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应用基因敲除和RNA干扰技术研究睾丸特异性新基因
睾丸特异性基因(testis-specific-gene),是指主要在睾丸组织中表达,面在机体其他组织中不表达或者极低表达的基因.睾丸特异性基因主要与睾丸功能有关,此类基因的正常表达多与睾丸雄激素产生、精子发生有关.
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基于Nrf2/ARE通路的加味大黄蟅虫颗粒对精索静脉曲张模型大鼠的生精效应观察
目的 观察加味大黄蟅虫颗粒对精索静脉曲张性不育模型大鼠的生精效应.方法 按照随机数字表法将40只大鼠随机分为4组:假手术组、模型组、迈之灵组、加味大黄蟅虫颗粒组,每组10只.建立精索静脉曲张性不育大鼠模型,给药干预方法:假手术组、模型组每天给予生理盐水灌胃;迈之灵组大鼠每天给予迈之灵片54mg/kg;加味大黄蟅虫颗粒组每天给予加味大黄蟅虫颗粒(10g/kg)灌胃.4周后检测大鼠附睾精子的质量,检测大鼠睾丸组织生化酶学的活性,比较大鼠睾丸上皮显微超微结构的改变,免疫组化检测模型大鼠睾丸组织中Nrf2蛋白的表达.结果 与假手术组比较,模型组大鼠附睾精子浓度低,睾丸病理改变明显,睾丸曲细精管层次紊乱,成熟精子数量减少或缺如;透射电镜下睾丸各级生精细胞坏死,线粒体空泡化,内质网扩张,细胞核染色质固缩、核崩解;免疫组化睾丸组织中Nrf2的棕黄色阳性表达的细胞辉度低.与模型组相比,迈之灵组和加味大黄蟅虫颗粒组精子浓度显著高于模型组,成熟精子数量和生精细胞形态结构明显恢复;免疫组化睾丸组织中Nrf2的棕黄色阳性表达的细胞辉度明显升高;迈之灵组和加味大黄蟅虫颗粒组超氧化物歧化酶(SOD)、α-葡萄糖苷酶的活性、果糖浓度与模型组比较有差异性(P＜0.05).结论 加味大黄蟅虫颗粒能改善精索静脉曲张大鼠睾丸的病理损伤,提升睾丸组织中Nrf2的蛋白表达,对睾丸的精子发生发育具有一定的保护作用.
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续断种子方干预无精子症模型小鼠睾丸的精子发生
目的 观察续断种子方对无精子症模型小鼠睾丸精子发生发育过程中c-kit/CFTR表达的影响,探索中药干预睾丸生精功能的影响.方法 按照随机数字表法分为对照组,模型组,麒麟丸组,续断种子方高、中、低剂量组.采用白消安和环磷酰胺建立无精子症小鼠模型.各治疗组给予相应药物灌胃,对照组和模型组小鼠给予等体积生理盐水,每日1次,连续8周.检测小鼠附睾的精子质量、睾丸组织显微超微结构、睾丸组织c-kit/CFTR蛋白的表达.结果 模型组偶见散在精子,睾丸生精上皮不同程度破坏,精原细胞、精母细胞线粒体空化明显,部分线粒体脊消失,核膜局部破损,c-kit/CFTR免疫组化棕黄色阳性表达的细胞散在;续断种子方高剂量组、麒麟丸组、对照组小鼠附睾精子浓度较高,睾丸生精上皮见精子、精子细胞、精母细胞,线粒体空化少,可见丰富的高尔基体、内质网结构,c-kit/CFTR免疫组化棕黄色阳性表达的细胞辉度大.与对照组相比,模型组α一葡糖苷酶、果糖浓度明显有差异性(P＜0.05);与模型组相比,续断种子方高剂量组、麒麟丸组、对照组丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、α-葡萄糖苷酶的活性、果糖浓度与模型组有差异性(P＜0.05).结论 续断种子方可以有效促进睾丸生精上皮的精子发生,增加精子的数量,达到“以通为用,和营生精”之效.
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支持细胞信号通路在精子发生减数分裂调节中的作用
减数分裂是精子发生中的重要环节,它保证了遗传信息的稳定性.减数分裂全程都是在支持细胞近腔小室中完成,除了生精细胞自身基因调节外,主要受到支持细胞分泌因子的调节.支持细胞是生精小管中唯一的体细胞,直接与精原细胞相互作用,通过分泌旁分泌因子调节精母细胞减数分裂.近年大量研究证实,卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone, FSH)、视黄酸(retinoic acid, RA)、雄激素在减数分裂中起到重要作用,文章综述这些物质如何通过支持细胞的中介进而调节减数分裂,为后续研究支持细胞在精母细胞减数分裂中的作用提供思路和启发.
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雄激素与精子发生的关系
雄激素被认为在精子发生中具有重要作用.近年的动物实验以及临床研究提示,雄激素可以导致严重少精子或者无精子症,内源性睾酮可以引起生精细胞凋亡,与生精细胞阻滞高度相关.本文对近年的材料进行分析后,认为雄激素与精子发生的关系在于,雄激素可以引起生精细胞凋亡,造成细胞重排,对精子发生起到调节作用.
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环境危险因素与男性生殖力
近年来,越来越多的基础和临床研究提示环境污染物危及男性生育力,主要表现为精子密度和精液质量等的下降,此外,环境污染物还引起男性生殖系统畸形和肿瘤发病率升高.由于这些环境污染物能干扰人体内分泌系统,因此又被称为内分泌干扰物(EDs).EDs类物质主要通过下丘脑-垂体-睾丸轴系影响生殖内分泌系统和破坏氧化/抗氧化系统而损害男性生育力.此外,EDs类物质还可以影响甾体激素与受体之间相互作用、阻止甾体激素的生物合成、影响甾体激素的代谢、直接影响精子遗传物质和影响Sertoli细胞之间的细胞连接等多种途径干扰男性生育力.EDs类物质可以在睾丸、附睾以及精囊腺等各个水平影响男性生育力.
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精子发生的基因调控
在精子发生的整个过程中,基因的表达和调控都起着至关重要的作用.在有丝分裂阶段的精原细胞中有405个基因表达;精母细胞中无DNA复制,DNA修复至关重要,许多基因参与这个过程中的基因重组与DNA修复,有442个基因高表达于精母细胞;在减数分裂后的精子细胞中有175个基因表达[1].
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NYD-SP6基因在无精症患者和不同年龄段人群睾丸中的表达
目的探讨NYD-SP6基因在无精症患者和不同年龄人群中的表达及意义.方法将睾丸标本按胚胎、成年人、老人不同年龄段分成3组:胚胎组(4例)、成人组(4例)及老人组(4例);将无精症患者按病理类型分成3组,生精细胞减少组(7例)、生精阻滞组(13例)及唯支持细胞综合征组(3例).应用实时(Real time)逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法定量测定这些睾丸组织NYD-SP6基因的表达水平.结果与成人组比较,胚胎和老人组NYD-SP6基因的表达量降低,差异有统计学意义(P＜0.01);生精阻滞组和唯支持细胞综合征组的表达量降低,差异有统计学意义(P＜0.01),而生精细胞减少组与成人组比较差异无统计学意义(P＞0.05).结论NYD-SP6基因的表达具有时相性,它在成人睾丸的高表达及在生精阻滞和唯支持细胞综合征患者睾丸表达显著降低,提示其在精子发生中具有重要意义.
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精子再生过程中Ki-67、Thy-1和Oct4的表达及其意义
重建精子发生是研究精原干细胞(SSCs)增殖分化调控机制的一种重要手段.细胞株增殖抗原Ki-67在精原细胞中呈阳性表达~([1]).Thy-1和Oct4虽是造血干细胞、胚胎干细胞等多种干细胞的标记物,但在SSCs中的表达尚存在争议~([2]).我们在建立小鼠精子再生模型的基础上,观察不同时期生精上皮组织形态学变化以及生精细胞Ki-67、Thy-1和Oct4的表达特点.
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二次白消安腹腔注射致小鼠精子再生模型的建立
目的 建立一种小鼠精子再生模型.方法 采用不同剂量白消安(单剂10 mg/kg、20 mg/kg和间隔24 d二剂10 mg/kg)小鼠腹腔注射,分别于给药后第一、二、三、四、六、八周取材,进行光镜和电镜观察.二次给药组采用免疫组化检测生精细胞Ki-67表达,TUNEL标记法检测生精细胞凋亡.结果 间隔24 d二剂10 mg/kg白消安对生精上皮的损伤效应介于单剂10 mg/kg和20 mg/kg之间.第二次给药后2周,生精上皮仅基底部残留以单个型精原细胞(As型)为主精原细胞和支持细胞;第三周As型精原细胞增多;第四周分化精原细胞和精母细胞出现;6～8周出现精子发生,生精上皮结构逐步恢复正常.二次给药后1～2周生精细胞凋亡指数显著高于对照组(P＜0.01),以后逐步下降,至第六～八周恢复至对照组水平(P＞0.05).精原细胞Ki-67阳性率在第一～二周低,在第三周高,第四周开始下降,第六～八周与对照组无显著差异.结论 间隔24 d二次白消安(10mg·kg-1·次-1)腹腔注射可建立小鼠精子再生模型,诱导凋亡为白消安致生精细胞损伤的重要机制.二次给药后3周主要为精原干细胞增殖期,4周为分化期,6～8周为精子发生恢复期.
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Spag6L基因真核表达质粒的构建及细胞内的蛋白表达与定位
目的:构建小鼠Spag6L基因真核表达质粒,并研究其在细胞内的表达与定位.方法:以小鼠睾丸cD-NA基因文库为模版,PCR扩增Spag6L基因全长序列,测序正确后亚克隆至pEGFP-N2和pcDNA3真核表达载体中并酶切鉴定,将构建成功的重组表达质粒转染至COS-7与CHO细胞中,Western blot法检测COS-7细胞中SPAG6L蛋白表达,激光共聚焦扫描显微镜观察SPAG6L蛋白在CHO细胞内的定位.结果:重组质粒pEGFP-Spag6L和pcDNA3-Spag6L经双酶切后产生的1.5 kb的目的插入片段,经测序证实与Spag6L基因一致.GFP-SPAG6L融合蛋白分子质量为82 kU,SPAG6L蛋白分子质量为56 kU.SPAG6L蛋白在CHO细胞中主要定位于细胞质,以微管和囊泡表达为主.结论:构建的pEGFP-Spag6L和pcDNA3-Spag6L真核表达质粒成功,为进一步探究Spag6L基因与Spag6基因的关系以及Spag6L基因在精子发生中的功能与作用奠定了基础.
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BC022687融合蛋白在大肠杆菌中的表达、纯化、抗体制备及特异性鉴定
目的:构建BC022687的原核表达载体,诱导该质粒在大肠杆菌中表达并纯化其表达的融合蛋白,制备抗体并进行特异性鉴定.方法:采用RT-PCR法从18 20 g体重雄性小鼠睾丸组织中扩增BC022687 cDNA,经TA克隆及亚克隆方法后定向连入原核表达质粒pET 28a,将重组表达质粒转化至大肠杆菌BL-21(DL3)上,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析,用考马斯亮蓝染色及Western blot分析鉴定后,利用镍亲和层析法纯化表达融合蛋白,免疫新西兰兔,制备多克隆抗体,以诱导表达的融合蛋白为样本,Western blot实验检测抗体的特异性.结果:测序结果证实成功扩增出目的基因BC022687;酶切和测序结果证实pET-28a-BC022687原核表达载体构建成功;SDS-PAGE电泳显示表达出18.0 kU的外源蛋白.Western blot检测结果显示,表达出的蛋白为6×His tag的融合蛋白,而且Ni-NTA亲和层析法纯化该重组蛋白成功;将纯化的融合蛋白免疫新西兰兔,制备获得了抗BC022687蛋白的多克隆抗体,鉴定实验显示抗体特异性好.结论:已成功构建、表达、纯化了BC022687融合蛋白,以及成功制备了其特异性抗体,为研究BC022687蛋白在精子发生中的作用奠定了基础.
关键词： BC022687蛋白 原核表达 蛋白纯化 多克隆抗体 精子发生 -
己烯雌酚对睾丸萎缩大鼠生精及干细胞因子水平的影响
目的探讨己烯雌酚(DES)对大鼠睾丸生精障碍的治疗作用及雌激素在精子发生中的作用.方法应用2,5-己二酮喂饲雄性大鼠制成睾丸生精障碍动物模型,隔日皮下注射DES 0.1 ml,剂量分别为0.3、30、300μg/kg,共2周.对照组相应皮下注射油酸乙酯0.1 ml.第8周行血清睾酮(T)、黄体生成素(LH)放射免疫测定.第18周取双侧睾丸组织,行HE染色,RT-PCR检测可溶型SCF mRNA(sSCF mRNA)和膜型SCF mRNA(mSCFmRNA)的表达,用MI-1000凝胶电泳多媒体系统分析2种SCF mRNA相对表达水平.结果组织病理显示DES注射组生精功能均有不同程度恢复,以中等剂量(30μg/kg)组恢复为明显;放射免疫测定示30、300μg/kgDES对血清睾酮水平抑制较明显,LH水平不受影响;RT-PCR结果显示DES注射能够极为显著地提高mSCF mRNA表达水平且随DES剂量增加而增高.结论DES能够显著改善2,5-己二酮染毒大鼠的生精功能;在雌激素促进精子发生的作用中抑制下丘脑-垂体-睾丸轴或提高mSCF mRNA表达水平均不是主要途径.
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热休克蛋白70-2在精子发生及精卵识别中的研究进展
热休克蛋白(heat shock protein,HSP)是所有生物细胞在理化和生物等应激原刺激后,发生热休克反应时所产生的一类伴随细胞内功能性蛋白的伴侣蛋白分子.热休克蛋白根据分子量大小,主要分为4个家族:HSP90家族(83～90 kD)、HSP70家族(66～78 kD)、HSP60家族及小分子HSP家族(15～30 kD).此外还有分子量在100～ 110 kD的大分子HSPs.
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氧自由基对精子功能的影响
氧自由基(oxygen free radical,OFR)又叫活性氧簇(reactive oxygen species, ROS),是近年来研究较多的体内信息基团和效应基团研究较多.作为机体氧代谢过程中产生的一类化学基团,其广泛存在于心血管、神经、免疫、消化、生殖及呼吸系统器官的细胞内.正常情况下,ROS的生成与清除处于动态平衡,以维持机体结构的完整和功能正常.如果ROS浓度过高可以导致细胞病理的改变.生殖细胞跟机体其它细胞一样容易受到ROS的损伤.所以在精子发生、发育、成熟、贮藏各个阶段都需要抗氧化物的保护.近又有实验证实ROS有信号传递的作用,而且在生殖过程的某些关键环节中,这种信使ROS有很重要的调节作用.
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男性不育症常见病因分析
1.遗传因素遗传基因的异常可导致少、弱精症,影响精子的发生及成熟过程.据统计,基因突变和染色体异常等遗传因素所引起的精子发生障碍估计占男性不育因素的30%.有研究发现[1-2]Y染色体AZF区微缺失可能是男性原发不育的一个重要遗传病因.杨元等研究所确定的AZF区域8个STS位点缺失与中国人原发无精和严重少精密切相关,并发现利用STS位点与试验设计的多重聚合酶链反应技术进行微缺失分析,可以准确、方便、快速地完成中国人原发无精与少精症AZF区域微缺失的基因诊断.另有学者研究显示DAZLA与精子生成过程和男性不育有关, Sycp3基因在男性不育过程中有着重要的作用,这些研究为不育的基因治疗提供了新靶点.
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阴股沟薄皮瓣重建阴囊对精子发生影响的实验研究
目的:本课题将对阴股沟区薄皮瓣重建阴囊后睾丸生殖细胞凋亡的改变进行实验研究,探讨阴股沟薄皮瓣重建阴囊后对精子发生的影响.方法:以育龄期雄性小型猪为实验动物,通过采用阴股沟薄皮瓣的方式建立动物模型,并于模型建立前及建立后第2周、4周、6周、8周进行睾丸活检,检测生精细胞凋亡及FAS\FASL表达及4个月后对生育情况进行观察.结果:薄皮瓣组在重建阴囊后第2至第8周生精细胞AI逐渐降低;传统皮瓣组在重建阴囊后第2周至第8周生精细胞AI逐渐增高;传统皮瓣组及薄皮瓣组FasL蛋白表达均增强,但是薄皮瓣组4周后FasL蛋白表达未见明显增强,与空白组比较差异无显著意义.传统皮瓣组4个月配对雌猪均未受孕与薄皮瓣组,空白组比较差异显著有统计学意义(P<0.05);薄皮瓣组8周末配对雌猪受孕率66.7%,与空白组比较无统计学意义(P>0.05).结论:①与传统皮瓣组比较,薄皮瓣重建阴囊对精子发生影响较小,实验动物仍具有生育能力.②FasL蛋白在传统皮瓣重建阴囊组生精细胞中高表达,而薄皮瓣组表达无明显升高.③相对传统皮瓣组薄皮瓣重建阴囊组,睾丸生精细胞凋亡程度较轻,对生精功能无明显影响.薄皮瓣重建阴囊更接近正常阴囊状态,对生精功能无明显影响.
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大鼠生精相关基因TSARG1原核表达载体的构建和表达
目的 构建大鼠生精相关基因pGEX-KG/TSARG1重组载体并进行原核表达.方法 应用RT-PCR技术从大鼠睾丸组织mRNA中扩增TSARG1的开放阅读框(ORF),T-A克隆后将TSARGI插入到原核表达载体丙EX-KG中,经测序鉴定后将重组质粒转入宿主菌E.coli BL21,IPTG诱导表达GST/TSARG1融合蛋白.结果 成功构建pGEX一KG/TSARG1重组质粒;转化重组质粒的E.coli BL21经IPTG 37℃诱导高效表达GST/TSARG1融合蛋白.结论 pGEX一KG/TSARG1原核表达载体的成功构建为进一步研究TSARG1的生物学功能奠定了基础.
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蛋白激酶CK2与精子发生
蛋白激酶CK2是一种真核细胞中普遍存在的信使非依赖性丝/苏氨酸蛋白激酶.CK2与精子发生的关系十分密切,它可在精子发生的不同阶段发挥重要作用,是一个新的男性不育候选基因.
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支持细胞代谢调节对精子形成的影响
支持细胞对于精子形成是至关重要的,为发育中的生殖细胞提供能量和营养支持.这两种细胞的代谢各有其特点,生殖细胞倾向于利用乳酸作为能量来源,而支持细胞倾向于利用脂质产生ATP,且利用葡萄糖生成乳酸供给生殖细胞.许多因素包括激素和其他外源性物质以支持细胞为靶点通过调节葡萄糖在支持细胞上的转运、丙酮酸向乳酸的转化及乳酸的转运进而影响精子形成过程.虽然这些过程的具体机制还未完全清楚,但不能否定支持细胞对于精子形成过程的重要作用.
