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双酚A对Caco-2细胞的细胞毒性及氧化应激研究
目的 探究双酚A(bisphenol A,BPA)对Caco-2细胞的毒性及氧化应激作用.方法 选用6.25、12.5、25、50和100 mg/L的BPA与Caco-2细胞共培养24 h,MTT法和乳酸脱氢酶(LDH)释放法测定BPA对Caco-2细胞毒性作用,比色法检测细胞中抗氧化防御酶超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)以及脂质过氧化产物丙二醛(MDA)的活力和含量,荧光探针法检测活性氧簇(ROS)生成.结果 50、100 mg/L BPA与Caco-2细胞共培养24 h后,细胞存活率与对照组比较显著降低(P＜0.01);细胞抗氧化防御酶SOD、CAT活力下降,MDA含量增加,与BPA浓度呈正相关;50、100 mg/L BPA处理组,细胞ROS生成量与对照组比较显著升高(P＜0.01),ROS荧光信号与BPA浓度呈正相关.结论 结果表明BPA对Caco-2细胞的毒性作用与其浓度呈正相关,BPA引起Caco-2细胞的氧化应激与其发挥细胞毒性有相关性.
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3种纳米氧化锌对不同分化状态Caco-2细胞的毒性作用研究
目的 探讨不同粒径纳米氧化锌(ZnO)对不同分化状态人结肠腺癌细胞(Caco-2)的毒性作用.方法 将Caco-2细胞接种于96孔板培养24 h(未分化细胞)或21 d(分化细胞),选用3种尺寸纳米氧化锌,分别为ZnO-20(25.3±5.8 nm)、ZnO-L(25.6±5.7 nm)和ZnO-100(96.7±42.7 nm),设置不同的剂量(6.25、12.5、25、50和100 μg/ml)与未分化或分化的Caco-2细胞共培养24、48或72 h后,采用CCK-8法检测细胞活性,比色法检测乳酸脱氢酶(LDH)释放率以及碱性磷酸酶(ALP)活性.结果 浓度为100 μg/ml处理72 h,3种纳米氧化锌可使未分化细胞活性分别下降81.3％、68.1％和55.1％,分化细胞活性分别下降69.3％、55.1％和49.0％,染毒24 h,在50 μg/ml的浓度条件下LDH释放率分别升高至70.6％、68.4％和54.7％,影响细胞膜结构的完整性.并且对ALP表达均有抑制作用,上述作用均存在剂量反应关系.纳米氧化锌粒径越小毒性越大,毒性强弱顺序为ZnO-20＞ ZnO-L＞ ZnO-100,粒径相近时,毒性仍有差别,可能与颗粒的形状等其他性质有关.此外,对于同一种纳米材料毒性作用,未分化细胞的敏感性较分化细胞强.结论 纳米氧化锌对Caco-2细胞的毒性作用与其粒径、形状等理化性质以及细胞分化状态均相关.
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铜对人类肠道上皮Caco-2细胞的毒性研究
目的了解铜对人类肠道上皮Caco-2细胞的毒性影响.方法应用噻唑蓝(MTT)实验、P-糖蛋白(P-gp)活性检测实验、活性氧检测及克隆形成实验研究铜对肠道上皮Caco-2细胞的毒性及可能作用机制,同时利用Caco-2细胞和肠炎沙门氏菌为模型,研究铜对Caco-2细胞对细菌侵入和存活易感性的影响.结果在一定的暴露场景下,铜可明显地降低细胞的活力,抑制细胞膜表面P-gp的活性,促进细胞内活性氧自由基的产生,降低细胞的克隆形成能力.此外,细胞经铜暴露后,肠炎沙门氏菌侵入细胞的数量增加,但细胞内存活的细菌数量却下降.结论过量的铜可导致Caco-2细胞氧化损伤,从而引起更广泛的细胞毒性效应,但其对细胞对细菌侵入和存活易感性的影响有待进一步研究.
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Caco-2细胞单层模型及其在毒理学中的应用
Caco-2细胞来源于人类结肠腺癌细胞,当其在生长达到融合后细胞可自发形成极性,表达出成熟肠道上皮细胞的某些形态和功能特征,其细胞单层模型是目前为成熟的体外模拟肠道上皮细胞摄取和转运营养物质和外来化学物的模型,被广泛地应用于药理学和毒理学研究.本文介绍了Caco-2细胞单层模型的培养条件、细胞特性及常用功能指标,以及其在对外源化学物代谢、摄取、转运和消化道毒理学方面的应用.
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铜对Caco-2细胞单层屏障功能的影响
目的研究铜对Caco-2细胞单层细胞间通透性、P-糖蛋白(P-gp)活性的影响.方法应用Caco-2细胞单层模型,通过测定铜暴露后细胞单层的跨上皮细胞电阻(TEER)来反映通透性的改变;通过免疫荧光和荧光染色观察铜对紧密连接蛋白ZO-1和F微丝的影响;通过测定细胞单层对罗丹明-123的跨膜转运和细胞内罗丹明-123的蓄积来反映P-糖蛋白活性的改变.结果细胞单层顶面铜暴露(30～100 μmol/L,Hanks 缓冲溶液,0～3 h)可导致TEER值呈浓度和时间依赖性降低,同时伴随着F微丝的解聚,但对紧密连接蛋白ZO-1无显著影响;在不影响细胞活性和细胞单层通透性的剂量下,顶面铜暴露(300 μmol/L,完全培养基,24 h)后细胞单层对罗丹明-123的表观通透系数(Papp)BL→AP从对照组的(7.37±0.20)10-6cm/s降低为(6.43±0.27)×10-6 cm/s, PappAP→BL从对照组(1.23±0.05)×10-7cm/s 增加为(3.41±0.08)×10-7cm/s,同时细胞内罗丹明-123的蓄积量从对照组的每膜(0.31±0.01) nmol增加为每膜(0.50±0.03) nmol.结论铜可显著增加Caco-2细胞单层的通透性和抑制P-gp的活性,从而推测可能影响肠道上皮细胞的正常屏障功能.
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芍药苷对乌头碱在 Caco-2细胞模型上转运行为的影响研究
目的：研究芍药苷对乌头碱在 Caco-2细胞模型转运行为的影响。方法：以乌头碱累积转运量及表观渗透系数 Papp值为指标，采用高效液相色谱法对乌头碱含量进行检测，考察不同浓度、不同孵育时间、不同方向乌头碱在 Caco-2细胞上的转运行为，以及与芍药苷不同配伍后转运行为的变化，并考察 P-gp 抑制剂存在与否对乌头碱转运行为的影响。结果：乌头碱累积转运量与给药浓度、孵育时间呈正相关，不同浓度乌头碱 Papp 值均大于1×10－6 cm·s －1，且保持恒定，无统计学意义，但外排作用明显强于吸收，外排比接近1.5。在 P-gp 抑制剂维拉帕米存在条件下乌头碱转运量显著增加。当乌头碱与芍药苷配伍比例为1∶60时，乌头碱转运量显著减小。结论：乌头碱为吸收良好的一类药物，以被动转运为主，但仍存在外排蛋白 P-gp 的参与。当芍药苷配伍乌头碱达到一定比例时，对乌头碱的肠吸收具有显著的抑制作用。
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溃结灵含药血清对Caco-2细胞损伤模型细胞增殖的影响
目的:观察溃结灵含药血清对Caco-2细胞损伤模型细胞增殖的影响.方法:应用三硝基苯磺酸灌肠法复制溃疡性结肠炎大鼠模型,3d后采集血液,分离血清,作为损伤剂作用于Caco-2细胞一段时间,模拟细胞炎性损伤模型,MTT法观察不同浓度溃结灵含药血清对Caco-2细胞损伤模型细胞增殖的影响.结果:与模型血清组比较,10％,5％,2.5％,1.25％,0.625％溃结灵含药血清作用Caco-2细胞损伤模型24h后,有促进其增殖的作用,尤以10％溃结灵含药血清效果佳(P＜0.05).结论:溃结灵含药血清可促进Caco-2细胞炎性损伤后细胞增殖.
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黄芪提取物对结肠腺癌Caco-2细胞葡萄糖吸收的影响
目的:探讨黄芪提取物对Caco-2细胞葡萄糖吸收的影响,并探讨其作用机制.方法:采用系统溶剂法提取黄芪各部位,以Caco-2细胞为研究对象,设立空白组和黄芪各提取部位组(乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇4个部位组).以荧光标记2-脱氧葡萄糖(2-NBDG)做为光学探针检测黄芪各提取部位对Caco-2细胞葡萄糖吸收能力的影响.筛选出黄芪中促进Caco-2细胞葡萄糖吸收的药效部位后,对这一药效部位有效作用浓度进行考察.采用蛋白免疫印迹法(Western blot)法测定Caco-2细胞钠依赖葡萄糖转运蛋白(SGLT1)和2型葡萄糖转运蛋白(GLUT2)蛋白表达.结果:黄芪正丁醇提取部位可以促进Caco-2细胞葡萄糖的吸收,与空白组比较,黄芪正丁醇提取部位100,150 mg·L-1组Caco-2细胞葡萄糖含量升高(P ＜0.05,P＜0.01);且黄芪正丁醇部位可以上调Caco-2细胞GLUT2和SGLT1蛋白的表达(P ＜0.05,P＜0.01).结论:黄芪正丁醇萃取部位可以促进Caco-2细胞葡萄糖的吸收,这一作用机制可能与SGLT1和GLUT2蛋白的调节有关.
关键词： 黄芪 Caco-2细胞 葡萄糖吸收 钠依赖葡萄糖转运蛋白 2型葡萄糖转运蛋白 -
新疆阿魏乙酸乙酯提取物对人结肠腺癌Caco-2细胞迁移、侵袭的影响及相关机制
目的:研究新疆阿魏乙酸乙酯提取物对人结肠腺癌Caco-2细胞迁移、侵袭的影响,并探讨其相关机制.方法:以Caco-2细胞为研究对象,用6.25,12.5 mg·L-1新疆阿魏乙酸乙酯提取物和顺铂分别作用于处于对数生长期的人结肠腺癌Caco-2细胞,并设空白组,用划痕愈合法观察0～48 h各组Caco-2细胞迁移情况,用transwell小室法计数72 h各组Caco-2细胞穿过基质膜个数,并计算出每个时间段Caco-2细胞迁移率和侵袭抑制率.采用荧光实时定量PCR法和蛋白免疫印迹法(Western blot)检测各组Caco-2细胞中磷酸酶(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten,PTEN),丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(serine/threonine,Akt),哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalina target of rapamgcin,mTOR)基因和蛋白的表达水平.结果:与空白组比较,新疆阿魏乙酸乙酯提取物和顺铂组在24,48 h细胞愈合程度变慢(P＜0.05);72 h时穿过基质膜的细胞个数显著减少(P＜0.01),各用药组PTEN基因表达水平明显升高,Akt,mTOR基因表达水平明显较低(P＜0.05).结论:新疆阿魏乙酸乙酯提取物可以显著抑制人结肠腺癌Caco-2细胞的迁移和侵袭,可能与提高PTEN基因表达水平有关.
关键词： 新疆阿魏 Caco-2细胞 迁移 侵袭 磷酸酶 丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶 哺乳动物雷帕霉素靶蛋白 -
溃结灵含药血清对Caco-2细胞损伤模型ITF基因和MUC2蛋白表达的影响
目的:观察溃结灵含药血清对人克隆结肠腺癌(Caco-2)细胞损伤模型肠三叶因子(ITF)基因和MUC2蛋白表达的影响.方法:三硝基苯磺酸(TNBS)灌肠法复制溃疡性结肠炎(UC)大鼠模型,采用UC模型大鼠血清刺激Caco-2细胞,造成细胞损伤模型,分别用荧光实时定量-PCR (RT-PCR)法及免疫组化法检测溃结灵含药血清对Caco-2细胞损伤模型ITF mRNA及MUC2蛋白表达的影响.结果:与正常血清组ITF mRNA MUC2蛋白相对表达量(1.00±0.11),(8.62±3.16)比较,模型血清组(1.20±0.16,11.22±2.37),均明显增高(P ＜0.05,P＜0.01)；与模型血清组比较,溃结灵含药血清组ITF mRNA(1.76±0.37)及MUC2蛋白表达量(13.94±2.59)均明显增高(P ＜0.05,P ＜0.05).结论:溃结灵含药血清可上调Caco-2细胞损伤模型ITF基因和MUC2蛋白表达.
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肠上皮细胞模型不同培养条件的优化及适应性研究
目的:建立肠上皮(Caeo-2)细胞单层模型,探讨不同培养条件对细胞单层模型的影响,优化适宜的条件,提供稳定、重复性好的Caco-2细胞模型.方法:将细胞接种Transwell培养板上进行体外培养,并比较3种Transwell培养板及包被鼠尾胶原蛋白对细胞单层的影响,通过透射电镜和倒置显微镜观察细胞单层的形态学特征,通过测定细胞单层的电阻值、细胞两侧碱性磷酸晦含量、荧光素钠的透过量验证细胞单层的完整性、极性、通透性.结果:经过21 d培养,24孔Transwell培养的细胞单层的完整性、极性高于12孔Transweil培养的细胞单层,而透过性低于12孔Transwell培养的细胞单层;包被鼠尾胶原蛋白的Transwell于细胞单层生长前期跨上皮细胞电阻值(transepithelium electrical resistance,TEER)迅速升高,对细胞单层生长的中后期无显著性影响.结论:3种Transwell均可成功培养Caco-2细胞单层,24孔站立式Transweli适用于样品需求量少、检测灵敏度高的物质,可应用于大量样品的高通量筛选;12孔悬挂式Transwell提供检测的样品量和透过率较大,适于实验室的常规操作和常用仪器的样品需求.
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异甘草素在Caco-2细胞的摄取特性
目的:研究异甘草素(ISL)在Caco-2细胞的摄取特性.方法:以Caco-2细胞单层模型研究异甘草素的细胞摄取规律.采用高效液相色谱法测定细胞中ISL浓度,考察时间、pH值、药物浓度及抑制剂对Caco-2细胞摄取ISL的影响.结果:ISL在Caco-2细胞中的摄取呈时间依赖性;ISL在4～15 mg·L-1浓度范围内的摄取呈线性增加,符合被动扩散过程;pH 8.0条件下药物的细胞摄取量(0.48±0.006)μg·mg-1显著低于pH 5.0药物的细胞摄取量(0.98±0.03)μ·mg-1(P<0.01);加入维拉帕米,叠氮化钠及2,4-二硝基酚后,与对照组相比,ISL的细胞摄取量显著高,分别为(1.19±0.030)μg·mg-1(P<0.01),(1.10±0.004)μg·mg-1(P<0.05),(1.17±0.020)μg·mg-1(P<0.01).结论:ISL的细胞摄取机制主要是被动转运;P-糖蛋白参与了ISL的转运过程.
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关附壬素在Caco-2细胞上的摄取特性研究
目的:研究关附壬素在Caco-2细胞上的摄取特性.方法:采用液相色谱质谱联用(LC-MS)测定法,COSMOSIL C18柱(150 mm×2.0mm,5μm),流动相:乙腈-水(含0.2％冰乙酸)30∶70,流速0.2 mL· min-1,电喷雾离子化(ES1)方式,采用选择性离子检测法,检测离子为正离子,关附壬素的选择性离子:[M+H],m/z 388.考察了温度、药物浓度、时间和pH对关附壬素在Caco-2细胞上摄取的影响.结果:关附壬素在0.2～50.0μmol·L-1内呈良好的线性关系(r=0.9967),低定量限为0.2 μmol·L-1.关附壬素在Caco-2细胞上的摄取具有一定的浓度、时间和pH依赖性.结论:该方法灵敏、操作简单,选择性强,关附壬素在Caco-2细胞上摄取良好,其摄取表现为被动扩散.
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大黄酸对Caco-2细胞多药耐药蛋白转运体表达的影响
目的:探讨大黄酸对人结肠腺癌上皮细胞(Caco-2)多药耐药蛋白mRNA表达的影响.方法:用大黄酸作用于Caco-2细胞,采用荧光定量PCR(real time PCR)法检测转运体MRPl-5 mRNA的表达量,数据分析采用2-AACT法.结果:高(5.00 mg·L-1)低(2.50 mg·L-1)质量浓度大黄酸均可以显著上调Caco-2细胞MRP3 mRNA表达(P<0.05或P<0.01);低浓度大黄酸可以显著下调Caco-2细胞MRP5 mRNA表达(P<0.05);大黄酸对MRPI,MRP2和MRP4 mRNA的表达没有显著影响.结论:大黄酸可能通过上调Caco-2细胞MRP3 mRNA的表达和下调MRP5 mRNA的表达而影响其口服药物的生物利用度.
关键词： Caco-2细胞 大黄酸 荧光定量聚合酶链反应 多药耐药蛋白 -
香附醋制前后对Caco-2细胞P-糖蛋白功能和表达的影响
目的:通过研究香附醋制前后对Caco-2细胞P-糖蛋白(P-gp)功能和表达的影响,初步阐明“香附醋制增效”理论的机制.方法:采用Caco-2细胞模型,细胞以2×105/mL的密度接种于Trenswell 6孔板,加入体积分数分别为5％,10％,20％的香附生品及醋制品含药血清培养24 h,流式细胞仪检测香附醋制前后对Caco-2细胞Pgp功能的影响;免疫组化法检测P-糖蛋白的表达.结果:香附生品低、中、高浓度可使细胞内地高辛累积增加8.25％,9.57％,16.84％,醋制品低、中、高浓度可使细胞内地高辛累积增加22.44％,29.12％,33.09％.二者均可使细胞内地高辛累积增加,并使P-gp表达的阳性率降低,对P-gp功能和表达均呈现出抑制作用,且醋制品作用更加明显.结论:香附醋制后可增加其抑制Caco-2细胞P-gp功能和表达的作用,从而促进P-gp底物的吸收.
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LC-MS考察α-香附酮在Caco-2细胞模型中转运特性
目的:考察α-香附酮在Caco-2细胞模型中转运机制.方法:建立Caco-2细胞模型,考察体积分数和时间对α-香附酮双向转运过程的影响.采用LC-MS测定α-香附酮含量,流动相甲醇(A)-水(B)梯度洗脱(0～5 min,30％～70％ A;5～ 10 min,70％～100％ A;15 ～20 min,30％A),流速0.25 mL·min-1,计算不同条件下表观渗透系数(Papp).结果:α-香附酮在2h内转运量与时间、体积分数呈正相关.不同体积分数α-香附酮从BL侧到AP侧的Papp与AP侧到BL侧的Papp比值均在0.5～1.5.结论:α-香附酮在Caco-2细胞模型中转运特性为被动扩散转运方式.
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板蓝根提取液中有效成分的吸收转运特性分析
目的:研究板蓝根中有效成分在Caco-2细胞模型中的吸收转运特征.方法:建立Caco-2细胞摄取、转运模型,考察受试化合物对该细胞的安全性,以跨膜电阻值、碱性磷酸酶活性和荧光素钠通透性3个指标检验细胞模型,考察浓度、时间、温度、抑制剂及pH对受试化合物吸收的影响.采用HPLC检测受试化合物,计算其表观渗透系数(Papp)与外排率.结果:板蓝根样品中精氨酸、腺苷能被小肠吸收细胞较好吸收,精氨酸Papp在1.01×10-6～ 1.35×10-6 cm·s-1,腺苷Papp在0.40×10-6 ～0.71 ×10-6 cm·s-1.2种成分在Caco-2细胞中膜通透性良好;精氨酸被吸收程度优于腺苷,精氨酸吸收率＞50％.板蓝根提取液中精氨酸、腺苷成分外排率(ER)均在1.0 ～2.0,存在P-糖蛋白(P-gp)外排转运蛋白介导两者的吸收转运,板蓝根样品中存在其他成分促进精氨酸、腺苷的P-gp外排作用.结论:板蓝根药材中精氨酸和腺苷能够被小肠细胞较好地吸收,存在吸收转运方向差异性,且都受到P-gp外排作用.
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大黄有效成分与附子有效成分配伍在Caco-2细胞模型上的转运分析
目的:研究大黄中大黄酸、大黄素,附子中去甲乌药碱,以及大黄酸、大黄素与去甲乌药碱分别配伍后在Caco-2细胞模型上的转运过程.方法:以大黄酸、大黄素、去甲乌药碱的累积转运量及表观渗透系数(Papp)为指标,采用HPLC对大黄酸、大黄素、去甲乌药碱的含量进行检测,考察大黄酸、大黄素、去甲乌药碱在Caco-2细胞上的转运行为,以及大黄素、大黄酸分别配伍去甲乌药碱后转运行为的变化情况.结果:不同浓度去甲乌药碱的Papp均＞1 ×10-7 cm·s-1,外排与吸收比值接近1.5,配伍大黄酸、大黄素后去甲乌药碱的Papp显著上升(P＜0.05).大黄酸、大黄素配伍去甲乌药碱后前二者的Papp显著下降(P＜0.05).结论:去甲乌药碱是1个中等吸收的药物,其吸收方式主要为被动转运.大黄中大黄酸、大黄素可促进附子中去甲乌药碱的在肠吸收,而去甲乌药碱却会抑制大黄酸、大黄素的在肠吸收.
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紫草素在Caco-2细胞的摄取特性
目的:研究紫草素(SKN)在Caco-2细胞的摄取特性.方法:以Caco-2细胞单层模型研究紫草素的细胞摄取规律.采用高效液相色谱法测定细胞中SKN浓度,考察时间、pH、药物浓度及抑制剂对Caco-2细胞摄取SKN的影响.结果:SKN在Caco-2细胞中的摄取呈时间依赖性；SKN在0.2 ～3.2 mg·L-1内的摄取呈线性增加,符合被动扩散过程；pH 8.0条件下药物的细胞摄取量(0.350±0.004) mg·g-1显著低于pH 5.0[(0.450±0.008) mg·g-1,P＜0.01]；加入维拉帕米,叠氮化钠及2,4-二硝基酚后,与对照组相比,SKN的细胞摄取量显著低,分别为(0.320±0.007),(0.340±0.003),(0.260±0.007) mg·g-1(P ＜0.01).结论:SKN的细胞摄取机制主要是被动转运；P-糖蛋白未参与SKN的转运过程.
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仙茅及其有效成分对不同状态Caco-2细胞PXR-P-gp的影响
目的:探讨仙茅水提液及其有效成分苔黑酚葡萄糖苷对正常/虚寒状态Caco-2细胞PXR-CYP3A活性的影响.方法:肌注氢化可的松琥珀酸钠20mg·kg-1·d-1制造虚寒大鼠模型;分别用正常、虚寒大鼠血清培养Caco-2细胞,诱导正常、虚寒两种状态细胞.仙茅水提液(生药0.75mg/mL)及其有效成分苔黑酚葡萄糖苷(1×10-5mol/L)作用于不同状态细胞后,检测不同状态Caco-2细胞PXR和P-gp蛋白表达.结果:MTT法结果显示,仙茅水提液各浓度(1 000、750、500、250、100μ g/mL)及其有效成分苔黑酚葡萄糖苷各浓度(10-3、10-4、10-5、10-6、10-7mol/L)对Caco-2细胞没有明显细胞毒性.虚寒组细胞的P-gp蛋白表达较正常组明显降低(P＜0.05);PXR蛋白表达水平有降低趋势,但无统计学意义.仙茅水提液与苔黑酚葡萄糖苷均能使正常和虚寒组细胞P-gp蛋白水平显著升高(P＜0.01),而对PXR蛋白水平没有显著影响.结论:仙茅能使正常及虚寒状态Caco-2细胞P-gp高表达,说明仙茅对Caco-2细胞P-gp有诱导作用.
