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基于Mimox工具分析幽门螺杆菌Catalase模拟表位
目的 利用Mimox软件分析幽门螺杆菌Catalase蛋白模拟表位的性质,并与手工比对结果进行比较.方法 将源于噬菌体随机肽库筛选技术获得的5个Catalase模拟表位输入Mimox网站,参数设定为默认值,进行模拟表位的比对,寻找共同序列并分析其性质.结果 从ClustalW界面比对结果看,氨基酸P、T、S、L、A出现频率较高,通过统计学的方法推导出的共同序列为-[ HST] X[ DST] FRPXA [ TNQ][ LV][FW]T-,其中氨基酸P(80％)和A(60％)的出现频率较高.通过JalView界面推导出的共同序列为-H-DFRP-AT-T-,保守性上氨基酸T(分值8)、P(分值6)、D(分值5)比较高；特性上氨基酸T(分值2.4595077)、P(分值2.235784)、R(分值2.1615076)比较高；共同性(consensus)上氨基酸P(80％)、A(60％)、T(60％)比较高,与先前手工比对得出的结论基本相符.结论 结合噬菌体筛选技术和生物信息学Mimox工具对模拟表位进行分析,可以获得较全面的表位信息.
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呼吸道合胞病毒模拟表位合成肽疫苗的开发
开发诱导呼吸道合胞病毒(RSV)中和抗体的合成肽疫苗是预防RSV感染的有效途径。本文叙述了用针对RSV F蛋白构象表位的单克隆抗体MAb19筛选固相组合肽库，鉴定出与MAb19发生特异性反应的两个序列，并经氨基酸替换试验，提高了与MAb19反应的亲和力。将模拟表位以多抗原肽(MAP)形式免疫Balb／c小鼠，表现出明显的保护作用。
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用噬菌体多肽库筛选日本血吸虫表膜抗原的模拟表位
为探索可用于诊断的模拟表膜抗原.采用纯化的兔抗表膜抗原IgG作探针,免疫筛选噬菌体随机十二肽库,经3轮生物淘洗后,随机挑选30个噬菌体克隆,用ELISA检测其与筛选抗体的特异性结合,选择两个阳性克隆进行DNA序列测定,并用斑点ELISA比较检测正常人和日本血吸虫病患者血清各10份.结果显示,随机挑选的30个克隆中有9个噬菌体克隆与筛选的抗体有特异性的结合反应.DNA测序结果显示,两个阳性噬菌体克隆(携带的抗原表位)所演绎的氨基酸序列与GenBank已知的氨基酸序列无同源性.斑点ELISA结果显示两个抗原表位可被血吸虫病患者血清呈特异性识别.
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噬菌体表达短肽模拟旋毛虫抗原表位及其抗血吸虫保护性免疫研究
目的从噬菌体随机肽库中筛选出模拟旋毛虫特异性抗原表位的短肽分子,探讨其抗血吸虫的交叉免疫保护效果.方法以纯化的旋毛虫感染鼠血清IgG为配基,亲合筛选法富集特异性噬菌体,随机挑取噬菌体克隆用ELISA检测其特异性;混合噬菌体克隆经皮下免疫小鼠3次,攻击感染后第45天剖杀小鼠,观察减虫和减卵效果.结果经3轮筛选,特异性噬菌体得到了有效的富集,第三轮洗脱噬菌体的产量约为第一轮的150倍.随机挑取24个噬菌体克隆经ELISA测定,有21个克隆能与旋毛虫感染鼠血清IgG特异性反应.与对照组相比,混合噬菌体克隆免疫小鼠的减虫率与减卵率分别为42.8%与66.3%(P《0.001). 结论利用噬菌体随机肽库技术可获得模拟旋毛虫特异性抗原表位的短肽分子,这些短肽分子能诱导明显的抗血吸虫的保护性免疫.
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丙肝病毒高变区1相关基因免疫小鼠诱导细胞免疫反应的研究
目的:以真核质粒pcDN3.1(+)为载体携带丙肝病毒高变区1(HVR1)相关模拟表位DNA序列对小鼠进行基因免疫,观察其诱导细胞免疫反应的效果.方法:根据HCV HVR1模拟表位多肽序列,合成DNA序列,并将其连接到pcDN3.1(+)上,构建为pcDN3.1-SP.免疫中分别采用2种剂量pcDN3.1-SP(10μg和100 μg),以及10μg质粒中混合了非甲基化CpG基序(-CpG),以其作为佐剂增强免疫原性,并比较其与100μg剂量的免疫效果.杀鼠、收集血清、分离脾细胞;ELISA法检测小鼠体液中的抗体;脾细胞经混合肽刺激后,用流式细胞仪检测CD8+IFN-γ+细胞;用非放射性MTS法检测细胞增殖反应;以非放射性LDH法检测CTL反应.结果:混合肽体外刺激100μg和10μg-CpG基因免疫小鼠脾淋巴细胞后,T细胞增殖反应明显;脾淋巴细胞中CD8+IFN-γ+细胞增多;并能检测到明显的CTL反应,同时伴有较弱体液免疫反应.结论:合成的模拟表位中可能含有T细胞和B细胞表位;非甲基化CpG基序增强了DNA免疫效果.
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新型MUC1黏蛋白模拟表位原核表达、纯化和鉴定
目的 对新筛选的MUC1模拟表位进行克隆表达、纯化和鉴定.方法 从噬菌体随机12肽库中筛选出新的MUC1的模拟表位,目的基因片段克隆入表达质粒PET-31b(+),转化大肠杆菌BL21(DE3)plysS,IPTG诱导表达,亲和层析纯化,Western blot鉴定.结果 成功构建了重组表达质粒,诱导表达出新的MUC1模拟表位重组蛋白,纯化的目的蛋白在SDS-PAGE上呈现特异的单一条带,Western印迹也检测到目的蛋白特异条带.结论 成功获得了新的MUC1模拟表位表达产物,为其在肿瘤疫苗方面的应用研究创造条件.
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抗日本血吸虫14-3-3蛋白单克隆抗体5C6抗原识别表位的鉴定
目的 采用噬菌体展示肽技术鉴定抗日本血吸虫14-3-3蛋白单克隆抗体5C6的抗原识别表位.方法 将纯化的抗日本血吸虫14-3-3蛋白单克隆抗体5C6作为固相配基筛选噬菌体随机展示12肽库,按照吸附-洗脱-扩增的淘洗过程进行3轮生物淘洗,富集特异性结合的噬菌体颗粒.随机挑取第3轮洗脱的独立噬菌体克隆,分别依次进行噬菌体扩增、基因组DNA抽提和DNA序列分析.选择外源性插入DNA序列完全相同或高度相似的同源性噬菌体,采用ELISA及免疫印迹分析对其免疫反应性作进一步鉴定,以确定单克隆抗体5C6的抗原识别表位.结果 第3轮淘洗物中33个独立噬菌体克隆的DNA测序结果显示,其中25个噬菌体编码外源性插入肽的核酸序列均为5′-CCACCTAGTAGCAGACCGATTCTCAGTCGAAGGAAA-3′,其对应的演绎氨基酸序列为PPSSRPILSRRK,该肽与日本血吸虫信号蛋白14-3-3及自然界其他已知蛋白的氨基酸序列均无同源性.免疫印迹试验证实此短肽可被自然感染的日本血吸虫病人血清所识别,而不与健康人血清反应.结论 本研究成功鉴定了抗日本血吸虫14-3-3蛋白单克隆抗体5C6所识别的模拟抗原表位,并证明该表位为空间构像表位.
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两种方法筛选噬菌体肽库所获日本血吸虫抗原模拟表位的抗原性比较
目的比较两种不同方法筛选噬菌体肽库所获得的日本血吸虫抗原模拟表位的抗原性.方法以日本血吸虫病患者血清免疫球蛋白(Sj-Ig)作为靶分子, 分别以噬菌体12肽库(SjA)和经过蚯蚓免疫兔血清免疫球蛋白(L-Ig)筛选一轮后的噬菌体12肽库(SjB)为原肽库,进行3轮吸附-洗脱-扩增免疫筛选.随机挑取SjA和SjB蓝色噬菌斑各24个, 扩增后用ELISA方法检测其抗原性.结果 24个SjA克隆中有6个可以与Sj-Ig特异结合, 其中A491 nm值较高的2个克隆具有较好的特异性和敏感性;24个SjB克隆中有10个可以与Sj-Ig特异结合, 其中A491 nm值较高的5个克隆具有较好的抗原性.比较SjA 和SjB两组间克隆的抗原性,结果显示SjB的目的克隆具有更好的特异性和敏感性.结论从SjA 和SjB中均筛选到了对日本血吸虫病具有较高潜在诊断价值的抗原模拟表位,提示以异源性抗体结合后的肽库作为原肽库来筛选寄生虫抗原模拟表位是可行的,同时也为从噬菌体肽库中筛选抗原模拟表位提供了一个新的实验方法.
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卫氏并殖吸虫抗原模拟表位的筛选和免疫反应性分析
目的初步探讨卫氏并殖吸虫抗原模拟表位的免疫反应性.方法应用卫氏并殖吸虫病患者血清免疫粗球蛋白(Pw-Ig)筛选噬菌体随机12肽库,对筛选到的抗原模拟表位用ELISA检测其免疫反应性,并与卫氏并殖吸虫成虫抗原(PwA)进行比较.结果获得的6个卫氏并殖吸虫抗原模拟表位(即P5、P6、P7、P8、P13、P16)特异性和敏感性与PwA相比差异均无显著性(P＞0.05),其中P5、P6和P7交叉反应性明显较PwA低(X2＝4.630,P＜0.05),其余则与PwA无明显差异(P＞0.05).结论卫氏并殖吸虫抗原模拟表位对卫氏并殖吸虫病的诊断具有潜在的应用价值,有望代替天然抗原用于卫氏并殖吸虫病的诊断.
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两种不同噬菌体筛选方法所获的卫氏并殖吸虫抗原模拟表位抗原性比较
目的比较从兔抗蚯蚓血清免疫球蛋白(E-Ig)结合后的噬菌体12肽库中和从噬菌体肽库中筛选出的两种卫氏并殖吸虫抗原模拟表位的抗原性.方法 以肺吸虫病患者血清免疫球蛋白(Pw-Ig)作为靶分子,分别对噬菌体12肽库(PwA)和经过E-Ig筛选一轮后的肽库(PwB)进行3轮吸附-洗脱-扩增的淘筛,随机挑取PwA和PwB蓝色噬菌斑各24个扩增,用ELISA方法检测并比较两者的抗原性.结果 24个PwA克隆中有12个可以与肺吸虫病患者血清发生免疫反应,其中A491nm值较高的2个克隆具有较好的特异性和敏感性;24个PwB克隆中有10个可以被卫氏并殖吸虫病患者血清所识别,其中A491nm值较高的2个克隆具有较好的抗原性.结论 从PwA和PwB中均筛选到了对肺吸虫具有潜在诊断价值的抗原模拟表位,提示以异源性抗体结合后的肽库作为源肽库来筛选寄生虫抗原模拟表位是可行的,为研制新型诊断试剂提供了一条新的着眼点.
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利用噬菌体随机肽库筛选Rh (D)血型抗原的模拟表位
目的 从纯化的人抗Rh (D)抗体阳性血清中筛选Rh (D)血型抗原模拟表位.方法 用纯化的多克隆抗Rh (D)抗体血清对噬菌体随机十二肽库进行3轮"吸附-洗脱-扩增"过程筛选,随机挑取噬菌体克隆;用ELISA法检测其特异性及其与抗体的结合能力.提取阳性克隆DNA并进行测序,推导外源多肽的氨基酸序列.凝集抑制试验检测噬菌体展示的多肽对Rh (D)血型抗原结合的模拟作用.结果 经过3轮筛选和相应鉴定后得到6个抗Rh (D)抗体的特异性噬菌体克隆,其中4个克隆展示相同的氨基酸序列为PSQGYVILLDEK,命名为C2,另外2个克隆展示相同的氨基酸序列为TMLNRAHDFSEC,命名为C21.凝集抑制试验结果 表明这两个多肽的噬菌体可以抑制Rh (D)抗原阳性红细胞的凝集作用.结论 多肽PSQGYVILLDEK和TMLNRAHDFSEC可以模拟Rh (D)血型抗原表位.
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卫氏并殖吸虫模拟抗原的血清免疫学诊断价值
目的初步探讨卫氏并殖吸虫模拟抗原模拟的血清学免疫学诊断价值.方法采用ELISA检测,将以噬菌体随机12肽库筛选所获卫氏并殖吸虫模拟抗原与卫氏并殖吸虫成虫抗原(PwA)进行比较实验.结果经噬菌体随机12肽库筛选获得的6个卫氏并殖吸虫抗原模拟表位特异性和敏感性与PwA相比均无显著性差异(P＞0.05),其中3个交叉反应性明显较PwA低 (χ2 =4.630,P＜0.05),其余3个则与PwA无明显差异(P＞0.05).结论卫氏并殖吸虫抗原模拟表位对卫氏并殖吸虫病的诊断具有潜在的应用价值,有望开创一种用于卫氏并殖吸虫病诊断的新方法.
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囊虫抗原模拟表位的筛选和序列分析
目的探讨能否从与兔抗蚯蚓血清免疫球蛋白(E-Ig)结合后的噬菌体12肽库中筛选囊虫抗原模拟表位.方法噬菌体12肽库经过E-Ig筛选1轮后,再以囊虫病患者血清免疫球蛋白(C-Ig)作为靶分子进行3轮吸附-洗脱-扩增, 随机挑取24个蓝色噬菌斑扩增;分析其抗原性及诊断囊虫病的价值;并测定核苷酸序列分析同源性.结果 24个克隆中有17个克隆可与囊虫病患者混合血清发生免疫反应,其中6个A491值较高的克隆ELISA和囊虫抗原Dot-ELISA的抗体阳性率无显著性差异(P>0.05);与其它寄生虫病的交叉反应率明显低于囊虫抗原(P <0.05), 说明所获克隆具有诊断囊虫病的潜在价值.挑选其中2个克隆(C3、C5)测定核苷酸序列,结果显示这两个抗原模拟表位的氨基酸序列具有结构同源性. 结论将E-Ig结合后的肽库作为源肽库经过3轮筛选,得到对囊虫病具有较高潜在诊断价值的抗原模拟表位.
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随机肽库筛选弓形虫特异性抗原表位诱导保护性免疫的研究
目的从噬菌体随机肽库中筛选出模拟弓形虫特异性抗原表位的短肽分子,并探讨其对弓形虫的保护性效果.方法以纯化的弓形虫免疫兔血清IgG为配基,亲和筛选法富集特异性噬菌体,随机挑取噬菌体克隆用夹心ELISA法和Dot-ELISA法检测其特异性,混合4个阳性克隆免疫小鼠,1月后攻击感染,观察小鼠发病时间和死亡时间.结果经3轮筛选,特异性噬菌体得到了有效富集,第3轮洗脱噬菌体的产量为第1轮的167倍,随机挑取27个噬菌体经Dot-Bloting和夹心ELISA法检测,有24个能与弓形虫免疫兔血清及单克隆抗体特异反应.用致死量弓形虫攻击感染经阳性克隆免疫的小鼠,存活时间明显长于对照组.结论免疫筛选噬菌体随机多肽库可获得具有保护性的弓形虫抗原表位,为弓形虫疫苗研制提供了新途径.
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利用噬菌体展示肽库筛选和鉴定沙门氏菌O9抗原的模拟表位
目的用生物素标记沙门氏菌O9单克隆抗体(3-47-O)作为分子探针,从两个九肽噬菌体展示文库中筛选鉴定该抗体所识别的抗原模拟表位,从而为模拟多糖的多肽疫苗或编码该模拟表位的DNA疫苗研制奠定基础.方法与结果经过三轮的亲和筛选,得到了两个能与O9单抗反应的强阳性单克隆扩增物gm62和gm68,其序列分别为SHHVRGGGG和YQKWYLPKS.竞争ELISA实验表明,1010转导单位噬菌体gm68对肠炎沙门氏菌与3-47-O结合的抑制率达到65%,而噬菌体gm62的抑制率仅为20%,且gm68可以诱导产生针对沙门氏菌O9的抗体,而gm62则不能.结论实验结果显示九肽YQKWYLPKS是具有免疫原性的O9抗原模拟表位.
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弓形虫有效抗原表位的筛选及其对小鼠免疫保护性的研究
利用噬菌体随机肽库技术筛选弓形虫抗原的有效表位,并探讨其免疫保护效果.用纯化的弓形虫免疫兔血清IgG对噬菌体12肽库进行三轮筛选,对获得的目的噬菌体用间接ELISA和Dot-ELISA检测其特异性,并对其中的某些克隆进行Western-blot分析和序列测定;用混和噬菌体克隆及强阳性表位克隆免疫BABL/c小鼠,间接ELISA法测定其特异性抗体滴度,攻击感染后观察小鼠存活情况.经三轮筛选,特异性噬菌体得到富集,随机挑取18个克隆经间接ELISA和Dot-ELISA鉴定,有16个克隆能与弓形虫免疫兔血清IgG呈特异性反应.Western-blot分析显示P2克隆能被兔抗弓形虫血清所识别,具有类似于弓形虫抗原的免疫原性,其序列为5′-CTT CAG TTG GAT CGG GCT CCG TTTTGG AAT CAG GGT-3′,与GenBank的弓形虫已知序列无一级结构的同源性;与原肽库对照组相比,P2实验组和P总实验组免疫小鼠均能诱导出较高滴度的IgG抗体,抗攻击感染后小鼠的存活率及存活时间也均高于对照组.利用噬菌体随机肽库技术获得了弓形虫抗原的有效模拟表位,这些表位能诱导对弓形虫的部分保护作用.
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丙型肝炎病毒复合高变区1模拟表位蛋白的免疫原性分析
将丙型肝炎病毒高变区1(HVR1)模拟表位融合基因插入原核表达载体pGEX-4T-1,在大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达,经亲和层析和凝胶过滤层析获得HCV HVR1模拟表位融合蛋白.用Western blot和ELISA检测融合蛋白与HCV抗体阳性血清的结合情况.皮下注射免疫BALB/c小鼠,用ELISA检测小鼠血清中的抗HCV抗体水平及其与天然HCV高变区1合成肽的交叉反应.结果表明融合蛋白能与HCV抗体阳性血清特异结合,融合蛋白与HCV抗体阳性血清的结合频率为71.6%(25/35).融合蛋白免疫小鼠后能有效诱导免疫应答,其诱生的特异性抗体高滴度达104(免疫后第8周),且该抗体能同2条天然HCV HVR1合成肽发生交叉反应.本研究提示,HCV复合HVR1模拟表位融合蛋白在丙型肝炎疫苗的研发中可能具有潜在应用价值.
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应用噬菌体随机肽库技术筛选丙肝病毒NS3抗原模拟表位
以抗-HCV NS3的单克隆抗体作为固相筛选分子,对人工合成的噬菌体随机12肽库进行5轮"吸附-洗脱-扩增"的筛选过程,随机挑取42个克隆,经噬菌 体酶联免疫吸附法(ELISA)鉴定并进行交叉反应实验以及竞争抑制性结合实验,后对所选克隆进行DNA序列分析,以确定HCV NS3抗原的模拟表位.经噬菌体富集后,从随机筛选的 42个克隆中得到11个阳性克隆,确定氨基酸序列XXIXXXXMSNXX为HCV NS3的模拟表位.我们用噬菌体12肽库成功筛选得到HCV NS3的模拟表位,为开展用HCV模拟表位探索HCV的防治研究创造了条件.
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生殖支原体黏附素蛋白模拟表位的筛选和鉴定
目的 制备兔抗重组生殖支原体粘附素蛋白(rMgPa)的多克隆抗体(pAb),以期筛选MgPa的模拟表位.方法 用rMgPa免疫新西兰兔以制备兔抗rMgPa的pAb,以此pAb为靶分子对噬菌体展示随机12肽库进行生物淘洗,随机挑取74个噬菌体克隆进行DNA测序与分析,用ELISA检测噬菌体与pAb结合的特异性. 结果 制备了兔抗rMgPa的特异性pAb,以此抗体为靶分子对噬菌体展示肽库进行生物淘洗后,特异性噬菌体克隆得到了明显富集.经对74个噬菌体克隆所展示的外源性多肽序列进行比较分析,共可大致分为3组一致性的核心序列:P-S-A-A/V-X-R-F/W-E/S-L-S-P,A-K-I/L-T/Q-X-T-L-X-L和K-S-L-S-R-X-D-X-I.ELISA结果说明36个噬菌体克隆能与pAb发生特异性结合,因此,这三组核心序列可能是MgPa的模拟表位. 结论 成功制备了兔抗rMgPa的pAb,并筛选到MgPa的3个可能的模拟表位,为进一步研究Mg的诊断与预防提供一定的实验依据.
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用抗HCV多抗从随机12肽库中筛选抗原表位
目的:用丙型肝炎患者血清中抗丙型肝炎病毒(HCV)抗体从噬菌体随机12肽库中筛选HCV抗原表位.方法:将丙型肝炎患者血清混合,提取纯化的IgG作为固相配基筛选噬菌体随机12肽库,按吸附-洗脱-扩增的淘洗过程进行3轮筛选,随机挑取噬菌体克隆用ELISA法检测其特异性,对4个克隆进行测序.并用ELISA法检测噬菌体克隆的诊断价值.结果:3轮筛选的投入产出比逐轮升高,回收率从(4.6×10~(-4))%增加到(5.3×10~(-2))%,具有良好的富集效果.对从第3轮洗脱物中挑选出的18个克隆进行结合试验,发现所挑的克隆与丙型肝炎患者的多克隆抗体有较强的结合力.其中4个克隆测序显示为同一克隆(命名为C1),其外源插入肽为GSMSPYVRWYTP.用C1检测20例丙型肝炎患者血清的检出率为85.0%.结论:成功地用噬菌体12肽库对丙型肝炎患者血清进行了模拟肽筛选,且得到的模拟肽分子C1具有一定的诊断价值.
