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重组人抗血栓蛋白质控方法和质量标准研究
目的:建立重组人抗血栓蛋白(recombinant human antithrombus protein,rHAP)的质控方法和质量标准.方法:采用活化部分凝血活酶时间法(APTT法)测定生物学活性;还原型SDS-PAGE测定相对分子质量;非还原SDS-PAGE和反相高效液相色谱测定纯度;胰蛋白酶酶切后用反相高效液相色谱法分析肽图;其余检测项目按2010年版《中华人民共和国药典》三部规定进行.结果:用建立的方法对原液和成品进行了检定,各项指标均符合《人用重组DNA制品质量控制技术指导原则》和2010年版《中华人民共和国药典》三部的要求.结论:建立的质控方法和质量标准能够保证产品安全、有效、质量可控,可用于注射用重组人抗血栓蛋白产品的常规检定.
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人脐静脉内皮细胞增殖抑制法检测贝伐珠单抗活性的优化和应用
目的:优化人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)增殖抑制法,并用优化后方法比较6种贝伐珠单抗(bevacizumab)生物类似药(similar bio-therapeutic products,SBPs)候选药物与原研药的生物学活性.方法:对细胞接种量、VEGF165浓度和样品稀释浓度进行优化,提高方法精密性和准确性.使用优化后的方法,以贝伐珠单抗为参比品,测定6种贝伐珠SBPs的生物学活性,并与原研药进行比较.结果:优化后的HUVEC增殖抑制法,信噪比为1.5 ～1.8,板间变异度＜20％,在70％ ～ 130％活性范围内有良好的准确性.使用优化后方法检测,质控样品的相对活性均值为102.00％,6种贝伐珠SBPs的相对活性分别为95.12％,88.81％,96.96％,103.00％,105.70％和102.40％.结论:通过优化,HUVEC增殖抑制法的精密性和准确性较经典方法有显著提高,适用于贝伐珠单抗及其SBPs的可比性评价.
关键词： 血管内皮细胞生长因子 单抗 生物学活性 质量控制 -
磷脂化重组人铜锌超氧化物歧化酶的质量研究
目的:磷脂化重组人铜锌超氧化物歧化酶(phosphatidyl choline Cu/Zn superoxide dismutase,简称PC-SOD)是由重组人铜锌超氧化物歧化酶(rhCu/Zn-SOD,简称SOD)经磷脂化修饰而成,对该创新药物的质量研究,需要针对SOD原液、PC-SOD原液和PC-SOD成品的关键质量属性建立质控方法,从而为其质量标准的建立和申报临床研究奠定基础.方法:采用凯氏定氮法测定制品的蛋白含量;采用经典的氮蓝四唑(NBT)还原法测定其生物学活性;采用原子吸收光谱法检测其铜、锌含量;应用磷脂检测试剂盒,采用碱水解显色法检测PC-SOD的胆碱含量;采用SDS-PAGE法和RP-HPLC两种方法测定SOD原液的纯度,采用RP-HPLC和SEC-HPLC两种方法测定PC-SOD原液的纯度;采用Pico-Green荧光法测定外源性DNA残留量.结果:SOD原液、PC-SOD原液和PC-SOD成品的蛋白含量分别为96.46 mg· mL-1,50.53 mg· mL-1和每剂40.07 mg;SOD原液、PC-SOD原液和PC-SOD成品的生物学活性分别为5.11×105 u· mL-1,1.4×105U·mL-1和每剂1.04×105 U,比活性分别为5 298,2 771和2 595 U·mg-1;SOD原液的铜含量为0.37％,锌含量为0.39％,PC-SOD原液的铜含量为0.35％,锌含量为0.36％;SOD原液的SDS-PAGE测定纯度为＞99％,RP-HPLC法测定纯度为99.22％,PC-SOD原液的RP-HPLC法测定纯度为98.75％,SEC-HPLC法测定纯度为99.71％;外源性DNA残留量为每剂6.498 ng;其他各项指标均应符合《人用重组DNA制品质量控制技术指导原则》和2010版《中国药典》(三部)的要求.结论:初步建立了PC-SOD的质控方法,并已用于该制品的质量控制,同时为其他类型磷脂化修饰生物技术药物的质量控制提供参考.
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重组人源化抗TNF-α单抗WLB303猴重复给药毒性试验血清中和抗体确证方法的建立
目的:建立一种快速、灵敏、高效和易操作的方法,用于检测重组人源化抗TNF-α单抗WLB303猴重复给药毒性试验血清中产生的中和抗体.方法:对食蟹猴静脉输注WLB303,连续给药4周.采取给药期和恢复期不同时间的血清,随后采用桥式酶联免疫吸附法对血清中的抗药抗体进行定性筛选,对筛选为阳性的血清样本进行预处理,然后以WLB303生物学活性测定法为基础的中和反应法对中和抗体进行确证.结果:建立了WLB303中和抗体的确证方法,确定了检测的临界点.确证方法的检出率为100％,在血清中检测到具有中和活性的抗体,中和抗体的中和作用强度总体与给药时间、给药剂量呈正相关.结论:建立的检测方法能够直接体现出剂量差异性和个体差异性,也能反映中和抗体的滴度差别.该方法的特异性、灵敏度和有效性能够满足试验要求,可以用于单抗药物重复给药动物毒性试验血清中和抗体的检测.
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PCSK9单抗生物学活性测定方法的建立
目的:建立前蛋白转化酶枯草溶菌素9(PCSK9)单抗的生物学活性检测方法.方法:利用系列稀释的PCSK9单抗以剂量依赖性方式阻断PCSK9与低密度脂蛋白受体(LDLR)结合,增加低密度脂蛋白(LDL)在HepG2细胞内摄取率,通过BODIPY类荧光染料标记低密度脂蛋白(BODIPY-LDL)检测胞内荧光强度来反映PCSK9单抗的生物学活性,并用PCSK9单抗参比品计算供试品相对百分效价.结果:PCSK9、PC-SK9单抗参比品及供试品在该方法中均存在量效关系,且符合四参数方程式:Y=(A-D)/[1+(X/C)B]+D.利用该法对4批PCSK9单抗供试品进行检测,每批供试品重复试验3次,PCSK9单抗的相对百分效价的平均值在94.25％ ～ 110.77％之间,变异系数均小于15％.结论:该方法灵敏度高、重复性好、结果准确,可作为PCSK9单抗生物学活性测定的常规检测方法.
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抗白介素-1β单克隆抗体生物学活性检测方法的建立
目的:建立抗白介素-1β单克隆抗体(抗IL-1 β单抗)的生物学活性检测方法.方法:利用HEK293-NF-κb-luc细胞系,通过荧光素酶检测系统(Steady-Glo(R) Luciferase Assay System)进行抗IL-1β单抗的生物学活性检测,以抗IL-1 β单抗参比品通过平行线分析的方法计算供试品相对效价,并对该方法进行精密性和准确性验证.结果:抗IL-1 β单抗供试品及参比品该方法中均存在量效关系,在半对数坐标纸上呈平行的直线分布.5批抗IL-1β单抗成品经3次测定,相对效价平均值在(84.57±3.46)％ ～ (101.93±7.56)％之间,变异系数均小于10％.2批回收率样品经3次测定,回收率分别为(113.00±15.32)％和(108.53±23.51)％.结论:已成功建立抗IL-1β单抗生物学活性检测方法,该方法重复性好,准确性高,可作为抗IL-1β单抗生物学活性的常规检测方法.
关键词： 抗IL-1β单克隆抗体 生物学活性 荧光素酶检测系统 -
戊二酰亚胺类抗生素S632新研究进展
戊二酰亚胺类抗生素是由链霉菌产生的一类结构中含有酰亚胺环、具有多种生物学活性的微生物产物.近年来发现戊二酰亚胺类新抗生素S632具有显著的抗病毒、抗肿瘤、保护神经元等多种生物学活性,表明该类抗生素具有重要的理论研究价值和开发应用前景.文中从以下几个方面综述了抗生素S632的新研究现状及进展,包括分子结构与理化性质、含量测定方法及内控质量标准、多种生物学活性(抗病毒、抗肿瘤、神经元保护作用、炎症反应的抑制作用),同时对S632的构效关系及其作用机制也进行了探讨.
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重组人淋巴毒素α衍生物活性测定国家标准品的研制
目的:建立重组人淋巴毒素α衍生物(rhLT α)生物学活性测定用国家标准品.方法:标准品按WHO重组细胞因子要求制备、检测,采用L929细胞毒法测定rhLT α的生物学活性,并以NBSB提供的国际标准品为标准,由2家实验室对rhITα国家标准品的效价进行协作标定.结果:rhLT α国家标准品经检定各项指标均符合要求,效价协作标定结果经统计学分析,均数的95%可信区间为4.21×104～4.52×104IU/支,单次测定的95%标准值范围为3.07×104～6.19×104IU/支.这批国家标准品效价确定为4.40×104IU/支.加速热稳定性实验表明活性在-20℃,4℃,25℃条件下20个月保持稳定.结论:该批rhLTα经协作标定,质量可靠,效价稳定,可作国家标准品使用.
关键词： 重组人淋巴毒素α衍生物 生物学活性 标准化 -
重组CTLA4-Fc融合蛋白的质量研究
目的 建立重组细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA4)-Fc融合蛋白的质控方法.方法 应用基于CTLA4/IL-2-Luciferace/Jurkat细胞(简称Jurkat细胞)的报告基因法检测重组CTLA4-Fc融合蛋白的生物学活性;表面等离子体共振(surface plasmon resonance,SPR)测定重组CTLA4-Fc融合蛋白与B7的结合活性测定法;分子排阻高效液相色谱(size exclusion high performance liquid chromatography,SEC-HPLC)、毛细管凝胶电泳(capillary electrophoresis sodium dodecyl sulfate,CE-SDS)进行纯度分析;等电聚焦电泳(isoelectric focusing,IEF)进行电荷异质性分析;肽图法和毛细管胶束电动色谱(micellar electrokinetic chromatography,MEKC)进行鉴别试验;反相高效液相色谱(reversed phase-high performance liquid chromatography,RP-HPLC)进行唾液酸含量测定;亲水高效液相色谱(hydrophilic high performance liquid chromatography,HILIC-HPLC)进行N糖型含量测定等,对重组CTLA4-Fc融合蛋白进行了质量研究.结果 重组CTLA4-Fc融合蛋白的生物学活性EC50值为(0.40±.0.08) μg· mL-1,RSD为20.00％;BIAcore测定与B7相对结合活性为参比品的(91.72±0.12)％,RSD为0.14％;SEC-HPLC分析的纯度为(99.09±0.01)％,RSD为0.01％;还原CE-SDS分析的纯度为(100.00±0.00)％,非还原CE-SDS单体为(98.50±0.17)％,RSD为0.18％;IEF等电点主区带pI范围为4.6 ～5.9;肽图法中供试品与参比品一致;MEKC可对重组CTLA4-Fc融合蛋白及其变体进行有效鉴别;唾液酸含量为(10.16±0.41) mol/mol蛋白,RSD为4.07％;N糖主要糖型的含量:G0F含量为7.5％,G1F含量为15.0％,G2F含量为17.1％,G1FS1含量为4.2％,G2FS1含量为19.5％,G2 FS2含量为9.6％.结论 建立了重组CTLA4-Fc融合蛋白的关键质量属性评价方法,上述方法为抗体融合蛋白类生物制品的质量控制提供参考.
关键词： 融合蛋白 细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4 质量控制 生物学活性 -
帕尼单抗中二硫键异构体的鉴定及生物活性分析
目的 帕尼单抗是一种IgG2亚类抗体,已用于转移性结肠癌的临床治疗.然而尚没有研究对帕尼单抗中二硫键异构体的构成和活性进行分析鉴定.本实验将建立对帕尼单抗二硫键异构体鉴定并富集的方法,进一步分析异构体间的生物学活性差异.方法 利用反相色谱分析帕尼单抗中二硫键异构体的构成;通过氧化还原处理富集A型和B型,并利用分子筛色谱对分离得到的异构体进行分析鉴定;进一步利用细胞杀伤实验对异构体的生物学活性进行评估.结果 反相色谱结果表明,帕尼单抗中A型、B型和A/B型比例分别为38％、32％及30％;分子筛色谱结果显示A型的分子半径较之B型更大;细胞杀伤实验表明帕尼单抗的A型具有较B型更强的抑制肿瘤生长效能.结论 本实验建立了对帕尼单抗二硫键异构体进行鉴定、富集及分析的方法,有助于进一步增进对IgG2亚类二硫键异构体结构和功能的理解,为IgG2亚类治疗性抗体的生产工艺优化和质量控制提供有益参考.
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大蒜提取单体化合物生物学功能的研究进展
目的 介绍从大蒜中提取的单体化合物的主要生物学功能的研究进展.方法 查阅国外及国内近年来的相关文献,并进行分析和综述.结果 与结论 从大蒜中提取的各单体化舍物具有抗病原微生物、抗肿瘤、治疗心脑血管疾病、抗氧化、保护神经组织、抗肥胖、调节血糖、延缓衰老等广泛的生物学功能,值得深入研究.
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吸入性的皮质激素对儿童身高增长的影响
皮质激素是一种有效的治疗过敏性鼻炎、哮喘的药物.由于口服皮质激素会引起严重的全身不良反应,而皮质激素气雾剂可使药物在局部发挥治疗作用,使全身生物学活性低,故可取代口服给药途径.目前,不断有新的可吸入的皮质激素研发成功和上市,包括经鼻吸入的和经口吸入的,但是这类药物应用于儿童患者的安全性,尚存在争论.本文将近年来关于可吸入的皮质激素气雾剂对儿童身高增长的影响的研究作一综述.
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重组人粒细胞刺激因子测活方法中几种常见显色方法的对比分析
目的 分析重组人粒细胞刺激因子生物学活性检测中,以NFS-60细胞为测活基础的几种常见显色/裂解/检测方法,所得检测结果是否一致.方法 应用NFS-60细胞/MTT染色法、NFS-60细胞/MTS染色法、NFS-60细胞/CCK-8染色法、NFS-60细胞/化学发光法等检测重组人粒细胞刺激因子生物学活性,并对结果进行统计分析.统计分析了NFS-60细胞/MTT法双波长(570 nm检测,630 nm参比)、单波长(570 nm检测和630 nm检测)结果.分析比较了NFS-60细胞/MTS动态检测法、NFS-60细胞/CCK-8动态法检测结果.结果 各生物学活性检测方法的检测结果差别不显著(P＞0.05);NFS-60/MTT法双波长、单波长检测结果差别不显著(P＞0.05).NFS-60细胞/MTS动态检测法、NFS-60细胞/CCK-8动态法与NFS-60细胞/MTT染色法检测结果间差别不显著(P＞0.05).结论 以NFS-60细胞为测活基础的几种常见的显色/裂解/检测方法,所得检测结果一致,为各实验室(应用不同显色/裂解/检测方法)给出的数据是否可以综合利用提供依据,为2015年版《中国药典》中重组人粒细胞刺激因子生物学活性检测方法的扩充提供支持,也为其他细胞因子生物学活性检测方法的扩充提供借鉴.
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肝硬化并发自发性细菌性腹膜炎患者腹水中TNF-α及IL-6的测定及其意义
肝硬化易并发自发性细菌性腹膜(spontaneous bacterial peritonitis,SBP),如不及时治疗,病死率高达48%～95%[1].本病的临床表现、腹水检查很不典型,故其诊断十分困难.肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor-α,TNF-α),白细胞介-6(interleukin-6,IL-6)具有多种生物学活性,在炎症反应方面亦有重要作用[2],感染的早期即有增高.我们研究的目的旨在探讨其在肝硬化并发SBP时腹水中的变化及其对诊断、治疗的意义.
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直接凝血酶抑制剂及其临床应用
直接凝血酶抑制剂是新兴的抗凝剂,它能抑制凝血酶,也可抑制凝血酶介导的因子Ⅴ、Ⅷ、,纤维蛋白原及血小板的活性.它不仅有抗凝血功能,还具有抑制血小板聚集以及抗炎等作用.直接凝血酶抑制剂在临床上常用于急性冠状动脉综合征、经皮冠状动脉介入术、心房颤动、静脉血栓栓塞、肝素诱导的血小板减少、缺血性脑血管病和周围动脉闭塞性疾病等的预防和治疗.本文从直接凝血酶抑制剂的生物活性、临床应用及安全性等几个方面进行概述.
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乳牛胎盘肽的制备及性状研究
通过对牛胎盘肽的理化特、生物学活性及安全性检定,特别是与胸腺肽成分的比较结果,肽和氨基酸是主要的组成成分.其中是携有调节机体免疫功能的信息的,而多种氨基酸也是人体所必需的.牛胎盘的综合利用大有可为前景看好.
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干扰素在血液系统疾病中的应用
干扰素是细胞受病毒感染后(或其他物质刺激后)释放出来的一种糖蛋白,其分子量为20000～30000,也可高至90000.具有抗病毒和激活机体免疫系统的作用.干扰素分为Ⅰ型和Ⅱ型.它是一类在同种细胞上具有广谱抗病毒活性的蛋白,其活性的发挥又受细胞基因组的调节和控制,涉及到RNA和蛋白质的合成.目前已用于临床的干扰素按生物学活性和抗原活性分为三类:干扰素α是由病毒诱导白细胞而产生,干扰素β是由病毒诱导纤维母细胞而产生,干扰素γ是由病毒诱导淋巴样细胞而产生.干扰素α和干扰素β具有共同的表面受体,作用基本一致,属于Ⅰ型;干扰素γ和干扰素α有不同的受体表面,属Ⅱ型,其在实验中抑制肿瘤的作用比Ⅰ型强.
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肝细胞癌患者接受快速移植治疗生存率低
这项引人关注的UNOS数据稳健性分析结果显示，那些肝移植候选名单上等待时间较久的肝细胞癌患者预后普遍优于那些等待时间较短的患者。
由此，有人或许会得出结论，局部过渡治疗或可影响肿瘤生物学活性，而那些等待时间较久的患者接受了更多的局部治疗。另外一种可能的假说是，如果患者肿瘤具有侵袭性生物学特征，则不太可能从短期候选名单上除名，因此，进行快速移植治疗患者多伴有侵袭性生物学特征。 -
核因子-κB在胰腺疾病中的研究进展
核因子-κ B(nuclear factor-κ B,NF-κ B)是一类能与多种基因启动子κ B位点发生特异性结合并促进转录的DNA结合蛋白的总称,其具有广泛的生物学活性.NF-κ B激活后通过控制细胞因子、黏附分子、趋化因子等多种基因的表达,参与机体炎性反应、免疫反应及肿瘤的发生、发展等许多生物进程[1].本研究就NF-κ B在胰腺疾病中的研究进展综述如下.
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干扰素在血液系统恶性肿瘤的治疗价值
干扰素是50年代后期被发现的一种具有干扰病毒增殖活性的因子,现已证实干扰素至少存在着5种类型,即干扰素α,β,γ,δ,ω.干扰素具有多种生物学活性,能够调节细胞功能、病毒复制、细胞分化、生长抑制和免疫功能等.其中,对干扰素α的研究较多,它不仅具有抗病毒作用,而且还具有抗肿瘤和免疫调节作用.通过重组DNA技术生产出多种基因来源的重组干扰素α,为其广泛应用提供了可能性.本文将重点介绍干扰素α治疗血液系统恶性肿瘤的临床应用.
