病毒学报杂志
Chinese Journal of Virology 병독학보
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基于颜色判定的环介导等温扩增技术检测HPV6和HPV16
建立了一种基于颜色判定的简单、快速和灵敏的检测方法,即环介导等温核酸扩增技术(LAMP)应用于HPV6和HPV16亚型的检测.该技术设计分别对应于HPV6和16的E6和E7基因序列中6个区段的4条特异引物,在等温条件下(63℃)进行核酸扩增反应1h,在扩增前加入HNB染料(羟基萘酚蓝)作为反应指示剂,以HNB染料颜色的变化做为结果判定的标准,并经LA-320实时浊度仪和琼脂糖电泳证实.文中利用这种技术对13份已知的单重感染13种HPV不同亚型的临床样本进行了特异性分析,同时对2个含目的片段的克降质粒的系列稀释物进行了灵敏度分析.结果显示LAMP方法特异性高,颜色法判断的灵敏度均为1000个拷贝DNA分子水平.比Real-time PCR低10～20倍,对62份宫颈刮片临床标本的HPV6和HPV16检出率和HPV分型试剂盒一致.因此,基于颜色判定的环介导等温扩增方法有望应用于人乳头瘤病毒HPV6和HPV16感染的快速筛选,具有在基层疾病预防控制中心和医院推广和应用的潜力.
关键词： 等温扩增 人乳头瘤病毒(HPV) -
中国新疆维吾尔自治区不明因为发热人群中Tahyna病毒感染状况调查
本研究通过对新疆地区不明因为发热人群血清Talayna病毒抗体进行检测,以了解Tahyna病毒在当地的感染状况及分布特征.通过间接免疫荧光方法对新疆维吾尔自治区南部喀什地区、北部伊犁地区742例不明因为发热患者急性期血清标本进行Tahyna病毒抗体检测.并对IgM抗体阳性标本平行进行Tahyna病毒、Snowshoe hare病毒和Inkoo病毒三种抗原性相似的布尼亚病毒的蚀斑减少中和试验.研究结果显示新疆南部喀什地区采集不明因为发热患者急性期血清中,IgM抗体阳性率5.3%,IgG抗体阳性率18.3%;新疆北部伊犁地区采集的急性期患者血清标本中并未发现TAHV IgM抗体阳性;蚀斑减少中和试验结果显示,TAHV IgM抗体阳性患者血清中Tahyna病毒中和抗体滴度较其它两种布尼亚病毒中和抗体滴度升高明显.本研究证实新疆南部地区不明因为发热人群存在Tahyna病毒的急性感染和既往感染,为相关疾病的进一步监测提供基础.
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环境水体中GⅡ型诺如病毒浓缩研究
自行设计一种适合野外现场采样的病毒采集浓缩仪,采用一种新型阳离子膜NanoCeram,进行环境水体中GⅡ型诺如病毒浓缩研究.通过预实验,考察了预处理膜、不同的二次浓缩方法、不同洗脱液对病毒回收率的影响,随后优化整个浓缩过程并确定佳的病毒浓缩方法.结果显示,预处理膜对病毒回收影响较大,PEG-NaCl沉淀、硅藻土吸附这两种二次浓缩方法的效果相当.选择0.15mol/L Na2HPO4作为硅藻土洗脱液.确定了NanoCeram阳离子膜的病毒回收率为3.02%.后对北京市丰台区洋桥生活污水进行现场采样,成功检测到GⅡ型诺如病毒,证明该方法有效可行,适合于环境水体中诺如病毒的浓缩分离和检测.
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应用ELISPOT方法筛选确定HIV-1B'/C亚型疫苗六种抗原的H-2d限制的T细胞表位
为了筛选和确定用于检测表达HIV-1B'/C亚型病毒6种抗原(gp160、gag、pol、rev、tat和nef)的艾滋病疫苗免疫小鼠后H-2d限制的特异性T细胞表位,本研究使用表达上述6种抗原的复制型DNA疫苗和非复制型重组痘苗病毒疫苗联合免疫BALB/C小鼠,通过矩阵设计将HIV-1 B(C)亚型6种相应抗原全序列肽库分别混合成肽池,使用肽池对免疫小鼠进行IFN-γ ELISPOT检测,根据检测结果确定肽库中特异反应的优势表位肽.结果显示:筛选到七条针对Gag的特异表位肽,其中有5条与文献报道相同,另2条为新表位肽;筛选到3条针对Pol蛋白特异表位肽,其中一条为新表位肽;筛选到2条针对gpl60特异表位肽,其中一条为新表位肽;在Nef肽库中筛选到一条新的表位肽;从Tat肽库中筛选到3条表位肽.这三条肽在肽库中是连续的序列,都包含(或部分包含)网上公布的表位序列;在Rev肽库中没有筛选到能够产生阳性反应的特异性表位肽.本研究使用IFN-γ ELISPOT方法筛选和确定了可用于检测表达HIV-1 B/C亚型病毒6种抗原(gp160、gag、pol、rev、tat和nef)的艾滋病疫苗免疫小鼠后H-2d限制的特异性T细胞表位.
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MCMV感染同种异型皮肤移植小鼠结肠炎模型的建立
利用小鼠巨细胞病毒(Murine cytomegalovirus,MCMV)感染同种异型皮肤移植小鼠,建立MCMV感染结肠炎症模型,从而为研究人类肠道疾病提供可靠的动物模型.采用鼻腔接种的方式感染同种异型皮肤移植的小鼠.①供体:C57BL/6雌鼠,18只;受体:BAL,B/c雌鼠,72只,鼠龄4～6周,体重14～20g/只;将C57BL/6小鼠的背部皮肤移植到BALB/c小鼠背部的移植床上,术后给BALB/c小鼠腹腔注射环孢素连续2周(12mg/kg.d).②将移植后小鼠随机分组.每组24只,按接种病毒接种剂量分为10<'4>PFU组和10<'5>PFU组,同时设立阴性对照组,即鼻腔接种细胞悬液(1×10<'6>/mL).每日观察动物排便情况及体重等总体情况变化;分别于病毒接种后第5、9、14和第21d取得小鼠结肠组织,通过组织病理学检测、原位杂交、gB RT-PCR、pp65免疫组化以及透射电镜的方法,观察检测小鼠结肠组织中MCMV与其组织病理变化之间的关联性.结果:在10<'5>PFU组中,小鼠出现厌食、嗜睡、活动能力明显下降,且发现该组小鼠的体重下降.在本研究中我们检验感染后第14d小鼠的结肠组织,发现感染组小鼠的近端结肠组织中粘膜层均变薄,同时其结构也被破坏;感染组小鼠的远端结肠组织中均出现淋巴样滤泡和粘膜层结构异常,其中10<'6>PFU组小鼠的结肠粘膜层的破坏得更严重;pp65免疫组化检验结果为MCMV蛋白阳性;原位杂交结果显示结肠组织中MCMV IE1基因阳性,MCMV gB基因RT PCR检测结果为阳性;透射电镜观察可见疱疹样病毒颗粒.而阴性对照组上述检测指标均为阴性.结果表明,在同种异型皮肤移植后小鼠鼻腔接种MC-MV,小鼠结肠发生了类似于人类结肠炎的病理变化.该结肠炎动物模型的建立将为进一步研究HCMV感染结肠的发病机理以及药物干预建立一个极为重要的平台.
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中国西藏小反刍兽疫病毒China/Tib/Gei/07-30磷蛋白基因的分子特征及其编码蛋白特性分析
对我国西藏小反刍兽疫病毒野生株China/Tib/Gej/07-30进行磷蛋白基因序列测定,并进行分子生物学特征分析.首先应用逆转录聚合酶链式反应扩增出病毒磷蛋白基因片段,对聚合酶链式反应产物进行直接测序,然后对测定的核苷酸和推测的氨基酸序列进行比较分析.小反刍兽疫病毒china/Tib/Gej/07-30磷蛋白基因由1 655个核苷酸组成,编码2个相互交叠的开放阅读框(0RF).第一个ORF长度为1530个核苷酸.编码的P蛋白长度为509个氨基酸.第二个ORF长度为534个核苷酸,编码的C蛋白长度为177个氨基酸.第一个ORF通过基因编辑在751位插入1个G核苷酸,转录生成第二个mRNA,长度为897个核苷酸,编码的V蛋白长度为298个氨基酸.小反刍兽疫病毒China/Tib/Gej/07-30的P蛋白与其他分离株氨基酸序列同源性为86.1%～97.3%,C蛋白氨基酸序列相似性为84.3%～94.9%,V蛋白为82.9%～96.3%.China/Tm/Gej/07-30的P蛋白第315～387位氨基酸是一段高度保守的七肽重复序列.
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融合表达DEC205单链抗体和NS3蛋白的HCV DNA疫苗的免疫原性研究
为研发新型HCV DNA疫苗并探讨优化其免疫原性的策略,我们分析靶向树突状细胞(Dendritic cells,DC)的分子对HCV DNA疫苗免疫原性的影响.我们基于抗小鼠DC细胞表面分子DEC205/CD205的单克隆抗体DEC205的单链分子,构建可单独表达DEC205单链抗体或者与HCV非结构蛋白NS3融合表达的DNA表达质粒,并构建单独表达HCV非结构蛋白NS3的DNA表达质粒;经瞬时转染法鉴定HCV NS3及其与DEC205单链抗体融合蛋白的表达;随后采用注射结合电转的方式免疫Balb/C小鼠并研究各疫苗的体液(NS3特异性IgG抗体)与细胞免疫(IFN-γ ELISPOT)效果.结果表明:DEC205单链抗体基因与HCV NS3编码基因的融合可显著增强NS3特异的免疫应答;采用皮内注射加卡钳电极电转的方式可以产生强的NS3特异性抗体和T细胞免疫反应.因此,通过DEC205单链抗体与HCV DNA疫苗靶抗原融合可明显增强免疫应答效果.该策略为HCV及其他类似病原的新型DNA疫苗研制提供重要依据.
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马立克氏病病毒可感染鸡大脑小胶质细胞并促进其Toll样受体15和1LB基因的转录
体外培养雏鸡大脑神经胶质细胞并纯化得到小胶质细胞.分别用马立克氏病病毒(Marek's disease virus,MDV)广西超强毒力(vv)株YL040920和弱毒疫苗株CV1988/Rispens感染小胶质细胞,每日观察病毒感染后的细胞病变效应(CPE);用免疫组织化学法检测病毒感染后小胶质细胞中MDV MEQ蛋白的表达,并用荧光定量PCR(qPCR)以及qRT-PCR法分别检测MDV meq基因(meq-DNA)的复制以及gB基因mRNA(gB-mRNA)的转录水平.同时用qRT-PCR法检测MDV感染对小胶质细胞Toll样受体家族(TLRs)基因转录的影响.结果发现,YL040920株和CV1988/Rispens株病毒均能感染小胶质细胞,病变细胞呈多灶性脱落并形成空斑,随病变进展迅速增大并融合.可在MDV感染的小胶质细胞核内检测到MEQ蛋白,并在感染细胞中检测到meq-DNA的复制和gB-mRNA的转录.YL040920株感染的小胶质细胞中病毒载量和gB-mRNA的转录水平显著低于以相同病毒量CV1988/Rispens株感染的小胶质细胞中的相应量(P≤0.05/0.001).MDV感染可上调小胶质细胞TLR15和TLR1LB基因的转录水平.小胶质细胞中TLR15和TLR1LB mRNA的转录水平在YL040920感染1 d后升高,于3 dpi达到高值,到5 dpi时有所降低.检测到小胶质细胞中TLR1LB mRNA转录水平在CV1988/Rispens感染1 d后升高,到3 dpi时达高值;而TLR15 mRNA的转录水平在3 dpi后开始升高,二者在5 dpi时均降低.比较YL040920和CV1988/Rispens对TLRs mRNA转录的影响发现vvMDV YL040920感染小胶质细胞后主要促进其TLR15基因的转录(P≤0.01/0.001),而弱毒疫苗株CV1988/Rispens感染后主要促进TLR1LB基因的转录(P≤0.001).
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甲型流感病毒核蛋白在大肠杆菌中的可溶性高效表达与纯化
为了在大肠杆菌中高效表达甲型流感病毒A/京科/30/95(H3N2)核蛋白NP,以便对原核表达的NP蛋白进行免疫原性研究,本研究通过密码子优化及全基因合成等方法,将3种形式的NP基因:与6×His标签融合的NP基因NP(His)、非融合的野生型NP基因NPWt及非融合的按大肠杆菌优势密码子改造的基因NP(O)分别插入原核表达载体pET-30a,构建了表达3种形式NP基因的3种原核表达质粒并研究不同质粒中NP蛋白的表达形式、条件、纯化工艺及抗原性.限制性酶切反应与测序表明.三种形式的NP基因均正确插入原核表达质粒pET-30a;SDS-PAGE凝胶电泳显示.三种形式的NP基因均能在大肠杆菌中表达,NP(O)基因的表达量高;在不同温度诱导条件下,NP蛋白呈现可溶性表达,NP(O)基因可溶性高效表达的条件为:T＝25℃,t＝10 h;经阴离子交换和凝胶过滤层析两步纯化,可溶性表达的NP蛋白纯度可达90%;Western bIot检测显示.纯化的NP能与流感病毒A/PR/8/34(H1N1)株感染小鼠的血清发生特异性结合.这些结果表明,非融合表达的密码子优化甲型流感病毒NP蛋白能在大肠杆菌中高效表达和纯化,同时保持良好的免疫反应活性.
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表达绿色荧光蛋白的重组鸡传染性支气管炎病毒的构建
为探讨鸡传染性支气管炎病毒(IBV)作为载体表达外源基因的可行性,本研究根据IBV H120疫苗株的全基因组序列设计引物,采用RT-PCR方法分10个片段对其基因组进行扩增.并克隆至pMD19-T载体中;同时构建IBV基因组5a基因编码区被增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因替换的重组质粒.采用体外拼接策略,将Bsa Ⅰ酶切处理的10个基因片段顺序连接,构建5a基因编码区被EGFP基因替换的基因组全长cDNA,其5'端具有完整的T7 RNA聚合酶启动子核心序列,3'端具有polyA尾巴结构.然后通过T7 RNA聚合酶体外转录系统合成病毒基因组RNA.脂质体转染BHK-21细胞进行病毒拯救.结果表明成功的从基因组全长cDNA拯救出重组病毒H120-5a/EGFP株,其在鸡胚中能有效的复制和传代,并表达绿色荧光蛋白;5a基因的缺失并不影响病毒对鸡胚的致病性.本研究为进一步开展IBV的分子致病机理、载体疫苗等研究奠定了基础.
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EV71的受体研究进展
手足口病(Hand-foot-mouth disease,HFMD)是一种临床表现为手、足、口腔等部位的疱疹及中枢神经系统并发症的婴幼儿疾病,其病原体以柯萨奇病毒A16型(Coxsackievirus A16,CoxA16)和人肠道病毒71型(Human enterovirus 71,EV71)为常见[1].2008年中国卫生部将HFMD列人丙类传染病目录.近年来,引起手足口病的主要病原体为小RNA病毒科肠道病毒71型[2].自1969年EV71在美国加利福尼亚州手足口病疫情中首次报道后,该病毒已在世界范围内引起十余次手足口病暴发和流行,且死亡病例趋于增多[3].仅1998年中国台湾EV71大暴发中就出现129 000例病例,其中重症病例多达400个,死亡78例[4].
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甲型流感HIN1病毒抑制NK细胞杀伤效应及治疗策略展望
NK细胞是天然免疫系统的重要成员之一,在控制某些病毒感染与抗肿瘤中发挥着重要作用.根据表面标志表达水平的差异,将NK细胞分为CD56 bright和CD56dim两大亚群[1];此外根据NK细胞在免疫应答过程中功能的不同又将NK细胞分为辅助性NK细胞、调节性NK细胞、杀伤性NK细胞与抗原递呈NK细胞等[2].不需要抗原预先刺激,NK细胞即可杀伤病原体感染细胞或肿瘤细胞(主要为CD56him NK细胞);此外,NK细胞也可以通过分泌细胞因子而发挥免疫调节作用(主要为CD56 brightNK细胞)[1,3].
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分支状多抗原肽系统在疫苗研制中的应用
疫苗接种是预防和控制传染病流行的一种重要措施.常用的疫苗包括减毒活疫苗、灭活疫苗和亚单位疫苗.目前的亚单位疫苗多是采用重组DNA技术用微生物或哺乳动物细胞产生.但分子量较小的抗原很难用重组DNA技术制备,化学合成便成为较为简便的途径.合成肽疫苗是根据抗原的氨基酸序列设计的用化学方法合成的一种安全性很高的疫苗,但其分子量小、免疫原性弱并且仅针对单一的抗原表位,这使其应用受到限制.将合成肽疫苗与其它载体蛋白偶联虽然能提高前者免疫原性,但因为引人了无关蛋白,无法估计其对目标抗原肽结构的影响,所以效果仍不理想.
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8型腺相关病毒载体的特性及其在基因治疗中的应用
腺病毒相关病毒(Adeno-associated virus,AAV)载体是受关注的病毒载体之一.近年来从人类和灵长类动物中已发现100多个AAV病毒的血清型或变种[1].AAV血清型或变种的不断发现使AAV载体具有了更广阔的应用范围.在各种AAV载体中,8型腺相关病毒(AAV8 )因在肝脏等组织显示了高效稳定的基因转染而受到极大关注.目前,重组AAV8(Recombinant AAV8,rAAV8)已经广泛应用于遗传性疾病、肿瘤、自身免疫性疾病和抗病毒的基因治疗研究.本文就AAV8载体的特性及其在基因治疗中的应用作一综述.
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辽宁省流行性腮腺炎野病毒的分离与鉴定
本研究用Vero/Slam细胞首次从辽宁省2008年流行性腮腺炎暴发和散发患者的临床标本中分离到3株流行性腮腺炎野病毒(Mumps virus,MuV),应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)针对MuV分离株的包括SH基因的1028个核苷酸片段进行PCR扩增,将扩增产物连接在pMD19-T载体后转化到大肠杆菌中进行克隆.通过蓝白斑筛选,将鉴定为阳性的白色菌落进行核苷酸序列测定分析.将这3株MuV结合从GenBank下载的世界卫生组织(WHO)MuV基因型参考株在基于WHO基因定型靶序列SH基因的316核甘酸片段构建基因亲缘关系树,一起进行分子流行病学研究.结果提示:辽宁省2008年3株MuV分离株的核苷酸和氨基酸同源性在98.7%～100%和94.7%～100%之间,其中LN-2008-001-06与LN-2008-001-10序列完全一致;与F基因型参考株序列相比,核苷酸和氨基酸同源性分别为92.4%～96.2%和84.2%～94.7%.提示辽宁省2008年3株流行性腮腺炎野病毒分离株均属F基因型.由于此次毒株数量太少,尚不能说明F基因型是否为辽宁省的优势基因型,需进一步扩大范围加强监测.
| 年 | 期数 |
| 2018 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2017 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2016 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2015 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2014 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2013 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2012 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2011 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2010 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2009 | 01 02 03 04 05 06 z1 |
| 2008 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2007 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2006 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2005 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2004 | 01 02 03 04 |
| 2003 | 01 02 03 04 |
| 2002 | 01 02 03 04 |
| 2001 | 01 02 03 04 |
| 2000 | 01 02 03 04 |
| 1999 | 04 |
