响,所以在不同的国家不同的食品中有不同的标准.目前我国尚未制定食品中的限量标准.现就ZEN的理化性质、体内代谢及毒理学研究资料进行综述.
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复合柱净化-超高效液相色谱串联质谱法测定植物油及谷类制品中玉米赤霉烯酮和α-玉米赤霉烯醇
目的 建立C1s-A12O3复合填料固相萃取柱净化,同时检测植物油及谷类制品中玉米赤霉烯酮和α-玉米赤霉烯醇的超高效液相色谱串联质谱方法.方法 谷类制品先用正己烷-乙酸乙酯(50∶50,V/V)提取,然后和植物油一样用乙腈-水(90∶10,V/V)萃取玉米赤霉烯酮类真菌毒素,进一步用C18-Al2O3固相萃取柱净化,以乙腈-水为流动相梯度洗脱,以C18色谱柱(2.1 mm×100 mm,1.6 μm)进行色谱分离,电喷雾离子化负离子多反应监测模式检测,13C18-玉米赤霉烯酮为内标定量.结果 玉米赤霉烯酮和α-玉米赤霉烯醇的线性范围为1.0 ～500 ng/mL,在植物油和谷类制品中的检出限分别为0.3和0.2 μg/kg,定量限为1.0和0.5μg/kg.当添加量为1 ～ 100 μg/kg时,玉米赤霉烯酮和α-玉米赤霉烯醇的平均回收率分别为93.5％ ～ 108.0％和92.0％ ～ 105.0％,相对标准偏差分别为3.2％ ～ 8.5％和4.6％ ～7.8％(n=6).采用该方法对市售的55份样品进行测定,以玉米油中玉米赤霉烯酮和α-玉米赤霉烯醇含量、检出率高,高含量分别为453.1和5.0 μg/kg,中位值分别为126.2和2.0 μg/kg.结论 该方法操作简便快速,净化效果好,灵敏准确,检测成本低,适于植物油和谷类制品中玉米赤霉烯酮和α-玉米赤霉烯醇的快速检测.
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玉米赤霉烯酮ELISA定量检测试剂盒研制
目的研制玉米赤霉烯酮ELISA快速定量检测试剂盒,用以检测食品中抗玉米赤霉烯酮(ZEN).方法在ZEN单克隆抗体基础上,用间接竞争酶联免疫吸附法研究试剂盒的各项指标.结果试剂盒低检出浓度为1ng/ml,标准曲线的线性范围为1～200ng/ml,回归方程为Y=0.99-0.40X(R2=0.99);抗体对ZEN 50%的抑制浓度为16.3ng/ml;对玉米和小麦的平均加标回收率分别是96.5%和95.5%,变异系数分别是13.2%和10.9%;试剂盒4℃保质期超过6个月;对参试真菌毒素的交叉反应率均小于1%;实验室内的变异系数小于15%,实验室间变异系数小于20%;用本法与HPLC法同时检测美国维康公司玉米赤霉烯酮盲样,结果均在允许范围之内,且两种检测方法无差别.结论该试剂盒各项指标符合相关技术要求,具有快速、灵敏、稳定、专一的特点.
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2013-2016年陕西省市售食品中玉米赤霉烯酮的污染状况及暴露评估
目的 了解陕西省市售食品中玉米赤霉烯酮(zearalenone,ZEN)的污染状况,评估居民通过玉米相关食品摄入的玉米赤霉烯酮的膳食暴露量,对陕西居民的人体健康风险进行评估.方法 2013-2016年,在陕西省10个地市随机采集市售食品,包括谷物及其制品(小麦及小麦制品、玉米及玉米制品、大米、小米)、玉米油、啤酒、婴幼儿辅助食品和焙烤食品(面包、饼干),采用超高效液相色谱法对玉米赤霉烯酮进行检测,结合玉米相关食品的膳食消费量,对陕西省居民膳食暴露玉米赤霉烯酮进行点评估.结果 玉米赤霉烯酮总检出率为17.27％ (206/1193),平均值为13.5μg/kg.玉米油的检出率和平均值均高,分别为79.37％和149 μg/kg,谷物制品中有12份样品超标,超标率为1.64％,均为玉米及其制品.小麦粉及其制品、大米、小米、啤酒和焙烤食品受玉米赤霉烯酮的污染较少.婴幼儿辅助食品的检出率为20.83％(5/24).结论 陕西省市售食品中玉米赤霉烯酮在不同制品中检出率差别较大.经风险分析,居民经膳食摄入的玉米赤霉烯酮对人体的健康危害较低,总体安全性好,但玉米相关食品含量较高.
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玉米赤霉烯酮毒性研究及检测方法进展
玉米赤霉烯酮是由镰刀菌产生的一种广泛污染谷物食品的真菌毒素,对动物、人类都会产生毒害,人们食用被其污染的食物会导致肝癌、睾丸癌、食道癌及青春期早熟等疾病.目前的检测方法有:高效液相色谱、气相色谱、薄层色谱、无毒检测体系和免疫学检测.综述玉米赤霉烯酮的毒性研究、检测方法及其预防.
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减肥茶中多种真菌毒素的在线免疫亲和净化液相色谱-串联质谱测定研究
目的 建立在线免疫亲和柱净化-液相色谱-串联质谱快速测定减肥茶中的多种真菌毒素的方法.方法采用PBS/甲醇溶液提取样品中的真菌毒素,再利用可重复使用多功能免疫亲和柱在线净化样品,净化液在线进行液相色谱-串联质谱的测定.结果方法可同时测定减肥茶中伏马毒素、T-2毒素、HT-2毒素、赭曲霉毒素A(OTA)、玉米赤霉烯酮等10种真菌毒素,其小检出浓度(LOQ)为1～5 μg/kg;三水平添加回收率(n=6)为65.3％～102.4％;相对标准偏差(RSD)为4.5％ ～ 13.2％.结论本方法在线免疫亲和净化技术与质谱定性定量同时完成,方法简便、快速,检测限满足了国内外减肥茶中真菌毒素限量要求,可用于减肥茶中真菌毒素的快速检测.
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抗玉米赤霉烯酮单克隆杂交瘤细胞系的建立及单抗生产
为快速检测食品中的玉米赤霉烯酮(Zearalenone以下简称ZEN),建立了抗ZEN的单克隆杂交瘤细胞株.用ZEN-BSA偶联物免疫8～10周龄雌性BalB/c小鼠后,取脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞Sp2/0融合,经过4～5次亚克隆建立了稳定分泌抗ZEN抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为Z2A4、Z8D6.将上述2种杂交瘤细胞分别注入BalB/c小鼠腹腔,获得含抗ZEN单克隆抗体的腹水.将腹水用饱和硫酸铵盐析法纯化,得到Z2A4、Z8D6单克隆抗体.经鉴定,其亚类为IgG,抗体腹水效价Z2A4和Z8D6分别为1:1.6×106和1:3.2×106;分子量均为150000(150kD);参考工作浓度分别为1:40000和1:100000;纯化后抗体IgG含量分别为34和39 mg/ml;抗体与其它霉菌毒素无交叉反应(交叉反应率＜1%),具有较高特异性;抗体亲和力常数Z2A4和Z8D6分别为5.52×108和4.68×109 mol/L.
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液相色谱-串联质谱法测定粮食中的玉米赤霉烯酮
目的 应用液相色谱-串联质谱法建立粮食中玉米赤霉烯酮的检测方法,并对宁夏市售小麦粉和玉米制品进行分析.方法 样品经乙腈-水(84∶16,V/V)提取,PriboFast 226多功能净化柱净化;以甲醇-10 mmol/L乙酸铵水溶液为流动相梯度洗脱,用Atlantis T3色谱柱分离,以电喷雾负离子模式进行质谱测定.结果 分别以小麦粉和玉米制品为加标基质,3个加标水平下玉米赤霉烯酮的平均回收率为85.4％～93.7％,RSD＜ 9.0％,检出限(S/N=3)为0.08 μg/kg,定量限(S/N=10)为0.2μg/kg.结论 该方法操作快速简单、重现性好,可用于粮食中玉米赤霉烯酮的检测.
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玉米赤霉烯酮毒性研究进展(综述)
玉米赤霉烯酮(Zearalenone,ZEA),又称F-2毒素,是由镰刀菌产生的一种霉菌毒素.主要产毒菌株为禾谷镰刀菌,此外,粉红镰刀菌、尖孢镰刀菌、三线镰刀菌、串珠镰刀菌、黄色镰刀菌以及雪腐镰刀菌等也能产生ZEA.玉米、小麦、燕麦和大麦等作物易受到ZEA污染,由于ZEA具有生殖发育毒性、免疫毒性,对肿瘤发生也有一定影响,对人和动物的健康有潜在危害,所以日益受到重视.本文就ZEA的毒性研究进展及其可能的作用机制作一简要综述.
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抗玉米赤霉烯酮单克隆抗体免疫亲和柱的研究制备
目的 研究制备抗玉米赤霉烯酮(Zearalenone,ZEN)单克隆抗体免疫亲和柱(IAC).方法 用辛酸硫酸铵法纯化抗ZEN单克隆抗体,将纯化好的单抗与溴化氰活化的4FF葡聚糖偶联制备抗ZEN单克隆抗体免疫亲合柱.采用紫外扫描鉴定偶联反应,间接竞争酶联免疫吸附法及高效液相色谱法(HPLC)对制备好的免疫亲合柱进行评价.结果 每根抗ZEN单克隆抗体免疫亲和柱,使用0.5 ml溴化氰活化的4FF葡聚糖,350 μg ZEN单克隆抗体,柱容量为0.40 μg.小麦样品添加ZEN标品60～300μg/kg,回收率76.33%～90.10%,相对标准偏差6.68%～10.93%.使用本实验室制备的抗ZEN单克隆抗体免疫亲合柱建立了IAC-HPLC方法,并检测小麦、玉米、饲料样品30份,结果有17份样品为阳性,阳性率56.67%,样品中ZEN含量为31.33～377.84 μg/kg;信噪比为3∶1时,检测下限为10.00 μg/kg.结论 抗ZEN单克隆抗体免疫亲和柱能快速特异地将ZEN从样品中分离出来,并同时完成净化和浓缩步骤,是一种简便的净化方法.
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中国居民小麦粉和玉米制品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇和玉米赤霉烯酮暴露水平评估
目的 分析中国小麦粉和玉米制品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)和玉米赤霉烯酮(ZEN)的污染水平,以及人群DON和ZEN的暴露情况.方法 于2009年,按照分层整群随机抽样原则,选取中国13个省份44个市(区、县)的107个超市或市场为采样点,分别采集小麦粉和玉米制品样品292、347份.采用超高效液相色谱-串联质谱法方法检测样品中DON和ZEN污染水平.结合2002年“中国居民营养与健康状况调查”的3 ～13、≥14岁的68 959名调查对象的数据,采用有放回地随机抽样方法以及蒙特卡罗(Monte Carlo)法得到调查对象每日DON和ZEN暴露量的P1～P99及其分布,将DON和ZEN暴露量的P1～P99分别与暂定大每日耐受摄入量(PMTDI)和每日耐受摄入量(TDI)进行比较,分析超过健康指导值的小暴露量百分位数及其分布,采用t检验比较不同年龄组调查对象DON和ZEN暴露量差异.结果 小麦粉和玉米制品中DON污染阳性率分别为100.0％(292/292)、97.4％(338/347),高于限量标准(1μg·kg-1 ·d-1)的样品分别占1.7％ (5/292)、4.6％(16/347);小麦粉和玉米制品中ZEN污染阳性率分别为53.4％ (156/292)、87.6％(304/347),玉米制品中ZEN高于限量标准(0.25μg·kg-1·d-1)的样品占15.6％(54/347),小麦粉样品中ZEN均未超过限量标准(0.25 μg·kg-1·d-1).3～13岁组DON的P50、P75、P90、P95、P975和P99的x (95％ CI)分别为0.170 (0.170～0.171)、0.762(0.759 ～0.765)、2.066(2.038 ～2.069)、3.515(3.501 ～3.530)、5.342(5.314 ～5.372)和9.220(9.155 ～9.279) μg·kg-1·d-1,均高于≥14岁组的x(95％CI)[0.131(0.130～0.131)、0.500(0.498 ～0.501)、1.280(1.276 ～1.285)、2.138(2.128 ～2.147)、3.510(3.494 ～3.527)和5.512(5.474～5.546) μg· kg-1·d-1](t值分别为87.19、163.87、164.66、157.78、105.47和96.31,P值均＜0.001),3～13岁组ZEN的P50、P75、P90、P95、P975和P99暴露量分别为0.001 (0.001～0.001)、0.006(0.006 ～0.006)、0.039(0.038 ～0.039)、0.101 (0.100 ～0.101)、0.195 (0.194 ～0.197)和0.378(0.374 ～0.381) μg · kg-·d-1,均高于≥14岁组的x(95％CI)[0.001 (0.001 ～ 0.001)、0.004(0.004 ～0.004)、0.026(0.026 ～0.026)、0.061(0.060 ～0.061)、0.115(0.115 ～0.116)和0.232(0.231 ～0.235)μg· kg-1·d-1](t值分别为151.11、73.80、96.81、100.81、91.93和76.13,P值均＜0.001).3～13岁组超过PMTDI的DON小暴露水平为P76,其P99为1.03 μg·kg-1·d-1,≥14岁组超过PMTDI的DON小暴露水平为P84,P95为1.01μg·kg-1·d-1.3～ 13岁组超过TDI的ZEN小暴露水平为P97,其P95为0.25μg·kg-1·d-1,≥14岁组超过TDI的ZEN小暴露水平为P98,其P90为0.26 μg·kg-1·d-1.结论 中国小麦粉和玉米制品中DON和ZEN的污染水平较低;人群膳食DON和ZEN暴露风险较低;3～ 13岁组对DON和ZEN的膳食暴露量均高于≥14岁组,是膳食暴露DON和ZEN的高危人群.
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玉米赤霉烯酮调节细胞色素P450 3A4转录表达的研究
目的研究真菌性雌激素玉米赤霉烯酮(ZEA)是否能通过活化人甾体激素和外源化学物受体(SXR)诱导细胞色素P450 3A4(CYP3A4)的转录表达.方法在人肝肿瘤细胞株细胞中,用瞬时共转染报告基因试验即共转染含人SXR序列质粒和含CYP3A4外源化学物反应元件的报告基因质粒来检测ZEA对SXR介导的CYP3A4的转录调节作用. 结果 ZEA能通过活化SXR诱导CYP3A4的转录表达,并具有剂量-效应关系和时间-效应关系.在剂量-效应关系研究中,ZEA浓度分别为0.01、0.10、1.00和10.00 μmol/L时,其诱导倍数分别为0.1%二甲基亚砜处理细胞的(1.50±0.21)倍、(1.66±0.27)倍、(3.04±0.82)倍和(3.96±1.16)倍.在时间-效应关系研究中,1.00和10.00 μmol/L的ZEA处理细胞48 h后,诱导能力分别为0.1%二甲基亚砜处理细胞的(3.69±1.34)倍和(5.18±1.50)倍.在浓度为10 μmol/L,处理时间为48 h时诱导能力大,为用0.1%二甲基亚砜处理细胞的(5.18±1.50)倍. 结论 ZEA能通过活化SXR诱导CYP3A4的转录表达.ZEA对CYP3A4的诱导可能影响其他CYP3A4底物,尤其是药物在体内的代谢.
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玉米赤霉烯酮对乳腺癌细胞MCF-7增殖和凋亡的影响
目的观察真菌雌激素玉米赤霉烯酮(ZEA)对人乳腺癌细胞MCF-7增殖和凋亡的影响,并初步探讨其分子生物学作用机制.方法用噻唑蓝比色法观察ZEA对MCF-7细胞增殖活力流式细胞术观察ZEA对MCF-7细胞增殖活力和细胞周期分布的影响;用凋亡DNA片段检测试剂盒和流式细胞术从不同方面检测ZEA对细胞凋亡的影响; 逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白印迹技术检测ZEA对bcl-2和bax mRNA和蛋白质表达的影响.结果 MCF-7细胞生长为雌激素依赖性:溶剂对照组(外源性雌激素缺乏且内源性雌激素耗尽的条件下)细胞增殖活力为100%,10 nmol/L雌二醇组细胞增殖活力为257.6%;另外,以溶剂对照组发生凋亡率为100%来计,10 nmol/L 雌二醇组细胞凋亡率只有为10.8%.ZEA对MCF-7细胞生物学效应的影响同雌二醇类似:在2～96 nmol/L浓度范围内,ZEA可快速恢复MCF-7细胞增殖活力(96 nmol/L组细胞增殖活力为对照组的2.4倍),提高S期细胞分布比例(96 nmol/L组S期细胞分布比例为对照组的2.3倍),降低凋亡百分率(96 nmol/L组细胞细胞凋亡率为对照组的23.7%),并呈现出良好的剂量-效应关系.RT-PCR和蛋白印迹结果分析显示,ZEA能够促进bcl-2 mRNA和蛋白质表达,对bax的表达则表现出抑制作用.结论同雌激素类似,ZEA可提高MCF-7细胞增殖活力并促进有丝分裂指数;通过对bcl-2和bax表达的调节作用,ZEA可抑制雌激素耗尽所诱导的MCF-7细胞凋亡.
