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亚细胞定位PTEN基因真核表达载体的构建与鉴定
目的:构建人野生型亚细胞定位PTEN基因真核表达载体,为进一步研究其抗肿瘤作用奠定基础.方法:以胎盘组织RNA为模板,利用RT-PCR技术扩增H的基因片段.PCR产物与T载体连接,转化大肠杆菌,获得T-PTEN质粒,进行酶切鉴定和测序.以T-PTEN质粒为模板,利用PCR技术将核定位信号(NSL)加入PTEN序列.PCR产物与T载体连接,转化大肠杆菌,获得T-NSL-PTEN质粒.真核表达载体pcDNA3.1及T-NSL-PTEN质粒经EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切后连接,转化大肠杆菌,获得重组载体pcDNA3.1-NSL-PTEN,进行酶切和测序鉴定.结果:重组质粒PUM-PTEN酶切在1 200 bp处见目的片段,与预期结果符合.测序结果显示基因序列与目的基因完全一致;重组质粒PUM-NSL-PTEN酶切在1 200 bp处见目的片段,测序结果显示基因序列与设计一致,核定位信号成功加入;重组质粒pcDNA3.1-PTEN酶切在1 200 bp处见目的片段,测序结果显示基因序列与目的基因相同;重组载体pcDNA3.1-NSL-PTEN经双酶切和测序证实了其正确性EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切在1 200 bp处见目的片段,与预期结果一致.测序结果显示,核定位信号成功加入,其后是阅读框架正确的PTEN基因序列.结论:成功构建可表达亚细胞定位PTEN的真核表达载体pcDNA3.1-NSL-PTEN.
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14-3-3ε蛋白在小鼠卵母细胞减数分裂恢复过程中对Cdc25B定位的影响
目的:探讨14-3-3ε蛋白在小鼠卵母细胞减数分裂恢复过程中对Cdc25 B定位的影响,为阐明14-3-3ε蛋白对小鼠卵母细胞发育的调控机制奠定基础.方法:采用超排卵方法获得3周龄昆明系雌性小白鼠生发泡(GV)期卵母细胞分为未注射组、control siRNA注射组和14-3-3εsiRNA注射组.构建pmax-FP-Red-HA-14-3-3ε表达载体.间接免疫荧光技术检测14-3-3ε蛋白和Cdc25 B在小鼠卵母细胞中的定位;直接免疫荧光技术观测14-3-3ε蛋白和Cdc25B蛋白在小鼠卵母细胞中的亚细胞定位;利用显微注射方法将14-3-3εsiRNA注射入GV期卵母细胞中,相差显微镜下观测卵母细胞的形态表现,计算卵母细胞的生发泡破裂(GVBD)发生率;Western blotting法检测卵母细胞中14-3-3ε蛋白的表达和Cdc2-pTyr15蛋白的相对表达水平;放射自显影检测卵母细胞中成熟促进因子(MPF)的活性.结果:间接和直接免疫荧光实验,野生型Cdc25 B能与14-3-3ε蛋白共定位于细胞质;在GVBD前期,Cdc25B由胞浆穿梭进入细胞核.当Cdc25B蛋白的第321位丝氨酸突变为丙氨酸时,14-3-3ε蛋白的表达水平降低,Cdc25B的胞浆定位被取消.未注射组、control siRNA注射组卵母细胞在显微注射24 h后均未发生GVBD,GVBD发生率组间比较差异无统计学意义(P>0.05);14-3-3εsiRNA注射组在显微注射后22和24 h卵母细胞的GVBD发生率均高于未注射组和control siRNA注射组(P<0.01),显微注射后24 h卵母细胞到达第2次减数分裂中期(MII)的比例高于未注射组和control siRNA注射组(P<0.01).结论:在小鼠卵母细胞减数分裂恢复过程中,Cdc25B的Ser321位点可能是14-3-3ε蛋白调控Cdc25B细胞内定位的具体作用位点.
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肺炎链球菌热休克蛋白ClpE多克隆抗体的制备及其亚细胞定位
目的 制备肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae,S.pn)热休克蛋白(heat shock protein,HSP)ClpE多克隆抗体,并确定ClpE在S.pn表面的亚细胞定位.方法 应用PCR法从S.pn D39中扩增coE基因全长片段,克降入原核表达载体pET28a,转化E coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,经亲和层析纯化重组蛋白.用纯化的重组蛋白免疫BALB/c小鼠,制备多克隆抗体,间接ELISA法测定抗体效价,Western blot法鉴定抗体的特异性.ELISA法分析ClpE在S.pn表面的亚细胞定位.结果 重组表达质粒经PCR、双酶切和测序证实构建正确;表达的重组ClpE蛋白相对分子质量约83 000,表达量约占全菌总蛋白的60％,主要以可溶性上清形式存在;纯化的重组蛋白纯度达90％;制备的ClpE多克隆抗体效价达1∶4 096 000,可与S.pn D39全菌发生特异性反应,S.pn D39在正常生长时可表达ClpE蛋白;ClpE在S.pn表面有表达.结论 成功制备了高效价和特异性的ClpE多克隆抗体,ClpE在S.pn表面可正常表达,为表面蛋白.
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H2O2对Apg-2与BCR/ABL蛋白亚细胞定位的影响
目的 观察H2O2对Apg-2与BCR/ABL蛋白亚细胞定位的影响.方法 用50μmol/LH2O2分别处理BaF3-BCR/ABL、BaF3-MIGR1及过表达Apg-2蛋白的BaF3-BCR/ABL细胞,激光共聚焦显微镜观察细胞内Apg-2、BCR/ABL蛋白的亚细胞定位变化.结果 Apg-2和BCR/~ABL蛋白在细胞中定位于胞浆,H2O2损伤可致Apg-2和BCR/ABL蛋白在BaF3-BCR/ABL细胞中发生核转位,Apg-2蛋白过表达可引起BCR/ABL蛋白核转位.结论 Apg-2蛋白在H2O2诱导的损伤后发生核转位,可能与BCR/ABL蛋白相互作用,保护H2O2诱导的细胞损伤.
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lncRNA的作用机制及其在自身免疫性疾病中的研究进展
lncRNA(long non-coding RNA)是长度大于200个核苷酸的非编码RNA,其能与DNA、RNA和蛋白质相互作用发挥多种生物学功能,包括参与表观遗传调控、细胞周期调控、细胞分化调控和免疫应答等.越来越多的研究表明,lncRNA的表达失调与自身免疫性疾病的发生息息相关.lncRNA作用机制复杂多变、特异性强的特点为其深入研究带来了很多阻碍,目前绝大部分lncRNA的功能和机制仍不明确.已有的研究表明lncRNA的亚细胞定位不同往往涉及不同的作用机制,了解其亚细胞定位与作用机制之间的关联,将推动LncRNA在多种疾病包括自身免疫性疾病中的深入研究.
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PPARγ基因真核表达载体的构建及其在乳腺癌MDA-MB-231细胞中的表达
目的:构建以绿色荧光蛋白(GFP)为报告基因的重组表达质粒pEGFP-C1-PPARγ,观察小鼠PPARγ基因在MDA-MB-231细胞中的表达及定位.方法:采用克隆和亚克隆技术构建小鼠PPARγ基因真核表达栽体,脂质体Lip2000介导转染MDA-MB-231细胞,real-time PCR和western-blot验证其mRNA和蛋白的表达,荧光显微镜观察该基因亚细胞定位.结果:酶切和测序结果证实重组质粒含有PPARγ编码区序列且插入方向正确,转染后观察该基因亚细胞定位于胞核,胞质有弥散分布.结论:成功构建了小鼠PPARγ基因真核表达载体,该基因在MDA-MB-231细胞中成功表达,PPARγ基因主要集中表达于胞核.
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小鼠Rdh13基因的组织表达谱及其亚细胞定位的初步观察
目的:研究视黄醇脱氢酶13(Rdh13)基因在小鼠组织中的表达谱及其亚细胞定位,为其功能研究提供线索.方法:利用生物信息学方法模拟Rdh13的三维结构,采用半定量RT-PCR和Western blot的方法检测小鼠14种组织中Rdh13的表达水平;采用Western blot的方法检测其亚细胞分布;进一步应用免疫荧光共定位的方法观察Rdh13的亚细胞定位.结果:Rdh13具有SDR家族保守的辅酶结合位点(TGX3GXG)和催化活性位点(YX3K);RT-PCR和Western blot实验证实Rdh13在小鼠多种组织中广泛表达,但其表达水平存在一定差异;不同于其它RDHs家族成员,Western blot和免疫荧光共定位提示Rdh13蛋白在细胞中定位于线粒体.结论:Rdh13是一个与Rdh12结构相似的SDR家族成员,在小鼠多个组织中广泛表达;Rdh13蛋白定位于线粒体,有可能作为保护线粒体不受视黄醛毒性作用的屏障.
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HRB2慢病毒表达质粒的构建核蛋白细胞内定位的研究
目的:构建重组HIV-1相关结合蛋白2(HIV-1 rev binding protein 2)基因的真核融合表达质粒plenti-OFP-HRB2,用慢病毒表达系统感染HEKTER细胞.对过表达GFP-HRB2基因的细胞在激光共聚焦显微镜下观察,研究HRB2蛋白在细胞中的分布规律.方法:Trizol法提取人睾丸组织总RNA进行RT-PCR,将纯化的扩增产物HRB2与克隆载体plp-GFP-Cl连接、转化感受态细菌E.coli XLblue.测序正确后将质粒plp-GFP-HRB2与真核表达质粒plenti-Cl分别进行双酶切,连接后转化.将构建正确的plenti-GFP-HRB2重组质粒、△8.91、pvsvg瞬时共转染293T细胞后,用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达.收集包装病毒后感染HEKTER细胞.细胞生长一周后,将细胞铺玻片上用激光共聚焦显微镜观察.结果:构建的plenti-GFP-HRB2真核表达质粒经PCR鉴定及测序均说明人源HRB2基因已与plenti-GFP载体正确重组.瞬时转染293T细胞后能观察到绿色荧光.稳定感染后的HEKTER细胞经激光共聚焦显微镜观察后发现,HRB2蛋白在核仁处富集,在细胞核的其它部位少量分布,在胞浆中几乎没有分布.结论:人源HRB2基因表达的相关蛋白具有一个KH结构域,属于KH结构域家族的成员.稳定表达GFP-HRB2融合蛋白的细胞系的成功构建,为深入研究HRB2的入核机制、HRB2蛋白的在细胞分裂、RNA剪切等生物活动中的作用奠定了重要的实验基础.
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PP2R1A逆转录病毒的构建及对细胞周期的影响
目的:构建重组PP2R1A基因的逆转录病毒感染HEKTER细胞,观察其定位,验证表达,研究过表达PP2R1A对细胞生长及周期的影响.方法:逆转录病毒裁体pMIG-Flag-PP2R1A-IRES-GFP与Pcl10A1瞬时共转染293T细胞,收集病毒感染HEKTER细胞,在荧光显微镜下观察定位,标记荧光单克隆.挑取不同表达强度单克隆做western验证PP2R1A蛋白表达.运用流式细胞分析、体外创伤试验及生长曲线试验研究单克隆细胞的增殖及周期.结果:获得了过表达PP2R1A的单克隆细胞株,PP2R1A在细胞内广泛表达,结合western及细胞试验证实PP2R1A高表达阻滞细胞周期并减慢细胞生长.结论:PP2R1A是丝苏氨酸蛋白磷酸酶PP2A的结构A亚基的a亚型,在细胞内广泛表达.本文成功构建了表达PP2R1A的细胞株,研究发现PP2R1A高表达会影响细胞生长及细胞周期,减缓了细胞增殖.为进一步深入研究PP2R1A对PP2A全酶活性及功能、细胞转化的影响奠定了重要的实验基础.
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NAIF1对肝癌细胞HepG2增殖与迁移能力的影响
目的:在肝癌细胞HepG2中过表达外源NAIF1(核凋亡诱导因子1),探讨NAIF1的亚细胞定位以及对HepG2增殖和迁移能力的影响.方法:以真核表达质粒pEGFP-N1为对照组,pEGFP-N1-NAIF1为实验组,瞬时转染肝癌细胞HepG2,利用免疫印迹方法检测NAIF蛋白表达效率;以DAPI染核,荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白定位,确定NAIF1的亚细胞定位;通过MTT方法绘制细胞增殖曲线;通过transwell小室法检测NAIF1对HepG2迁移能力的影响.结果:在肝癌细胞HepG2中,外源表达NAIF1主要定位于细胞核;与对照组HepG2/pEGFP-N1相比,HepG2/pEGFP-N1-NAIF1的细胞增殖、迁移能力下降(P＜0.05).结论:外源表达NAlF1蛋白定位于HepG2细胞核,过表达NAIF1抑制HepG2的细胞增殖与迁移能力,NAIF1可能作为肝癌治疗的潜在靶点.
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新型荧光探针mMaple3与mEos3.2应用于Fsp27介导脂滴融合的功能研究
目的:Fsp27已经被证明定位在脂滴上并且介导脂滴融合与增大.为研究Fsp27介导脂滴融合的动态分子机制,我们构建了Fsp27-mMaple3和Fsp27-mEos3.2两种新型荧光探针的融合蛋白并研究其对脂滴融合的功能影响,进而为研发Fsp27相关生理功能的光学显像技术奠定基础.方法:对照传统绿色荧光的融合蛋白Fsp27-EGFP,在共聚焦显微镜下观察Fsp27-mMaple3和Fsp27-mEos3.2两种新型融合蛋白的亚细胞定位和介导脂滴融合的功能,并利用荧光漂白恢复术(fluorescence recovery afterphoto-bleaching,FRAP)以判断脂滴与脂滴之间是否存在脂的交换.结果:表达Fsp27-mMaple3和Fsp27-mEos3.2两种新型融合蛋白的细胞中脂滴显著增大;同时,融合蛋白皆集中在脂滴与脂滴的接触位点上,且中性脂的交换实验显示脂滴与脂滴之间可以相互连通.结论:我们建构的两种新型荧光探针融合蛋白Fsp27-mMaple3和Fsp27-mEos3.2保持了Fsp27介导脂滴融合的功能,并为我们进一步研发新型的超分辨光学显像技术提供功能基础.
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Perilipin5基因功能结构域载体的构建及亚细胞定位分析
目的:依据perilipin5的功能结构域,构建含perilipin5截断体的真核表达载体,并研究它们的亚细胞定位.方法:以小鼠肝脏cDNA文库为模板,PCR扩增出perilipin5的全长及功能结构域,将之分别装载入真核表达载体PCMV5中,并引入HA标签.酶切和测序鉴定,脂质体法将构建的质粒转染293T细胞,Western blot验证表达,免疫荧光检测标记HA,于荧光显微镜下观察perilipin5各结构域的亚细胞定位.结果:构建的质粒序列正确,转染细胞后可检测到HA-perilipin5融合蛋白的表达,免疫荧光显示含有1-188aa结构域的perilipin5截断体可定位于脂滴表面,1-188aa一旦缺失perilipin5的截断体则弥散于胞内.结论:包含perilipin5功能结构域的真核表达载体构建成功,perilipin5的1-188aa与其脂滴定位密切相关.
关键词： perilipin5 功能结构域 脂滴 亚细胞定位 -
RPAP3蛋白中TPR结构域的功能研究
目的:构建针对RPAP3 TPR区域的慢病毒载体,观察过表达对细胞周期的影响.方法:通过生物信息学软件比较RPAP3结构域组成,推测功能；分析RPAP3核定位信号,构建瞬时表达质粒pEGFP-N2-RPAP3,激光共聚焦显微镜观察RPAP3蛋白的亚细胞定位；通过酵母双杂交和GST-Pulldown实验研究RPAP3与HSP70的相互作用度作用靶点；构建慢病毒载体pLJM.1 -RPAP3,转染293T细胞,收病毒感染MCF7细胞,嘌吟霉素筛选获得稳定转染细胞系,流式细胞分析对细胞周期的影响.结果:RPAP3在多物种广泛存在,有高度保守性；蛋白存在典型核定位信号,激光共聚焦显微镜下,GFP标记的RPAP3蛋白主要分布在细胞核；酵母双杂交和GST-Pulldown实验证实RPAP3与HSP70间存在相互作用,且作用发生在RPAP3的三联TPR结构域和HSP70的GPTIEEVD末端之间；流式细胞显示RPAP3 TPR区域的高表达阻滞细胞周期且凋亡增加.结论:RPAP3与HSP70间的相互作用发生在RPAP3的三联TPR结构域和热休克蛋白70的GPTIEEVD末端之间；构建高表达细胞株发现其对细胞周期及凋亡有影响.
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肌动蛋白结合蛋白2(Transgelin-2)生物学特性和功能研究进展
肌动蛋白结合蛋白是指能与肌动蛋白的单体、多聚体等结合的蛋白,肌动蛋白结合蛋白2(Transgelin-2)作为一种重要的肌动蛋白结合蛋白,可广泛分布在平滑肌细胞及非平滑肌细胞.Transgelin-2基因可广泛表达在全身各组织器官,其在亚细胞层面上有多种定位,且在不同病理生理状态下可能存在定位转移.Transgelin-2蛋白被认为参与了多种恶性肿瘤疾病,可能是特异性肿瘤标志物.本文对Transgelin-2蛋白的特性、亚细胞定位和相应生物学功能进行了综述,以期为相关机制研究提供可能的判断依据.
关键词： transgelin-2 蛋白特性 亚细胞定位 生物学功能 -
植物细胞外源蛋白亚细胞定位的机制及其应用
为将不同的生理功能区隔化,植物细胞分化出具有特异性结构特征的细胞器.分化的细胞内膜系统和分子水平的蛋白质转运调控机制为外源蛋白亚细胞定位表达提供了显著的有利条件.当蛋白质被加载适当的定位信号或启动子时,蛋白质的分选途径便确定下来,同时决定蛋白质的表达终点.本文根据相关研究主题分析了蛋白质亚细胞定位机制,重点阐述包括ER腔、质外体、液泡、蛋白体等细胞器和内膜结构在内的蛋白定位因素,同时探讨了目前蛋白定位因素的应用情况.本文确定亚细胞定位因素将成为植物基因工程领域控制亚细胞水平表达的重要技术策略.
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结核分枝杆菌Rv2461c基因的克隆、表达、纯化及其抗原性的初步检测
目的:探索结核分枝杆菌Rv2461c基因编码的elpP蛋白作为结核检测抗原的可行性.方法:克隆结核分枝杆菌clpP蛋白的编码基因Rv2461e,构建pET30a-Rv2461c重组质粒,并将其成功的转化到大肠杆菌JF1125克隆栽体中,测序鉴定结果正确.将pET30a-Rv2461c重组质粒转化到大肠杆茵BL21中,表达纯化目的蛋白进行质谱分析.制备clpP蛋白的多克隆抗体,通过亚细胞分离及Western检测分析蛋白的亚细胞定位,纯化的clpP蛋白通过间接ELISA实验进行抗原性的初步检测.结果:结核分枝杆茵clpP蛋白大量存在于细胞质中,少量存在于细胞壁和细胞膜中.重组抗原在检测肺结核病人中的检出率为38.3%(23/60),检测敏感性为38-3%,特异性为90%.结论:为后续深入研究clpP蛋白的生物功能、clpP作为诊断靶标、药靶候选蛋白的可行性提供了基础.
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抗病毒固有免疫分子TRIM22 C端SPRY结构域对其转录、翻译及亚细胞定位的影响
本文旨在探讨TRIM22 C端SRPY结构域对其转录、翻译及亚细胞定位的影响.以野生型TRIM22真核表达质粒为模板,扩增出C端SPRY结构域缺失的TRIM22基因片段,并将其克隆入真核表达质粒pcDNA3.1.将野生型和突变型TRIM22真核表达载体分别转染高分化人肝癌细胞株HepG2.通过反转录-聚合酶链反应检测其mRNA表达水平,蛋白质免疫印迹法(Western blot)检测其蛋白表达水平,并通过间接免疫荧光法检测其亚细胞内定位.结果成功构建了C端SPRY结构域缺失的TRIM22真核表达质粒.转染HepG2细胞后,TRIM22 SPRY结构域缺失突变体在转录和翻译水平上均与野生型TRIM22无明显差异,但TRIM22 SPRY结构域缺失突变体完全丧失了核定位能力,这为进一步研究SPRY结构域在TRIM22抗病毒过程中所发挥的作用及机制提供了有益的启示.
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结核分枝杆菌Rv2629基因产物的亚细胞定位和穿梭质粒转化耻垢分枝杆菌
目的 研究结核分枝杆菌利福平耐药相关蛋白Rv2629在细胞内的亚定位及其与药敏的相关性.方法 采用差速离心进行细胞组分分离及蛋白质印迹法(Western blot)检测初步判定蛋白亚细胞定位;采用pMV261转化耻垢分枝杆菌,BACTEC MGIT 960测定转化菌株的利福平耐受性.结果 Rv2629蛋白主要定位于结核分枝杆菌的细胞壁和细胞膜,重组有Rv2629突变位点191C质粒的耻垢分枝杆菌对利福平的低抑菌浓度(MIC)为160mg/L,相应的携带有野生型基因191A的宿主菌MIC为20 mg/L.结论 Rv2629基因191A/C突变同利福平耐药相关.
关键词： 结核分枝杆菌 Rv2629 亚细胞定位 穿梭质粒pMV261 药敏试验 -
超声结合原卟啉IX对腹水型S180肿瘤细胞的损伤作用
目的:根据原卟啉IX(PpIX)在S180肿瘤细胞内的含量变化及亚细胞定位分析,研究聚焦超声结合PpIX对S180肿瘤细胞的损伤作用.方法:应用荧光分光光度法测定PpIX在S180肿瘤细胞内的富集;激光共聚焦扫描显微镜观察PpIX的亚细胞定位;台盼蓝拒染法检测超声结合不同浓度的PpIX作用后细胞的存活率;环境扫描电镜观察细胞膜表面超微结构变化.结果:PpIX在S180肿瘤细胞内的富集是一个动态变化过程,45 min达到高点,此时为佳声照处理时间点,且此时PpIX主要定位于细胞膜;超声激活PpIX对S180肿瘤细胞的杀伤作用明显大于单纯超声组,其膜损伤程度也更为严重.结论:细胞膜可能是超声激活PpIX作用的一个主要靶点.
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华支睾吸虫ATP合酶b亚基的组织和亚细胞定位
目的 了解华支睾吸虫ATP合酶b亚基(CsATP-synt_B)的虫体组织定位,并以HeLa细胞为替代模型观察其亚细胞定位.方法 用CsATP-synt_B重组蛋白免疫SD大鼠,取其抗血清对华支睾吸虫成虫石蜡切片进行间接免疫荧光染色,观察CsATP-synt_B蛋白在华支睾吸虫成虫组织中的分布.根据生物信息学预测的CsATP-synt_B线粒体转运序列(MTS序列)和核定位序列(NLS序列)位置,设计4组引物[CsATP-synt_B全长序列,以及3个缺失突变体(MTS-缺失线粒体转运序列、NLS缺失核定位序列、MTS-NKS粒体-核定位双缺失)引物],扩增出全长基因和3个突变体基因,构建重组质粒pEGFP-Nl-CsATP-synt_B1-300、pEGFP-Nl-CsATP-svnt_B30-300、pEGFP-Nl-CsATP-synt_B(1-238)+(257-300)及pEGFP-Nl-CsATP-synt_B(30-238)+(257-300).将这些重组质粒用阳离子脂质体转染HeLa细胞,48 h后用激光共聚焦显微镜观察CsATP-synt_B全长基因和3个突变体在HeLa细胞的表达和亚细胞定位.结果 CsATP-synt_B蛋白在华支睾吸虫成虫中分布较为广泛,主要分布在腹吸盘、卵巢、卵黄腺和皮层.绿色荧光蛋白GFP表明CsATP-synt_B全长序列表达于线粒体或细胞核,线粒体转运序列缺失突变体表达于细胞核,核定位序列缺失突变体表达于线粒体.双缺失突变体仅表达于胞浆.结论 CsATP-synt_B蛋白在华支睾吸虫的分布与线粒体的分布一致,主要集中在能量代谢较旺盛的组织部位.CsATP-synt_B蛋白既可进入线粒体,也可进入细胞核,理论预测的定位序列得到证实.
