SARS冠状病毒核衣壳(N)蛋白不同区域的原核表达

利用大肠杆菌表达系统对SARS冠状病毒的核衣壳(N)蛋白全长及N末端或/和C末端缺失突变体进行了表达,共表达了39个重组蛋白,表达量在15%～30%之间.分别利用电洗脱或金属鳌合介质纯化重组蛋白,用蛋白印迹实验检测纯化蛋白对SARS病人恢复期血清的反应性,结果发现全长N蛋白活性好,其余的末端缺失蛋白均无法达到同一活性水平.由此说明N蛋白的完整性对于其优势表位的充分暴露是必要的.

牙鲆淋巴囊肿病毒中国株(LCDV-C)羟类固醇脱氢酶基因的特征分析

属于虹彩病毒科的淋巴囊肿病毒(Lymphocystis disease virus,LCDV)是一类能引起全球各地上百种淡、海水鱼产生囊肿的病原.在新分离到淋巴囊肿病毒中国株(Lymphocystis disease virus isolate from China,LCDV-C)并完成序列测定的基础上,用计算机辅助分析了LCDV-C羟类固醇脱氢酶(hydroxysteroid dehvdrogenase,HSD)基因结构特征,LCDV-C HSD读码框为1 023bp,推导其编码含340个氨基酸、分子量约为39.3kD的蛋白质.对来自10个不同病毒株或物种的HSD蛋白序列进行的比较分析显示,LCDV-C与淋巴囊肿病毒代表株(LCDV-1)的HSD氨基酸同源性高,为60.5%.对LCDV-C HSD的二级结构进行了预测,有亲水区5个,抗原区、α螺旋区和β折叠区各有6个.经密度排列界面(dense alignment surface,DAS)的方法预测,表明LCDV-C HSD有一个跨膜结构域.

荧光素标记检测乙型肝炎病毒表面抗原特异性T淋巴细胞方法的探讨

用绿色荧光前体化合物Calcein AM标记靶细胞,经过与杀伤性T淋巴细胞(CTL)效应细胞数小时的孵育,通过分析培养上清中的荧光强度检测CTL效应.通过对一系列标记条件的研究:不同浓度Calcein AM标记靶细胞、不同洗涤缓冲液、不同标记细胞浓度、不同洗涤次数、不同裂解液配方,确定CalceinAM荧光素标记法的佳条件.用该方法检测乙型肝炎病毒表面抗原的DNA疫苗免疫Balb/c小鼠对P815S细胞的CTL效应,E/T比为10时,杀伤效率接近饱和,达到65%.通过荧光显微镜直接观察杀伤后的P815S细胞,细胞破裂程度与计算出的杀伤效率有一定相关性.

脊髓灰质炎病毒减毒株Sabin 3经型间嵌合在人胚肺二倍体细胞(KMB17)上的适应性研究

为筛选Sabin 3型人胚肺二倍体细胞新适应株,将原来在体外培养过程中对KMB17细胞适应较差的Sabin 3型病毒与适应较好的Sabin 1型病毒混合培养11代,经噬斑筛选81个克隆后,感染性滴度检测表明,大部分筛选的克隆感染性滴度较低,仅33号克隆滴度高,达8.125 LgCCID50/ml.经全基因序列分析发现,该克隆(Sabin 3-33)为Sabin 1型和Sabin 3型的型间嵌合株,其中5'NCR为Sabin 1型,其余区域与Sabin 3型相同.经型别鉴定为Sabin 3型,与毒力直接相关的位点5'NCR的第480位核苷酸及位于VP2的第2 034位核苷酸都未发生变异,表明已初步获得一株人胚肺二倍体细胞KMB17的新适应株.

猪瘟病毒囊膜糖蛋白E2中和表位的定位及其免疫反应性分析

猪瘟病毒(CSFV)囊膜结构糖蛋白E2(gp55)是激发保护性免疫应答的主要抗原蛋白.Ems和E2与细胞表面受体的相互作用介导病毒对细胞的感染过程.采用抗CSFV中和性单克隆抗体c24/10,淘选噬菌体展示的12肽随机肽库,结合噬菌体拟位免疫反应性分析结果,对CSFV E2蛋白中和表位进行定位.结果表明:E2蛋白的SPTTLR基序(832～837位氨基酸)构成CSFV特异性线性中和表位,基序的第一、二、三位氨基酸是表位与单克隆抗体c24/10结合所必需的氨基酸,也是表位的关键性氨基酸.

我国新分离ECHO30病毒VP1序列分析

测定了引起2003年苏北地区无菌性脑膜炎暴发流行的病因病毒FDJS03分离株的VP1基因序列,并与国外同型流行毒株做比较,以了解本流行株的分子生物学特点及遗传变异规律.随机选取FDJS03分离毒株中的4株,用肠道病毒VP1序列的特异性引物008/011进行RT-PCR,扩增产物经凝胶纯化后测序.将序列输入GenBank,用BLAST程序进行核苷酸和氨基酸序列比对;选取32株不同地区不同年代的ECHO30分离毒株,在PHYLIP3.573c和TREE-PUZZLE5.0中构建进化树,比较它们完整VP1序列(876nt)的进化关系.核苷酸和氨基酸同源性比较结果证明:4株分离病毒均为ECHO30.进化树分析显示:本次FDJS03分离株与欧美20世纪70、80年代流行株亲缘关系近,但自成一簇,与国外毒株仍然有地区差别.ECHO30的VP1基因进化有时间效应,但存在地区差异.本次流行的病原可能是单一基因型的ECHO30病毒.

HHV6感染激活卡波济肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)的溶解性周期复制

运用细胞融合、细胞混合培养、条件培养基培养和病毒直接刺激等方法,研究人类疱疹病毒6型(HHV6)对卡波济肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)溶解性周期复制的影响.①将HHV6感染的JJhan细胞(T淋巴细胞系)与BCBL1细胞(原发性渗出性淋巴瘤,PEL)进行细胞融合形成异核体细胞.②将HHV6感染的JJhan细胞与BCBL-1细胞进行混合培养.③收集HHV6感染的JJhan细胞培养上清液作为条件培养基进行灭活处理,以灭活前后的条件培养基培养BCBL-1细胞.进一步离心纯化HHV6病毒颗粒,并感染BCBL-1细胞,分别设紫外线和热灭活的HHV6病毒颗粒感染BCBL-1细胞为对照.提取上述的实验细胞总RNA,RT-PCR和/或实时定量(Real-time)PCR检测卡波济肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)次要衣壳蛋白编码基因ORF26 mRNA转录.结果显示:①细胞融合后15h开始出现明显细胞病变,RT-PCR检测不同时间的实验组ORF26 mRNA转录水平均明显高于对照组;Real-time PCR检测各时间ORF26 mRNA转录水平是对照组的2.3倍以上;②细胞混合培养72h时,实验组ORF26 mRNA转录水平是对照组的1.8倍;混合培养5天时,实验组KSHV裂解周期蛋白K8.1表达水平是对照组的2.46倍;③灭活前后的HHV6感染细胞培养上清液培养BCBL-1细胞96h时,ORF26 mRNA转录水平分别是对照组的2.73倍和2.22倍;④灭活前后的HHV6均可增强BCBL-1细胞中KSHV ORF26 mRNA转录水平.提示:HHV6感染可激活KSHV的溶解性周期复制.

CMV抑制PVYN CP基因沉默及其介导的抗病性

以前曾报道用RNA介导的抗病毒策略,获得了高度抗病的表达马铃薯Y病毒坏死株系外壳蛋白基因(PVyNCP)的转基因烟草,并对T1、T2代转基因植株进行了遗传和抗病性分析[1].此次以T3代转基因植株为试验材料,在筛选高度抗病植株并证明其抗病性是基于转基因沉默的基础上,采用Northern杂交的方法,证明CMV侵染抑制了转基因植株中PVYNCP基因的沉默,而且CMV对PVYNCP基因沉默的抑制部位是发生在接种后的新生叶上,接种叶及其下部叶片中PVyN CP基因沉默则未受到影响.采用ELISA方法对CMV+PVyN复合接种的转基因植株进行PVyN检测,结果表明,接种叶及下部叶没有检测到PVyN,植株叶片对PVyN表现为抗病.而在CMV接种后植株新生叶中则检测出了高滴度的PVYN,植株叶片对PVYN表现为感病.该文报道了在表达PVYNCP基因的RNA介导抗性转基因植株中,异源病毒侵染抑制了转基因的沉默,并导致转基因植株的抗病性丧失.

一起传染病暴发中肠道病毒血清型鉴定和ECHO30基因特征分析

2003年5～9月,山东省泰安市发生了由肠道病毒(Enterovirus,EV)感染所致的传染病暴发,临床症状以手足口病(HFMD)为主,同时有心肌炎和无菌性脑膜炎等中枢神经系统症状患者也占较大比例.131份病人(粪便、咽拭子、脑脊液)标本中共分离到EV 62株,其中ECHO19 39株,EV71 6株,ECHO30 4株,其它肠道病毒13株.4株ECHO30病毒中的2株分离自2个患者的粪便标本,但用WHO肠道组合血清中和试验未能定出型别.另外2株分离自同一患者的粪便和脑脊液标本.病原学分析表明,ECHO30是引起该患者无菌性脑膜炎的病原.抗E-CHO30标准株的血清中和这4株病毒的滴度低于标准株5～20倍.VP1区全基因序列测定和同源性比较分析表明,4株ECHO30分离株病毒核苷酸同源性在98.0%～98.5%,氨基酸同源性在98.9%～99.3%,提示这4株病毒来源于同一传播链,2003年5～9月ECHO30在该地区可能有局部流行.系统进化树分析表明,ECHO30病毒可以划分为6个基因型,其中基因型1～5为GenBank中已发表的ECHO30分离株,山东分离株与其它5个基因型成员核苷酸差异分别在9.4%～24.4%,在进化树上形成了较独立的分支,是一个新基因型,将其划分为第6基因型.

口蹄疫病毒O/NY00株基因组L片段的克隆及其基因特征

采用RT-PCR方法对口蹄疫病毒O/NY00株基因组L片段进行了分子克隆和序列测定.结果表明:获得的O/NY00株基因组L片段长7 805nt,其中包括715nt的5'非编码区和6 999nt的多聚蛋白编码区.将O/NY00株与其它参考毒株进行序列比较,结果显示:O/NY00株与O/SKR/2000、O/UKG/3/2001遗传关系近,而与其它毒株遗传关系较远,属于O型口蹄疫ME-SA拓扑型PanAsia株的成员.与Cathay拓扑型的代表毒株O/TAW/97比较,两者在主要抗原位点1和位点3呈现出明显的以拓扑型为特征的氨基酸差别,提示两拓扑型毒株之间有较高的抗原差异.

正链RNA病毒起始RNA合成分子机制的研究进展

正链RNA病毒大多是人类和动植物的重要病原体,如脊髓灰质炎病(PV)、口蹄疫病毒(FMDV)、丙型肝炎病毒(HCV)、登革热病毒(DEV)、西尼罗河病毒(WNV)以及严重急性呼吸综合症病毒(SARS)等,都给人类的健康以及动植物的生长带来严重危害,造成巨大的经济损失.

TLR3免疫识别dsRNA病毒的分子机制

1984年,果蝇的Toll样蛋白被发现[1].13年后,人们发现了第一个与果蝇Toll蛋白同源的人Toll样受体(toll like receptor,TLR)蛋白(hTLR4)[2].迄今,已有10种TLR蛋白(即hTLR1～10)被发现,它们代表了一类保守的受体家族,分别识别不同的抗原.

柯萨奇病毒致病毒性心肌炎的细胞凋亡研究

病毒性心肌炎是心血管系统的常见病与多发病.对病毒引起的心肌细胞病理改变及机制的探讨一直是该领域的研究热点[1].自从科学家报道"凋亡"这种细胞死亡形式以来,为病毒性疾病研究者找到了一条新的研究途径[2].

宠物鸟H3N8亚型流行性感冒病毒NA基因分子特征性分析

虽然流行性感冒(流感)病毒的自然宿主是野生水禽类,作为宠物的雀形目鸟(Passeriformes)不代表流感病毒主要储存库[1-4,6,7],但Stallknecht和Shane 1988年对21 318份鸟的样品分析后发现,雀形目鸟中流感病毒的分离率占2.9%,表明雀形目鸟在流感病毒储存库中起着一定的作用.

北京国际轮状病毒疫苗研讨会会议简介