环孢素A对膀胱癌细胞系FasL表达的调节及免疫学作用

目的探讨环孢素A(CSA)对膀胱癌BIU-87细胞表达FasL的调节作用 .方法 CSA分别与BIU-87和Jurkat T细胞共同培养,以MTT法检测2种细胞的存活数.再将CSA与BIU-87细胞和Jurkat T细胞共同培养,以免疫组化和免疫荧光流式细胞术检测BIU-87细胞FasL的表达;以FCM分析Jurkat T细胞的凋亡.结果 CSA ≤ 50 μg/mL时对两细胞系均无毒性作用(P>0.05);CSA作用后的BIU-87细胞FasL阳性表达百分率和平均荧光指数及 FasL介导 Jurkat T细胞凋亡百分率与对照组间有显著性差异(P <0.01).结论 CSA≤50 μg/mL时对BIU-87和Jurkat T细胞的活性和增殖无影响,但能使BIU-87细胞FasL的表达下调,阻止膀胱癌细胞对机体免疫的逃逸作用.

结核杆菌HSP65 DNA疫苗的初步研究

目的构建以结核分枝杆菌热休克蛋白65 000 u基因为基础的核酸疫苗.方法采用聚合酶链反应从结核杆菌H37Rv株基因中,扩增出HSP65的编码基因,经限制性核酸内切酶消化后, 插入真核表达载体pcDNA3.1(-) 的相应酶切位点,并将此重组质粒免疫动物.结果重组质粒的插入基因经序列测定证实为结核分枝杆菌HSP65.DNA免疫小鼠体内产生特异性抗体.结论以HSP65编码基因为基础的真核表达载体构建成功,并能引起特异性动物免疫反应,为进一步研究其在结核病防治中的作用奠定了基础.

MAGE-3基因的表达检测和重组MAGE抗原的制备及其应用

目的克隆MAGE-3基因并检测其在人食管癌组织中的表达情况;重组表达MAGE-1和MAGE-3抗原,用于食管癌的治疗性蛋白疫苗的免疫原性研究.方法 RT-PCR法检测了MAGE-3在人食管癌组织中的表达情况.采用DNA重组技术将MAGE-1和MAGE-3全长cDNA 克隆至pET30a(+)载体上,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,经SDS-PAGE 和 wes-tern blot鉴定后,制备其可溶性蛋白,研究其对人T细胞增殖能力的影响.结果 MAGE-3基因在食管癌组织中的表达率为50%(15/30);在30例相应癌旁正常组织中未见表达.成功获得了MAGE-1和MAGE-3可溶性蛋白;人 T细胞能够对自身抗原递呈细胞加工处理的MAGE-1和MAGE-3蛋白产生应答.结论 MAGE-1和MAGE-3蛋白可能是用于食管癌免疫治疗的免疫原性较强的靶抗原.

TLR4胞内区的同源模建

目的为进一步研究新发现的TLR4蛋白在LPS对机体细胞产生作用的机制,分析其Q结构上的功能区域.方法同源模建,通过计算机模拟从理论上对TLR4胞内区的功能区域进行探讨.结果 Pro712His突变体溶液可及表面的亲疏水性质有明显变化, 且相应位置所带的电荷从中性变为正电荷.结论 TLR4胞内区在发生作用时,起主要作用的是疏水性作用,下一个接头蛋白MyD88与TLR4胞内区相互作用的部位应当是一个有较强疏水作用的区域.这样当Pro712His突变体出现时,由于电荷的排斥,疏水作用无法达到点突变以前的强度,2个蛋白的结合不能得以实现,信号无法继续传递.从而出现对LPS的耐受现象.

抗HIV-1 gp41 合成多肽C34单抗的制备及生物学活性

目的制备针对C34和C46单抗, 并以此为工具研究gp41表位,进一步了解HIV-1包膜蛋白的作用机理和病毒的感染机制,为寻找新的治疗靶点提供抗体工具. 方法常规动物免疫、细胞融合、克隆化制备抗C34与C46的单克隆抗体,并鉴定其特异性位点,还用ELISA法、MTT法及荧光分子探针技术对单抗的生物学活性进行研究.结果获得了3株抗C34单克隆抗体、2株抗C46单抗.此5个单抗均与C34结合 , 并抑制N36肽与C34肽复合物的形成;其中效价高的1G1对H9/HIVⅢB细胞的生长有刺激作用 ,对H9/HIVⅢB细胞和MT-2细胞的融合无明显影响.结论得到5株可与C34反应,并可抑制C34与N36多肽结合的单抗, 其中1G1所识别的表位可能为增强性或刺激性表位.

雷公藤甲素对哮喘豚鼠肺内嗜酸性粒细胞IL-5等受体表达的影响

目的观察哮喘豚鼠支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage f luid,BALF)中不同密度嗜酸细胞 (Eos)上白介素-5受体α(IL-5Rα)、IL-3Rα、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子受体α (GM-CSFRα)及共同β链受体(βcR)mRNA表达及雷公藤甲素(TP)对它们的影响,探讨TP促进哮喘Eos凋亡的机制.方法健康豚鼠18只随机分为正常组、哮喘组、TP组.以卵蛋白致敏激发制作豚鼠哮喘模型,分离BALF中的低密度Eos(HEos)及正常密度Eos(NEos),TUNEL法检测细胞凋亡,原位杂交检测各受体mRNA表达,RT-PCR法检测Eos IL-5Rα、IL-3Rα相对含量.结果哮喘豚鼠Eos凋亡明显减少,而细胞数明显高于正常组.用TP 24 h后不同密度Eos数量明显低于哮喘组(P<0.01),以HEos下降为明显(P<0.05);TP组Eos凋亡明显高于哮喘组 (P<0.01).哮喘豚鼠Eos表达α受体mRNA明显低于正常组,而βcR表达明显增高;TP处理组Eos各α受体mRNA表达均明显增加,βcR表达明显下降.RT-PCR检测显示,TP组IL-5R α、IL-3Rα mRNA显著增加.结论哮喘Eos存在凋亡抑制;TP可通过促进IL-5、IL-3、GM-CSF受体各自α链表达,抑制这3种受体的共同β链表达,减少其生物学功能,促进Eos凋亡.

半乳糖神经酰胺脂质体对HIV-1感染性的影响

目的研究体外空白及包封抗HIV药物AZT和PFA 的GalCer脂质体对HIV-1复制的影响.方法通过HIV p24抗原测定、合胞体抑制实验、融合阻断实验和对HIV感染细胞的保护作用实验等,观察了空白GalCer脂质体、 AZT-GalCe r脂质体和PFA-GalCer脂质体对HIV-1复制的影响. 结果空白GalCer脂质体预处理细胞,能促进HIV-1感染CD4+ 细胞;空白GalCer脂质体预处理HIV-1,则抑制了病毒吸附和结合宿主细胞;GalCer脂质体还具有阻断HIV-1感染细胞与正常CD4+细胞间的融合作用;GalCer脂质体包封AZT或PFA不能显著提高药物体外抗HIV-1活性. 结论空白GalCer脂质体预处理细胞,能促进HIV-1感染性;预处理HIV-1,则抑制了病毒的感染.

抗P选择素免疫小鼠单链抗体噬菌体展示文库的构建和筛选

目的构建抗P-选择素的全套单链抗体噬菌体表面展示文库,从中筛选与P-选择素高亲合力的单链抗体,为其临床应用奠定基础.方法从P-选择素免疫的小鼠脾淋巴细胞中提取总RNA,反转录成cDNA后,用抗体可变区混合引物扩增全套轻、重链可变区基因,经重叠延伸反应,装配成单链抗体(ScFv) 基因,将其克隆到噬菌体载体pHEN1中,构建单链抗体噬菌体抗体库.对抗体库进行亲合筛选后, ELISA法鉴定抗活化血小板单链抗体.结果经过5轮"吸附-洗脱-扩增"的富集过程,phage-ELISA得到一个ELISA活性较高的与P-选择素结合的克隆.序列测定符合抗体可变区结构特点. 结论成功构建了全套抗P-选择素单链抗体噬菌体展示文库,并筛选得到具有P-选择素结合能力的单链抗体基因 .

树突状细胞负载肝癌可溶性抗原后的免疫应答

目的用负载肝癌可溶性抗原的DC诱导肝癌特异性T细胞.方法在体外用GM-CSF和IL-4诱导健康人外周血单核细胞,使其分化为高纯度树突状细胞(DC).用负载人肝癌细胞株SMMC-7721可溶性抗原的DC诱导自身淋巴细胞.结果诱导后淋巴细胞增殖指数大于1.5,表面CD56分子表达下降,CD3+ T / CD4+ T和CD3+ T / CD8+ T细胞比例增加,以CD3+ T / CD4+ T细胞比例增加为明显.CD4 / CD8比例由诱导前的0.84增加为1.04, 活化前后γδ+ T比例没有改变.活化后的淋巴细胞不但可杀伤SMMC-7721细胞,同时还可不同程度的杀伤其它3株肝癌细胞.另外,诱导7 d的DC可不同程度的抑制4株肝癌细胞和胃癌细胞.结论实验结果为肝癌DC疫苗的研究提供了理论基础.

人破骨细胞生成抑制因子在真核细胞中的表达

目的克隆人破骨细胞生成抑制因子(OPG/OCIF)编码区基因并在真核细胞中表达,为进一步研究OPG/OCIF的生理功能及探讨骨质疏松症等疾病的治疗奠定基础.[ HTH〗方法以人骨肉瘤细胞系MG63的mRNA为模板,采用RT-PCR法得到人OPG/OCIF 的编码区cDNA,构建真核表达载体并转染成肌细胞,应用核酸杂交及western blot法证实OP G/OCIF在真核细胞中表达.结果获得人破骨细胞生成抑制因子(OPG/OCI F) 编码区全长cDNA,经序列测定证实与文献报道的OPG/OCIF编码区基因的核苷酸序列完全一致 .成功构建OPG/OCIF真核表达载体pcDNA3-OPG.重组质粒转染小鼠成肌细胞C2C12,建立稳定转染OPG/OCIF编码区cDNA的细胞系,经核酸杂交及western blot法证实OPG/OCIF在真核细胞中表达.结论获得人破骨细胞生成抑制因子(OPG/OCIF)编码区全长cD NA并证实在真核细胞中表达,为OPG/OCIF进一步的功能研究奠定了基础.

乙肝病毒核心蛋白人源单链抗体在大肠杆菌中的表达

目的获得可溶性的抗乙型肝炎病毒(HBV)核心蛋白(core )的人源单链可变区抗体(ScFv),为得到纯度高、活力强的HBc- ScFv和进一步的抗HBV 治疗奠定基础.方法采用噬菌体表面展示技术,以重组的HBV核心蛋白为包被抗原,从噬菌体单链可变区抗体库中经过5轮"吸附-洗脱-扩增"筛选过程,获得抗原结合活性较强的乙型肝炎核心蛋白人源单链可变区抗体ScFv 片段克隆,并对其进行DNA序列及免疫活性测定.从噬菌体抗体阳性克隆中提取质粒转化大肠杆菌HB2151,IPTG诱导表达乙型肝炎核心蛋白可溶性人源单链可变区抗体,ELISA和western blot检测其抗原结合特异性. 结果克隆了乙型肝炎核心蛋白的单链可变区抗体基因;经DNA酶切和序列分析表明,该抗体基因由771个碱基组成;ELISA 和western blot结果表明:在大肠杆菌HB2 151中经IPTG诱导表达的可溶性乙型肝炎核心蛋白的单链可变区抗体,具有结合乙型肝炎核心蛋白的特异性和免疫活性.结论克隆、鉴定并在大肠杆菌HB2151中表达了可溶性的HBc- ScFv.

超抗原SED在大肠杆菌中的表达

目的构建稳定的SED原核表达系统.方法采用PC R技术扩增葡萄球菌D型肠毒素(SED)超抗原的成熟蛋白编码区DNA序列,构建SED DNA与6个组氨酸基因融合的表达载体pTrcHis-SED,转入E.coli DH5α,IPTG诱导后,用SDS-PAGE和免疫印迹检测融合蛋白的表达情况.目的蛋白用Ni-NTA金属亲和层析法进行纯化,SDS-PAGE和毛细管电泳检测蛋白纯度.结果成功构建了原核表达载体pTrcHis-SED.分子量约为28 000 u的6His-SED融合蛋白可在E.coli DH5α中稳定表达.Ni-NTA金属亲和层析后得到纯度较高(>95%)的SED融合蛋白,且具有免疫学活性.结论本研究为SE D免疫识别研究奠定了实验基础.

中国人IκBα基因的克隆和序列分析

目的克隆中国人IκBα基因,了解其与欧美人种有无不同, 为进一步的研究工作打下基础.方法从中国人外周血中分离单个核细胞,刺激细胞贴壁30 min后提取总RNA.应用RT-PCR法扩增目的基因,胶回收法纯化.将其连接到pGEM-T质粒载体,进行测序并与已知IκBα序列进行同源性分析.结果中国人IκBα基因与genebank中发表的人IκB α基因序列仅2个碱基不同且所编码氨基酸无改变.结论我们已成功克隆了中国人IκBα基因 .同源性分析表明,其与 genebank中所报道的基因序列基本一致.

抗角蛋白抗体及相关自身抗体在RA诊断中的应用评价

目的评价抗角蛋白抗体(AKA)及其相关自身抗体对诊断类风湿关节炎(RA)的敏感性和特异性以及在临床上的意义.方法收集血清279例,包括正常人30例,RA56例,SLE114例,其它结缔组织病179例,检测AKA(IFA)、RF、ANA及ssDNA.结果 4种自身抗体对诊断RA疾病的敏感性和特异性为:AKA 39.3%和96.0%;RF 37.5%和86.5%;ANA 55.4%和39.5%;ssDNA 37.5%和49.8%;敏感性无显著性差异(P>0.05),特异性则AKA明显高于其它3种抗体(P<0.001).RF阳性率在RA患者AKA阳性组和阴性组有显著性差异(P<0.001),且RF含量与AKA滴度呈正相关;而ssDNA和ANA则无显著性差异(P>0.05).结论 AKA是RA的又一个特异性抗体,联合检测AKA及RF对于RA的诊断与早期诊断具有重要意义.

Graves'病患者外周血ICAM-1水平与疾病免疫状态间的关系

目的探讨Graves'病患者外周血细胞间粘附分子-1(ICAM -1) 水平与机体免疫状态间的关系.方法用流式细胞术测定34例Graves'病( GD)患者治疗前外周血淋巴细胞膜上细胞间粘附分子-1(CD54+)、CD4+、CD3+、CD 8+、CD19+、CD25+(可溶性白介素-2受体)的表达水平,用ELISA 方法测定其血清中可溶性细胞间粘附分子-1(sICAM-1)的浓度,同时测定该病患者的其它体液免疫指标 (TsAb、TGAb、TpoAb),并和22例正常对照人群进行各指标间的比较;细胞间粘附分子-1水平与机体其它免疫指标间做相关分析.结果 Graves'病患者血清可溶性细胞间粘附分子-1水平明显高于对照人群(P<0.001),与细胞免疫指标中的CD4+水平呈负相关(n=34,r=-0.503,P<0.005);但与其它细胞免疫指标和体液免疫指标间无相关关系 ,外周血淋巴细胞膜上细胞间粘附分子-1的表达水平和正常对照组间无差异.结论 sICAM-1在未治疗的GD病患者中是升高的,其升高与体液免疫指标不相关,与细胞免疫指标有一定关系.因此,sICAM-1可能是不同于体液免疫指标的一项新型免疫指标, 它不同程度地反映着细胞免疫水平.

呼吸道合胞病毒下呼吸道感染TH亚群功能状态的研究

目的探讨RSV下呼吸道感染TH亚群功能状态.方法用单克隆抗体双色免疫荧光PE/FITC双标记,流式细胞仪检测30例RSV下呼吸道感染患儿急性期外周血单个核细胞(PBMCs)辅助性T淋巴细胞CD4+及其亚群CD4+CD 45RA+、CD4+CD45RO+的表达,ELISA方法检测血清中IFN-γ, IL-4, IgE 水平.结果 RSV下呼吸道感染组患儿外周血辅助性T淋巴细胞CD4+明显低于对照组(P<0.05), CD4+CD45 RA+细胞明显下降(P<0.05),CD4+CD45RO+细胞虽有下降,但与对照组相比无统计学差异(P>0.05).CD4+CD45RA+/CD4+CD45RO+比值与对照组相比明显降低(P<0.05).RSV下呼吸道感染组患儿血清中IFN-γ, IL-4水平均有降低, 其中IFN-γ水平下降非常明显(P<0.01), IFN-γ/IL-4比值降低(P<0.05).RSV下呼吸道感染组患儿血清中IgE水平明显升高.结论婴幼儿RSV下呼吸道感染急性期的免疫功能紊乱主要表现为辅助性T淋巴细胞CD4+及其亚群CD4+CD45RA+/CD4+CD45RO+的失衡.TH1及其功能下降,T H2及其功能相对增强,TH1/TH2失衡是导致该病发生TH2样反应重要的免疫机制.

慢性乙型肝炎与HLA-DRB1等位基因相关性的研究

目的探讨慢性乙型肝炎与HLA-DRB1等位基因多态性之间的关系.方法采用聚合酶链反应/序列特异性引物(PCR/SSP)技术对52例慢性乙型肝炎和106例正常人的HLA-DRB1等位基因多态性进行了分析.结果 HLA-DRB10301在慢性乙型肝炎组的等位基因频率明显高于对照组(17.13% vs 5.67%, χ2=12.306 8, Pc=0.007 4, RR=4.15).HLA-D RB1*1101/1104在慢性乙型肝炎组的等位基因频率明显低于对照组(0.96% vs 6.13%, χ2=4.619 6, RR=0.14),但经较正后,Pc＞0.05.其他等位基因频率在实验组和对照组间差异无显著性.结论 H LA-DRB1*0301与慢性乙型肝炎的易感性呈正相关,可能是慢性乙型肝炎的易感基因.

单纯疱疹病毒糖蛋白模拟位的研究

目的为了充分认识单纯疱疹病毒(HSV)糖蛋白的抗原表位,寻找HSV多组分疫苗和新型基因工程疫苗更有效的小片段短肽作为该病毒疫苗的备选免疫原.方法利用有动物保护活性的抗HSV糖蛋白C(gC)单克隆抗体(McAb)1A12淘筛噬菌体随机12肽库,经4轮筛选后进行ELISA检测,随机挑取14个阳性克隆进行序列测定,序列比较后得到保守序列,做ELISA阻断实验进一步鉴定筛选结果并与相关天然蛋白HSV gC进行序列比较.结果获得保守序列-SG(L)RHII-和其侧翼辅助序列-AK-、-VW-,其与天然相关蛋白HSV gC 114～116位氨基酸十分相似.携有此短肽的噬菌体可以与McAb特异结合,并可部分阻断抗体与HSV囊膜抗原的反应.结论所筛选到的保守序列可模拟McAb针对的抗原表位,可能是HSV的替代抗原.这一研究方法有望使短肽替代庞大的糖蛋白全长氨基酸序列,为研制更有效及更广谱的基因工程疫苗提供依据,也使研制基于抗原表位水平的特异诊断试剂成为可能.

抗甲型肝炎病毒抗体Fab在大肠杆菌中的表达

目的在大肠杆菌中高效表达人源抗HAV抗体Fab,为进一步研究该抗体的功能奠定基础.方法依次将抗HAV抗体的Fd及轻链基因克隆到表达载体pASK84的不同信号序列下,构建成Fab表达质粒,在大肠杆菌JM83中进行表达,并对表达产物进行复性.用SDS-PAGE、western blot和ELISA法检测Fab的表达及其与甲肝病毒抗原的结合活性.结果构建了抗HAV Fab的重组表达质粒p84Fab,在大肠杆菌JM83中获得表达,表达的Fab占全菌的25%,主要以包涵体形式存在,复性后具有抗原结合活性;培养基、菌体可溶性蛋白部分也能检测到有抗原结合活性的Fab. 结论抗HAV抗体Fab在大肠杆菌中得到了表达,并具有良好的抗原结合活性.

人TLR4胞外区cDNA克隆及其酵母表达载体的构建

研究表明:TLR4是哺乳动物LPS作用的受体,介导LPS的生理和病理效应[1～3].有关研究取得明显的进展,但对于其识别的配体目前还未阐明.新近发现并广为应用的酵母双杂交技术给上述研究提供了新的机遇.因此,本研究克隆TLR4胞外区cDNA,并构建酵母双杂交系统的靶基因,为进一步利用该系统研究与TLR4相互作用的蛋白质奠定基础.

变应性鼻炎病人IL-4、IL-5和GM-CSF的水平观察

变态反应性鼻炎的发病机理与诸多细胞因子有关的现象,近年来已越来越受到国内外学者的重视[1].变态反应性鼻炎发作时细胞因子的产生及炎性介质的参与均与机体异常的免疫调节有关,即存在T辅助细胞(TH)亚群功能失调,通过释放细胞因子,促进IgE的合成与分泌,并增加炎症细胞的浸润和活化.本文观察变应性鼻炎病人血清IL-4、IL-5和GM-CSF水平变化,为变应性鼻炎的防治提供依据.

中国人红细胞补体受体1(CD35)分子量多态性

CR1即补体受体1型,是补体成分C3b、iC3b与C4b的受体,存在于多种细胞表面.每个红细胞表面平均有500个CR1分子,由于红细胞数量较多,所以血液中CR1大部分存在于红细胞表面[1].红细胞CR1参与多种免疫功能如调理免疫复合物[2]等,同时还发现与许多疾病有关,且与其数量或分子量多态性直接相关.目前大部分研究集中在CR1活性及数量多态性上,本研究旨在了解中国人CR1/E分子量多态性.

人体β-防御素hBD-3的cDNA克隆与鉴定

防御素是一类具有广谱抗微生物活性的小分子多肽,具有抗菌、抗病毒及杀伤肿瘤细胞的多功能效应,其效能强大,且至今尚未发现病菌株对它产生耐药性,有关防御素的基础和临床前应用研究已成为生物医学研究领域的热点之一,深受医学界、药学界瞩目,尤其引人注目的是新近发现的β-防御素.已发现3种人体β-防御素,hBD-1是Bensch等[1]于1995年从肾衰患者血透析液中分离获得的;hBD-2是Harder等[2] 于1997年从银屑病患者病损上皮中分离获得的; 2001年,Harder等[3]又从人体鳞癣皮肤中分离获得hBD-3.有关hBD-1 和hBD-2基因的克隆、表达及其调控已有许多研究报道[4],为开发新一类抗菌药物奠定了一定基础.hBD-3的发现为人体防御素的基础和应用研究注入了新的活力,进一步深入研究人体β-防御素hBD-3基因的表达及其调控机制,建立高效表达具有广谱抗菌活性的人体防御素的生物工程新方法、新技术具有极其重要的意义.本研究利用RT-PCR技术,成功克隆了hBD-3的cDNA片段.

人类白细胞抗原与人类巨细胞病毒

人类巨细胞病毒(human cytomegalovirus,HCMV)通过多种途径逃避宿主的免疫监视和防御功能,其主要机制为:合成多种时相蛋白,影响和破坏人类白细胞抗原(human leukocyte antigen,HLA)分子在宿主细胞表面的表达,从而干扰抗原递呈及影响NK细胞的杀伤活性.本文就有关新研究进展作一综述.

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