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CART抑制内质网应激促进缺血再灌注损伤后的神经修复
目的：早期溶栓和神经细胞保护一直是防治缺血性脑卒中的两大策略。然而，溶栓治疗常面临再灌注损伤或继发性出血等问题。因此，神经细胞保护及神经损伤的修复一直是本领域的研究热点。多年来的研究重点主要侧重于神经元的保护。本研究室发现CART能够发挥缺血再灌注损伤早期的神经保护作用和后期的神经修复作用。 CART发挥神经修复作用的机制有待进一步研究。方法：原代培养新生C57BL／6小鼠皮层神经元，体外氧糖剥夺复氧（O／R）模型，MTT生存实验及Western blot。结果：原代培养的皮层神经元O／R 4 h后给药CART，继续长时间培养，CART可以提高神经元的生存率，分子实验表明CART组GRP78蛋白水平升高，caspase 12的剪切体水平降低。结论：CART促进缺血再灌注损伤后期的神经修复，其机制可能是上调GRP78水平，抑制内质网应激和凋亡分子激活。
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花生四稀酸代谢产物EET调控神经血管单元抑制脑缺血再灌注损伤
目的：研究花生四稀酸代谢产物EET对神经血管单元的调控作用及对脑缺血再灌注损伤的神经保护机制。方法：通过敲除EET的水解酶基因升高内源性EET或应用外源性EET，研究EET对局灶性脑缺血小鼠及氧糖剥夺（ OGD）损伤的神经血管单元组成细胞的作用及机制。结果：EET减轻脑缺血再灌注小鼠的脑梗死体积和神经元调亡；明显抑制OGD诱导的培养脑皮层神经元，脑微血管内皮细胞和星形胶质细胞的损伤。 EET促进脑微血管内皮细胞的迁移、星形胶质细胞活化和神经生长因子的表达。 EET促进线粒体新生，稳定线粒体的结构和功能，抑制细胞色素C的释放和神经元凋亡。机制研究表明，EET通过PI3K／AKT通路促进CREB磷酸化，抑制线粒体活性氧生成和膜电位下降。 p－STAT3和girdin介导EET对脑微血管内皮细胞迁移的促进作用。 EET通过PPAR－γ／p－CREB信号通路促进星形胶质细胞分泌BDNF。结论：EET通过不同的信号机制分别调控神经血管单元的组成细胞，抑制脑缺血再灌注引起的神经凋亡。
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右美托咪定对大鼠神经元缺氧无糖损伤保护作用的实验研究
目的 研究a2肾上腺素受体激动剂右美托咪定(dexmedetomidine,DEX)对原代培养的大鼠皮层神经元缺氧无糖损伤(OGD)的保护作用并探讨其机制.方法 建立原代培养的大鼠皮层神经元缺氧无糖损伤(OGD)模型,通过采用MTT、LDH等方法观察右美托咪定对于神经元缺氧无糖损伤的保护作用,Western blot检测p38MAPK蛋白表达的变化.结果 右美托咪定对于缺氧无糖(OGD)损伤处理的神经元具有明显保护效果.右美托咪定预处理显著降低OGD损伤神经元中的磷酸化p38MAPK蛋白表达,p38MAPK抑制剂SB203580能模拟DEX的神经保护作用,使细胞存活率升高. 结论 右美托咪定预处理对于大鼠原代皮层神经元OGD损伤具有明显的保护效果.其机制可能与通过降低磷酸化p38MAPK表达有关.
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异氟醚激活ERK和HIF-1α产生对神经元缺氧无糖损伤的保护作用
目的 探讨异氟醚预处理在对大鼠皮层神经元缺氧损伤中的保护作用及其可能机制.方法 建立原代培养的大鼠皮层神经元缺氧无糖损伤(OGD)模型,采用MTT法观察异氟醚对神经元OGD损伤的保护作用,Western blot检测磷酸化ERK(pERK)和低氧诱导因子(HIF)-1α蛋白表达. 结果 异氟醚预处理显著增加OGD损伤神经元中HIF-1α的蛋白含量,ERK抑制剂PD98059可以部分阻断这种作用.结论 异氟醚预处理对于大鼠原代皮层神经元OGD损伤具有明显的保护效果.其机制可能与通过增加pERK表达,进而调节HIF-1α的表达有关.
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伽玛刀对大鼠皮层神经元钠电流的影响
目的 观察伽玛刀对体外培养大鼠皮层神经元电压依赖性钠电流的影响.方法 将原代培养的神经元随机分为实验组和对照组,通过立体定向技术和18 mm准直器对实验组原代培养大鼠皮层神经元实施伽玛刀照射,中心剂量30 Gy.伽玛刀照射后1、3、7、10 d通过膜片钳技术在全细胞模式下记录实验组和对照组皮层神经元的电压依赖性钠电流,每组每时间点记录6～8个神经元.结果 实验组皮层神经元在伽玛刀照射后1、3、7、10 d时的电压依赖性钠电流峰值密度(pA/pF)分别为(89.94±4.65)、(84.13±4.56)、(80.27±5.18)和(80.80±5.41),与对照组神经元电压依赖性钠电流峰值密度[照射后1、3、7、10 d分别为(100.93±4.63)、(97.89±4.77)、(100.76±5.90)和(102.84±4.08)]相比,均显著减小(P＜0.05),且减小程度随观察时间延长而增加,呈一定时间依赖性.另外,实验组神经元电压依赖性钠电流的I-V曲线明显上移,下降支明显右移.结论 伽玛刀照射通过抑制电压依赖性钠离子通道的功能引起大鼠皮层神经元兴奋性下降,可能是伽玛刀照射抑制癫痫发作的分子机制之一.
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RhoA蛋白参与凝血酶对胎鼠大脑皮层神经元的损伤
目的 探讨凝血酶诱导的胎鼠大脑皮层神经元损伤与RhoA蛋白活化表达的关系.方法 体外培养胎鼠大脑皮层神经元8d后,采用Western blotting检测不同浓度凝血酶(0、1、10、30和100 U/mL)作用3h后及30 U/mL凝血酶作用不同时间(0、0.5、1、3和6h)对皮层神经元RhoA蛋白活化表达的影响；RhoA蛋白活化抑制剂Exoenzyme C3预处理0.5 h及30 U/mL凝血酶作用皮层神经元3h后,行Western blotting检测RhoA蛋白活化表达的情况,并采用Hoechst33258核染色及CCK-8法观察Exoenzyme C3预处理和未处理时凝血酶对皮层神经元的损伤情况. 结果 在浓度实验中,30 U/mL凝血酶作用皮层神经元3h后能明显增加RhoA膜蛋白表达,与0U/mL组相比差异有统计学意义(P＜0.05)；而各浓度凝血酶对RhoA总蛋白表达无明显影响.在时程实验中,与其他时间点相比,30 U/mL凝血酶在3h时能明显增加RhoA膜蛋白表达,差异有统计学意义(P＜0.05),但对RhoA总蛋白表达也无明显影响.在Exoenzyme C3干预实验中,Exoenzyme C3预处理组与凝血酶组相比,RhoA膜蛋白表达明显降低,差异有统计学意义(P＜0.05)；Hoechst3258核染色显示,与凝血酶组相比,Exoenzyme C3预处理组中核浓染细胞数量明显降低,差异有统计学意义(P＜0.05)；CCK-8法检测细胞活性显示,凝血酶组细胞存活率明显低于Exoenzyme C3预处理组,差异有统计学意义(P＜0.05). 结论 凝血酶诱导的胎鼠大脑皮层神经元损伤与RhoA膜蛋白的高表达即RhoA蛋白活化表达有关.
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缺血再灌注后蛋白集聚与皮层神经元延迟性死亡的关系
目的 探讨缺血再灌注后蛋白聚集与大鼠皮层神经元延迟性死亡的关系. 方法 采用20 min全脑缺血的大鼠模型.按照再灌注时间分为5组:假手术组,0.5 h恢复组.4 h恢复组,24 h恢复组,72 h恢复组.采用HE染色光镜下观察缺血再灌注后皮层神经元的延迟性死亡.应用透射电子显微镜观察细胞胞浆内蛋白聚集物.Western blot分析泛素蛋白标记的蛋白聚集物在神经元内的含量变化. 结果 HE染色显示缺血再灌注72h后,可见部分皮层神经元死亡.透射电镜显示再灌注4h后神经元的胞浆内形成了蛋白聚集物.Western blot分析显示,与假手术组相比较,再灌注后0.5 h被泛素标记的蛋白聚集物便开始显著增加,再灌注后4 h和24 h达到峰值,再灌注后72 h含量开始减少,但仍然高于假手术组. 结论 蛋白聚集是导致缺血再灌注后神经元延迟性死亡的一个重要因素.
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急性分离大鼠新皮层神经元KATP通道特性
为研究急性分离大鼠皮层神经元上ATP敏感钾通道的特性,本实验采用了膜片钳技术之膜内面向外记录方法.ATP敏感钾通道电导为200 pS左右,翻转电位为0 mV,有外向整流现象;通道开放常呈簇状猝发样开放,平均开放时间和开放概率随去极化程度增大而增加,随超极化程度增大而减少;低浓度ATP有促进通道开放作用,并可激活二级电流;高浓度ATP抑制通道开放概率随浓度增大而增强; ATP浓度增高到1或2 mmol/L时,通道电流被阻断.0.1 mmol/L 优降糖可立即抑制通道活动.急性分离的皮层神经元上ATP敏感钾通道特性与培养神经元有差别;低浓度ATP可激活ATP敏感钾通道,防止神经细胞过度兴奋,从而起到保护脑缺血缺氧损伤的作用.
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急性分离大鼠新皮层神经元KATP通道的多电导状态
在193例急性分离大鼠皮层神经元内面向外式记录膜片上,记录到2例能为ATP和优降糖所阻断的含有亚电导的通道电流.其电流幅度分布直方图符合高斯分布,并能很好地进行二级拟合;主电导水平分别为191.8 pS 和194.5 pS,亚电导水平分别为153.2 pS和116.1 pS;亚电导成份分别占单位事件总数的35.05%和29.84%;通道活动呈高电流水平与低电流水平交替开放状态,没有高低电流叠合现象.这些结果表明这种KATP通道的多电导开放电流不是两个或多个独立通道的开放所致,而是同一通道的不同亚型状态交互活动(即高电导和低电导状态相互转换)的表现.从而提示神经细胞膜上的KATP通道可能受某种或某些膜内外环境的变化影响导致其构象改变,从而引发多种亚型交替活动现象.
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全脑缺血模型大鼠再灌后对皮层神经元L型Ca2+通道的动态观察
目的:对全脑缺血模型大鼠再灌后不同时间点L型Ca2+通道的开放和关闭状态进行动态研究,以进一步揭示缺血性神经元损伤的机制.方法:参照改良的Pulsinelli四血管闭塞法制备全脑缺血大鼠模型,缺血后的大鼠分别在再灌注2、12、24、48、72h后进行皮层神经细胞急性分离,单通道电流经EPC-9膜片钳放大器放大,用Pulsefit+Pulse采集入计算机,用分析软件TAC进行测量.结果:再灌后2、12、24、48、72 h5个不同时间点,大鼠大脑皮层神经元L型Ca2+通道平均开放时间出现两个高峰期,第1次出现在再灌2、12、24 h,第2次出现在48、72 h,较第1次更高;大鼠大脑皮层神经元L型Ca2+通道开放概率出现两个峰值:第1次出现在再灌后2 h(显著高于正常组),至12 h又回落至接近正常水平;第2次出现在再灌24 h.结论:在脑缺血再灌注的不同时点,缺血性损伤对L型Ca2+通道的影响机制即可利用性和开放特性的影响不同.在缺血再灌后的2 h至72 h的各时段,缺血性损伤通过增加L型Ca2+通道的可利用性引起神经元胞内Ca2+超载;在再灌后期(48 h),缺血性损伤则通过增加L型Ca2+通道的开放特性而引起神经元胞内Ca2+超载.
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阿片受体激动剂DPDPE对大鼠神经元缺氧无糖损伤的保护作用
目的 研究δ阿片受体激动剂 DPDPE 对原代培养的大鼠皮层神经元缺氧无糖损伤(OGD)的保护作用并探讨其机制.方法 将大鼠皮层神经元分为4组,共24孔、每组6孔:正常氧浓度组;缺氧组;缺氧+DPDPE(终浓度为100nmol/L)预处理组;缺氧+DPDPE +Naltrindole(δ阿片受体拮抗剂,终浓度为1 μmol/L)预处理组.通过采用 LDH 观察 DPDPE 对于神经元缺氧无糖损伤的保护作用;用Western检测大鼠皮层神经元中 pERK、pp38、Bcl-2 和 Bax 等蛋白表达的变化.结果 (1) 与正常对照组相比,缺氧无糖损伤4h细胞上清液中LDH 水平明显升高(P<0.01),加不同浓度DPDPE预处理后LDH 水平明显降低(P<0.01); 与缺氧无糖组相比,DPDPE 预处理显著增加 pERK 的蛋白表达(P<0.05)且同时降低 pp38 的蛋白表达(P<0.05),该作用可部分的被 Naltrindole 所阻断;与缺氧无糖组相比,DPDPE 预处理显著增加抗凋亡蛋白Bcl-2的表达(P<0.05)且同时降低凋亡蛋白Bax的表达(P<0.05).结论 DPDPE对于大鼠原代皮层神经元缺氧无糖(OGD)损伤具有明显的保护效果,其作用机制与增加pERK,降低pp38的蛋白表达,以及调节Bcl-2/Bax的表达有关.
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数字化录像脑电图和24小时动态脑电图的临床应用
脑电图(EEG)记录的是神经元的生物电,通常我们从头皮记录EEG,所以EEG记录到的主要是大脑皮层神经元群体的生物电.EEG的主要作用①癫痫的诊断、鉴别和疗效评估;②重症脑病的监护;③重症脑病的治疗,如脑水肿治疗中的戊巴比妥昏迷疗法,EEG作为调节戊巴比妥剂量的参考.也作为手术中监护和麻醉深度评估的参数之一;④外科治疗癫痫的术前准备、术中定位和监护;⑤睡眠研究,精神病的诊治等.
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静脉麻醉药物对小脑皮层神经元突触传递及可塑性影响的研究进展
目前认为学习记忆的神经基础为中枢神经系统的可塑性，包括神经网络、神经环路及突触连接等不同水平的可塑性。突触是神经系统内进行信息传递的结构基础，也是神经元之间传递信息的重要环节，是神经可塑性的关键部位。长时程增强（long－term potentiation，LTP）与长时程抑制（long－term depression ，LTD）是突触可塑性的两种表现形式（方向相反），两者的协调表达是学习与记忆能够正常进行的基础。
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汉防己碱对大鼠皮层神经元钙通道的阻滞作用
在急性分离的大鼠大脑皮层神经元上,用膜片钳单通道记录技术研究汉防己碱(Tet)对电压依赖性钙通道的影响.结果表明,Tet 7.5μ mol/L、15μ mol/L和30μmol/L可浓度依赖性抑制大鼠皮层神经元膜L-和N-型电压依赖性钙通道,使其开放时间缩短,关闭时间延长,开放概率降低,从而降低钙内流,其对L-型钙通道的作用与钙通道阻滞剂Verapamil相似但较弱.Tet的多种药理作用可能与其阻滞钙通道有关.
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脑电图和诱发电位在昏迷患儿预后判断的应用研究
昏迷是脑干上行性网状激活系统或大脑皮层神经元广泛受损发生高度抑制的一种状态,其病因复杂,单纯依靠临床表现往往难以对其病情的严重程度和预后做出相对准确的判断.神经电生理的检测被认为是能够对昏迷患儿预后做出准确判断的有效方法[1].有学者指出结合昏迷患儿临床情况、脑部神经影像学检查及神经电生理检查可以获得更客观的评价病情严重程度的标准;同时在昏迷期间重复以上检查能够更好的评估昏迷患儿脑功能状态及预后[2].
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无镁诱导神经元惊厥样放电后Lingo-1对轴突的影响
目的:研究惊厥样神经元模型中含亮氨酸重复序列和免疫球蛋白结构域的Nogo受体作用蛋白(LRR and Ig domain containing,Nogo receptor interacting protein,Lingo-1)对神经元轴突的作用.方法:(1)培养10d的皮层神经元,经正常细胞外液处理(正常组)或无镁细胞外液处理(无镁组)后用免疫荧光技术检测神经元轴突变化.(2)以上两种不同处理后6、12、24、48、72h5个时间点,用qRT-PCR及Western blot检测神经元中Lingo-1表达情况.(3)设计shRNA慢病毒抑制Lingo-1表达,分为正常组、无镁组、无镁+对照shRNA组和无镁+Lingo-lshRNA组4组,用免疫荧光技术检测神经元轴突长度.结果:(1)正常组神经元轴突粗壮、轴突间网络连接较致密,神经丝蛋白200(neurofilament proteins 200,NF200)只在突起表达;无镁组神经元轴突纤细、轴突间网络连接稀疏,NF200在胞体内高表达.(2)各观察时间点上,无镁组Lingo-1的表达量均高于正常组(P＜0.05).(3)在神经元轴突长度上:无镁组小于正常组(P=0.000),无镁+对照shRNA组与无镁组无统计学差异,无镁+Lingo-lshRNA组大于无镁组+对照shRNA (P=0.000).结论:无镁处理后神经元轴突损伤、Lingo-1表达升高,抑制Lingo-1表达后神经元轴突损伤减轻,说明Lingo-1可能参与神经元放电后神经元轴突损伤.
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隐丹参酮对谷氨酸诱导的皮层神经元凋亡的保护作用
目的:观察隐丹参酮(Cryptotanshinone,CTN)对谷氨酸(Glutamate,Glu)损伤体外原代培养大鼠皮层神经细胞的保护作用并探讨可能的机制.方法:体外培养大鼠大脑皮层神经细胞,建立Glu损伤模型,采用MTT法检测细胞存活率,DCFH-DA染色法检测细胞氧自由基水平,Hoechst荧光染色检测细胞凋亡,Western blot检测Bcl-2和Bax的表达.结果:CTN能明显减轻Glu对皮层细胞的损伤,提高细胞的存活率,降低细胞内的活性氧水平,显著上调Be 1-2蛋白表达,减少Bax蛋白表达,抑制细胞凋亡.结论:CTN对Glu损伤神经细胞有显著的保护作用,其机制可能与抑制或清除Glu诱导的细胞内活性氧的生成,调节凋亡相关基因Bcl-2蛋白家族的表达有关.
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大鼠皮层神经元NMDA受体通道动力学特性的发育变化
目的:探讨大鼠发育过程中皮层神经元NMDA 受体通道动力学特性的变化.方法:采用细胞贴附式记录急性分离神经元NMDA受体的单通道电流.结果:新生大鼠皮层神经元NMDA受体通道以20 pS通道开放常见,而且多数是以短开放为主,猝发样开放(burst)为主的长开放通道少见;成年大鼠20 pS通道明显减少,35 pS通道明显增多,并且出现35 pS长开放通道,20、35 pS通道的开放时间和开放概率均明显高于新生大鼠.结论:大鼠皮层神经元NMDA受体通道动力学特性有明显的发育变化.
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皮层感觉信息处理之成像研究——皮层神经元感觉信息输入的树突模式
神经元由胞体、树突和轴突3部分组成.其中树突接收其他神经元轴突通过电信号刺激释放出的神经递质,从而产生信息输入.因此,研究感觉输入的关键是了解感觉信息处理过程中树突接收信息的特点和规律.突触输入中存在多种树突分布和组织处理模式,在离体情况下,目前已提出几种树突组织处理模式:①1个神经元只接受1种特异性的信息传入；②突触传入信息整合沿单个树突分布；③具有同一特征的信息传入聚集在同一树突部分；④传入信息的整合分布于整个树突上.在在体情况下,科学家通过双光子成像技术提出突触信息传入的椒盐型树突组织模式,也就是说,具有相同方向的信息输入分布于整个树突树上,整个树突树作为“运算单元”接收各种感觉信号.换句话说,树突上的树突棘接收不同感觉信号的空间分布是非常不均匀的,即使是同一树突上的相邻树突棘也可以接收和编码不同的感觉信息.在未来,我们需要继续发展超速双光子显微成像技术,以便验证在更深皮层中(＞ 100～300 μm)甚至皮层下的大脑区域是否也存在此类椒盐型组织模式?此外,还需要探索更多的基本问题,例如,信息传入的复杂性是如何决定神经元的传出信号的?树突输入信息组织处理在清醒动物体内是怎样的?
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邻苯二甲酸二酯对胚胎大鼠皮层神经元细胞毒作用
目的 探讨邻苯二甲酸二酯(DEHP)对胚胎大鼠皮层神经元细胞毒作用.方法 取怀孕17～18 d的SD大鼠,分离其胎鼠皮层神经细胞并进行鉴定.分别用MTT试验和激光共聚焦方法,观察DEHP对皮层神经元细胞毒性和胞内钙稳态影响.结果 按照本方法分离得到的皮层神经细胞状态良好,神经细胞纯度符合本实验要求.DEHP作用于皮层神经元后,细胞抑制率随浓度增加而增加,DEHP作用于皮层神经元24 h后,细胞抑制率随浓度增加而增加,IC50为76.5 μmol/L.70 μmol/L DEHP可抑制50 mmol/L KCl引起的钙瞬变.结论 DEHP对原代培养的胚胎大鼠皮层神经元具有细胞毒性,并影响胞内钙稳态.
