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白介素1β抑制培养的大鼠皮层神经元钠电流峰值和动作电位幅度
白介素1β(interleukin-1β,IL-1β)是重要的促炎细胞因子,在中枢神经系统的生理学和病理学过程中发挥关键作用.电压门控钠通道是可兴奋细胞电学活动的基础,控制神经元的兴奋性和动作电位.近的研究又显示了IL-1β与电压门控通道之间的相互作用.为考察中枢神经元中IL-1β与电压门控钠通道之间的相互作用,本研究使用10 ng/mL的IL-1β处理培养的大鼠皮层神经元24 h,通过电压钳技术测定电压门控钠电流,结果表明IL-1β处理抑制钠电流幅度,但不改变其激活和失活性质.与电压钳记录结果相一致,电流钳记录表明IL-1β降低动作电位幅度但不影响阈值.这些结果显示长时间的IL-1β处理可以抑制电压门控钠电流,这种抑制作用减小了动作电位幅度,这町能改变神经元的电学性质、突触传导等基本功能,并提示了IL-1β在神经系统损伤和疾病中作用的新的思路.
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N型胆碱能受体参与淀粉样β蛋白片段引起的大鼠大脑皮层神经元胞内钙水平升高
淀粉样β蛋白(amyloid β-protein,Aβ)诱导的细胞内钙稳态失调被认为是Aβ所致神经元损伤的后通路.然而,Aβ导致钙超载的机制,尤其是Aβ所致的细胞内钙浓度([Ca~(2+)]_i)升高是否与烟碱受体相关尚需进一步研究.本实验用激光扫描共聚焦显微成像技术观察了Aβ_(25-35)和Aβ_(31-35)对原代培养大鼠皮层神经元[Ca~(2+)]_i;的作用,探讨了其N型胆碱能受体机制.结果显示:(1)Aβ_(25-35)可剂量依赖性地引起皮层神经元[Ca~(2+)]_i升高;(2)Aβ的更小片段Aβ_(31-35),也能增加[Ca~(2+)]_i,其效应与Aβ_(25-35)相比没有显著性差异,但Aβ_(31-35)的反序列即Aβ_(31-35)对[Ca~(2+)]_i无明显影响;(3)使用烟碱受体的非特异性拮抗剂美加明(mecamylamine,MCA)预处理后,Aβ_(25-35)和Aβ_(31-35)诱导的[Ca~(2+)]_i升高效应被明显抑制,并表现出一定程度的剂量依赖性;(4)使用α4β2亚型烟碱受体拮抗剂二氢-β-刺桐啶碱(dihydro-β-erythroidine,D-β-E)同样能够部分阻断Aβ_(25-35)和Aβ_(31-35)诱导的[Ca~(2+)]_i升高,但其作用弱于相同浓度的MCA.这些结果表明,两种Aβ片段均能引起培养大鼠皮层神经元[Ca~(2+)]_i增高,Aβ_(31-35)序列是Aβ分子中具有同样生物活性的更短片段;中枢烟碱受体的过度激活参与了Aβ_(25-35)和Aβ_(31-35)诱导的[Ca~(2+)]_i升高.由此提示,阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)时发生的认知功能障碍可能与中枢烟碱受体激活引起的细胞内钙超载有关,N型胆碱能受体可能是AD时Aβ发挥神经毒作用的靶点之一.
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溶血磷脂酸对β-淀粉样蛋白片段AβP31-35所致小鼠大脑皮层离体神经元凋亡的神经保护作用
已报道低浓度溶血磷脂酸(lysophosphatidic acid,LPA)对去血清培养所致的神经元凋亡有神经保护作用.为了进一步观察LPA是否对β-amyloid peptide fragment 31-35(AβP31-35)所致的神经元凋亡也起类似的作用,本研究应用DNA电泳分析、HO33342和TUNEL染色法等技术,对培养的小鼠大脑皮层神经元进行了观察.结果显示,只有使用较低浓度的LPA(1～10μmol/L)、并且将此剂量的LPA比AβP31-35提前12～24 h加入培养液时,才可看到LPA明显削弱了AβP31-35所致的神经元凋亡.以上结果表明,适当浓度的LPA在长时间预作用的条件下,可对AβP31-35所致的皮层神经元凋亡起保护因子或抗凋亡因子的作用,但其作用途径可能较在去血清培养所致的凋亡时更为复杂,因为在去血清的同时加入LPA就能制止去血清所致的凋亡.
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溶血磷脂酸对培养小鼠大脑皮层神经元的双重作用:抗凋亡和促凋亡
应用DNA电泳分析、HO33342和TUNEL染色法、以及部分地使用透射电镜技术,检测了不同浓度的溶血磷脂酸(1ysophosphatidic acid,LPA)对离体培养的小鼠大脑皮层神经元存活情况的影响.结果显示,低浓度的LPA(0.1～30μmol/L)对去血清培养所致的皮层神经元凋亡有浓度依赖性的保护作用,而较高浓度的LPA(＞50 μmol/L)不仅不表现这种保护作用,而且可引致培养在含血清的完全培养基中的皮层神经元出现凋亡.以上结果表明,适当浓度的LPA对凋亡的皮层神经元起着保护因子或抗凋亡因子的作用,而较高浓度的LPA则起着促凋亡因子的作用.
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CaMKⅡ调节皮层神经元生长锥的骨架蛋白分布
目的 研究CaMKⅡ对小鼠大脑皮层神经元生长锥的骨架蛋白分布的影响.方法 通过对体外培养的小鼠大脑皮层神经元添加CaMKⅡ特异性抑制剂或激动剂,观察生长锥骨架蛋白F-actin的分布情况.经Tuj1特异性神经免疫荧光染色和Acti-stainTM 555 Phalloidint荧光染色肌动蛋白后,测量神经元生长锥内的肌动蛋白面积及长度.结果 用KN93抑制CaMKⅡ活性后,小鼠大脑皮层神经元轴突生长锥内的肌动蛋白F-actin面积及长度均减少;反之,若用CdCl2激活CaMKⅡ活性后,小鼠大脑皮层神经元轴突生长锥内的肌动蛋白F-actin面积和长度则增加.结论 CaMKⅡ能够调控大脑皮层神经元轴突生长锥骨架蛋白F-actin的分布.
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异氟醚预处理在大鼠皮层神经元缺氧损伤中的保护作用
目的探讨异氟醚预处理在大鼠皮层神经元缺氧无糖（OGD）损伤的保护作用及其可能机制。方法建立原代培养的大鼠皮层神经元OGD损伤模型,采用MTT法观察异氟醚预处理对大鼠皮层神经元OGD损伤的保护作用,Westernblot法检测磷酸化ERK（pERK）和低氧诱导因子（HIF）-1α的蛋白表达水平。结果 OGD组神经元存活率显著低于其它四组（P〈0.05）。IO组pERK、HIF-1α蛋白表达明显高于其它四组（P〈0.05）。结论异氟醚预处理对大鼠原代皮层神经元OGD损伤具有明显的保护作用。其机制可能与异氟醚增加pERK表达,进而调节HIF-1α的表达有关。
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氯胺酮抑制皮层扩散性抑制发生发展的研究进展
皮层扩散性抑制(cortical spreading depression,CSD)是一种在大脑皮层神经元及胶质细胞中波浪式扩散传导的抑制性脑电活动[1],这种病理现象的特征性表现为病变区域的神经元肿胀、细胞外钾离子及谷氨酸含量升高、局部皮层功能受损[2]。越来越多的证据表明,皮层扩散性抑制与先兆性偏头痛、癫痫、卒中、脑外伤及脑出血等疾病的预后密切相关[3,4]。临床研究显示氯胺酮可以改善皮层扩散性抑制的预后(如降低皮层扩散性抑制相关疾病的症状严重程度及发生频率)[5~8],甚至抑制皮层扩散性抑制的发生[9],但其具体作用机制、临床价值及药物安全窗仍有争议。近年来研究显示,星形胶质细胞通过表面受体、转运体以及蛋白对皮层扩散性抑制起促进和抑制的双重作用[10~12]。鉴于星形胶质细胞在氯胺酮对皮质扩散性抑制中所起的作用尚不确切,因而就此做一综述探究对其进行深入研究的可行性从而为脑保护寻找新的靶点。
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脑源性神经营养因子与中枢神经修复再生
神经营养因子在保护神经元存活并促进其突起生长发育过程中,常出现基因表达的时相变异,对不同种类的神经元有明显的作用选择性.脑源性神经营养因子(BDNF)作为神经营养因子家族中的一员,广泛分布于大脑中,是一类可促进运动神经元、感觉神经元、基底节前脑胆碱能神经元、皮层神经元、海马神经元、多巴胺能神经元等的存活和生长发育并能防止它们受损死亡,改善神经元病理状态、促进受损伤神经元再生及分化成熟等生物效应的多肽或蛋白质,在中枢神经系统(CNS)的损伤修复中具有重要的作用.本文就其理化性质、生物学特性及在中枢神经修复与再生中的作用等进行综述.
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脑损伤昏迷患者预后评估的研究进展
昏迷是在各种致病因素作用下,脑干网状上行激动系统或大脑皮层神经元广泛受损引起的严重意识障碍,是多种疾病发展过程的一个阶段.随着我国重症医学技术水平的不断提高,许多原来无法治疗的重症脑损伤患者得到及时救治,而相当大部分的患者经过积极的抢救后生命征平稳,却处于昏迷状态.
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蛋白激酶A 对小鼠皮层神经元酸敏感离子通道的调节
目的:探讨蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)对小鼠皮层神经元酸敏感离子通道(acid sensing ion channels,ASICs)功能的影响及机制.方法:取原代培养小鼠皮层神经元,通过应用钙影像、全细胞膜片钳、免疫荧光和Western Blot等技术,分别观察PKA 激动剂和抑制剂对ASICs 功能的影响及机制.结果:(1)在给予PKA 激动剂或抑制剂前神经元ASICs 电流幅值约为(224.2±17.59) pA(n=15),预孵育PKA 激动剂forskolin(10 μmol/L)使电流幅值减小为(108±14.67) pA(n=9),与对照组相比,差异有统计学意义(P<0.01),而预孵育PKA 抑制剂PKAI(5 μmol/L)则使电流幅值增加为(306.3±22.9) pA(n=12),与对照组相比,差异有统计学意义(P<0.01);(2)在给予PKA 激动剂或抑制剂前,酸诱导的胞内钙△F/F值为(0.708±0.07)(n=20),PKA 激动剂forskolin(10 μmol/L)使其减少为(0.140±0.013)(n=17),与对照组相比,差异有统计学意义(P<0.01),PKA 抑制剂PKAI(5 μmol/L)使其增加为(0.978±0.108)(n=19),与对照组相比,差异有统计学意义(P<0.01);(3)在加入forskolin 或PKAI 24 h 后,神经元ASIC1 总荧光密度无明显改变(P>0.05),但神经元ASIC1 膜荧光密度从对照组的(78.58±7.42)(n=32)减少到forskolin 孵育后的(31.41±3.38)(n=57),与对照组相比,差异有统计学意义(P<0.01),而PKAI 孵育后神经元ASIC1 膜荧光密度增加到(118.29±11.50)(n=34),与对照组相比,差异有统计学意义(P<0.01).结论:PKA 通过影响ASICs 膜分布负性调节小鼠皮层神经元ASICs 电流及由酸诱导的胞内钙增加.
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人参皂甙单体Rg2、Re、Rh1对小鼠皮层神经细胞缺氧的保护作用
目的: 甙单体Rg2、Re、Rh1(终浓度60μmol/L)对小鼠皮层神经元缺氧的保护作用.方法:采用MTT比色法测定人参皂甙单体Rg2、Re、Rh1对缺氧神经细胞活性的影响,同时进行形态学观察.结果:终浓度60μmol/L人参皂甙单体Rg2、Re、Rh1均对小鼠皮层神经元缺氧损伤具有保护作用(P<0.01),且能减轻细胞的形态学损伤.结论:人参皂甙单体Rg2、Re、Rh1均对小鼠皮层神经元缺氧损伤具有明显的保护作用.
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黄连解毒汤有效部位对一氧化氮诱导大鼠皮层神经元损伤的保护作用
目的:观察黄连解毒汤有效部位(HJDAF)对培养皮层神经细胞一氧化氮损伤的保护作用.方法:体外培养新生大鼠皮层神经细胞,加入硝普钠观察其对神经细胞的损伤及HJDAF的保护作用.结果:HJDAF(153 mg/kg)可减少受损细胞的乳酸脱氢酶(LDH)漏出率;610,305,153 mg/kg可提高受损细胞的活性,减少丙二醛(MDA)生成(P<0.05;P<0.01);610 mg/kg可提高受损细胞超氧化物歧化酶(SOD)的活性.结论:HJDAF对培养神经细胞NO损伤具有一定的保护作用,其机制可能与抗脂质过氧化作用有关.
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银杏内酯对缺氧诱导的大鼠皮层神经元早期凋亡的影响
目的:观察银杏内酯(ginkgolide,Gin)对缺氧诱导的大鼠皮层神经元凋亡的保护作用.方法:选用胎龄14～16 d的SD胎鼠的大脑皮层细胞进行原代培养,建立缺氧神经元损伤模型.实验分为药物实验组(Gin组)、空白对照组、阳性对照组(MK-801),每组均进行有糖和无糖培养两种处理.应用MTT法分析细胞存活率、Annexin V-PE双标流式细胞仪法定量分析细胞早期凋亡.结果:MTT结果显示,Gin使皮层神经元存活率明显增加,且有糖的缺氧组皮层神经元存活率优于无糖组;流式细胞仪测定结果显示,预先加入Gin(终浓度37.5 μg/ml)的一组神经元的凋亡峰明显低于空白组,而无糖处理组凋亡峰均高于有糖处理组.结论:银杏内酯(37.5 μg/ml)对缺氧损伤的皮层神经元具有保护作用,可拮抗缺氧条件下体外培养的皮层神经元的早期凋亡.
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RhoA蛋白在凝血酶诱导的胎鼠大脑皮层神经元损伤中的作用
目的 探讨凝血酶诱导的胎鼠大脑皮层神经元损伤与RhoA蛋白活化表达的关系.方法 体外培养胎鼠大脑皮层神经元8d后,采用Western blot技术检测不同浓度凝血酶(0、1、10、30和100 U/ml)组作用3h后及30 U/ml凝血酶作用不同时间(0、0.5、1、3和6 h)组胎鼠大脑皮层神经元RhoA蛋白表达.结果 凝血酶30 U/ml组神经元细胞膜RhoA蛋白表达高于0 U/ml组(P＜0.05);5个凝血酶浓度组RhoA总蛋白表达量无统计学差异.凝血酶30 U/ml作用3h组细胞膜RhoA蛋白表达高于0h组(P＜0.05);5个时间组RhoA总蛋白表达量无统计学差异.结论 凝血酶诱导的胎鼠大脑皮层神经元损伤与一定浓度凝血酶和一定作用时间后RhoA蛋白的激活有关.
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BDNF通过Src/Plc-γ1通路调节皮层神经元的谷氨酸释放
目的 探讨脑源性神经生长因子(BDNF)对皮层神经元谷氨酸释放的作用及可能机制.方法 体外分离培养SD大鼠皮层神经元,用Src特异性抑制剂PP2 10 μmol/L预处理30 min后,再加入BDNF 100 ng/ml刺激.采用比色法检测皮层神经元谷氨酸释放,免疫印记检测Src、磷脂酶C-γ1 (Plc-γ1)、细胞外调节蛋白激酶(ERK1/2)和Akt的表达变化.结果 BDNF能促进谷氨酸释放,增加Src、Plcγ、Akt和ERK1/2的磷酸化水平.而PP2降低BDNF刺激皮层神经元的谷氨酸释放,抑制Plc-γ1的磷酸化水平;但对ERK1/2和Akt的磷酸化水平无明显影响.结论 BDNF可能通过Src/Plc-γ1信号通路刺激皮层神经元的谷氨酸释放.
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银杏叶提取物对缺氧复氧诱导的大鼠皮层神经元凋亡和Bcl-2蛋白表达的影响
目的观察银杏叶提取物(EGb)及其活性成份银杏总内酯(Gin)对缺氧复氧诱导的大鼠皮层神经元凋亡的保护作用.方法选用胎龄14～16 d的SD胎鼠的大脑皮层细胞进行原代培养,建立缺氧复氧(H/R)神经元损伤模型.实验分为正常组、缺氧复氧(H/R)组、药物实验(EGb、Gin)组、阳性对照(MK-801)组.应用MTT、TUNEL及Western blot方法.结果EGb和Gin均能提高皮层神经元缺氧复氧后的存活率,EGb和Gin组神经元的凋亡率低于H/R组且Bcl-2蛋白表达量较H/R组升高.结论EGb和Gin可部分拮抗缺氧复氧条件下体外培养的皮层神经元的凋亡,该保护作用与其诱导Bcl-2蛋白表达有关.
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新型的治疗阿尔茨海默氏症药物(1-二甲基磷酰基-2,2,2-三氯)-乙基-1-醇烟酸酯对体外神经细胞的作用
目的:观察本实验室合成的一种治疗阿尔茨海默氏症(AD)的药物(1-二甲基磷酰基-2,2,2-三氯)-乙基-1-醇烟酸酯(NMF),对体外培养的皮层神经细胞活性的影响以及对海人藻酸(KA)所致的神经损伤的保护作用.方法:采用体外培养皮层神经元的方法,解剖分离15 d胚胎小鼠皮层神经细胞,接种于96孔板,48 h后加药并培养72 h,以MTT 法观察NMF对小鼠皮层神经细胞活性的影响;同时将接种于24孔板的细胞预先给予NMF,d 3时加或不加KA处理后,以台盼蓝染色鉴别并计数死、活细胞,可得出细胞的存活率.结果:NMF明显促进胎鼠皮层神经元活性,其中NMF 1、0.1、10 nmol·L-1促进神经元活性增殖率分别高达 34.7%、37.4%、36.7%.NMF明显促进正常胎鼠皮层神经元存活率,与对照组比较,10、1 nmol·L-1 NMF对皮层神经元的存活率分别提高 39.3%、73.5%.NMF能显著对抗KA所致的神经元损伤,与KA损伤组相比,NMF 0.1、10、1 nmol·L-1对损伤皮层神经元的保护率分别为 77.30%、80.10%、84.15%.结论:NMF明显促进胎鼠皮层神经元的活性、提高正常皮层神经元的存活率,并能有效地保护KA所致的神经元损伤,提示NMF是一种很有潜力的治疗AD的药物.
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人参皂苷Rg1对寡聚肽Aβ1-42增加JNK活性及诱导凋亡的影响
目的：在寡聚肽Aβ1-42诱导的神经元凋亡过程中,探讨人参皂苷Rg1的保护作用和可能机制；方法运用寡聚肽Aβ1-42来诱导原代培养的皮层神经元损害,把神经元分为空白对照组、Aβ组、sp600125与Aβ共同孵育组以及人参皂苷Rg1与 Aβ共同孵育组,然后观察 JNK、p-JNK、caspase-3活性和TUNEL细胞数的变化。结果寡聚肽 Aβ1-42作用15 min,皮层神经元的JNK磷酸化水平明显增加；经过预先孵育24 h人参皂苷Rg1(2．5~10μmol·L-1)后,再与寡聚肽Aβ1-42共同孵育15 min,JNK磷酸化水平明显降低；寡聚肽Aβ1-42孵育24 h,caspase-3活性和TUNEL数明显升高；人参皂苷Rg1(10μmol·L-1)预处理24 h后,再与Aβ1-42共孵育24 h组中caspase-3和TUNEL阳性数目明显下降。结论人参皂苷Rg1可通过JNK通路减轻寡聚肽Aβ1-42诱导的神经元凋亡。
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17β雌二醇对氯胺酮诱导皮层神经元凋亡的影响
目的：研究17β雌二醇对氯胺酮诱导的原代培养皮层神经元凋亡的影响。方法原代培养大鼠皮层神经元,分别给予不同浓度的氯胺酮及17β雌二醇培养24 h,MTT法检测神经元的存活率,显微镜下观察神经元的形态变化, TUNEL法检测神经元调亡,Western blot法测定pAkt蛋白的表达。结果与对照组比较,氯胺酮能剂量依赖性降低神经元存活率。与氯胺酮组比较,17β雌二醇能剂量依赖性提高神经元的存活率。100μmol·L-1氯胺酮组显微镜下神经元数量减少,胞体立体感消失,细胞轮廓不清,神经元轴突断裂,TUNEL阳性神经元明显增加, pAkt表达明显降低。0.1
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知母皂苷元对谷氨酸引起的皮层神经元损伤的保护作用研究
目的 观察知母皂苷元(Sarsasapogenin,SAR)对谷氨酸引起的皮层神经元损伤的保护作用.方法大鼠乳鼠大脑皮层神经元,培养7 d后用于实验.倒置相差显微镜观察神经元树突生长发育情况;用MTT法测定细胞活力;Hoechst33258核染色观察细胞凋亡的形态学改变; Western印迹法检测神经元SYP、caspase-3、钙蛋白酶Ⅰ蛋白表达水平.结果 形态学观察结果显示谷氨酸可明显抑制神经元树突的生长发育,表现为神经元树突总长度明显降低、一级树突数目明显减少、大分支级数明显减少及胞体面积缩小.SAR (10、30、100 μmol·L-1)可明显抑制谷氨酸对神经元树突生长发育的抑制作用,并呈明显浓度依赖.MTT和Hoechst33258核染色结果显示谷氨酸可降低神经元细胞活力及增加神经元细胞凋亡百分比.SAR(10、30、100 μmol·L-1)能明显对抗谷氨酸引起的神经元细胞活力降低及细胞凋亡百分比增加.Western印迹结果显示谷氨酸可明显降低SYP蛋白表达水平及增加活性caspase-3、钙蛋白酶Ⅰ蛋白表达水平.SAR (10、30、100 μmol·L-1)可明显对抗谷氨酸引起SYP蛋白表达降低及活性caspase-3、钙蛋白酶Ⅰ蛋白表达增加.结论 知母皂苷元能够明显对抗谷氨酸引起的皮层神经元损伤作用.
