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胰岛微包囊
目前,1型糖尿病病人越来越多,胰腺供体缺乏和胰腺移植的长期免疫抑制,严重阻碍胰岛移植治疗糖尿病的发展.异种胰岛的免疫隔离可以解决将来大量的移植.用海藻酸钠-聚赖氨酸-海藻酸钠包裹胰岛进行移植可在不使用免疫抑制剂的情况下延长胰岛移植物的存活时间,逆转高血糖.
关键词： 胰岛 微包囊 海藻酸钠-聚赖氨酸-海藻酸钠 微囊形成仪 -
胰岛肝脏移植的研究及现状
胰岛移植是治疗糖尿病的有效手段,其临床应用具有广阔的前景.肝脏具有特殊的解剖和生理特点是胰岛移植的理想部位.
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猪胰岛的分离与纯化
目的 探索大规模猪胰岛细胞分离纯化的方法.方法 联合器官切取,胶原酶P主胰管灌注,COBE2991细胞分离机及HCA-Ficoil纯化猪胰岛细胞.通过双硫腙(DTZ)染色,倒置显微镜下计数胰岛细胞的数量和纯度,胰岛素释放试验检测胰岛细胞的分泌功能.结果 消化后平均每条胰腺可平均获得(275 000±20 895)胰岛细胞当量(IEQ),纯化后平均为(230 350±26 679)IEQ,平均每克胰腺组织可获得(2710±229)IEQ,纯化后胰岛细胞平均纯度为(50.2±1.95)%.纯化后的胰岛细胞对胰岛素释放刺激反应良好,高糖(16.7 mmol/L)时胰岛素的释放量为低糖(3.3 mmol/L)时的4.74倍(P≤0.001).结论 成功建立了猪胰岛细胞分离、纯化的方法,纯化的猪胰岛细胞具有良好的生物活性.
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局部应用缓释免疫抑制剂对胰岛细胞移植的影响
目的 探索局部应用免疫抑制剂对提高移植胰岛细胞的存活率及改善全身不良反应的影响.方法 造模:将链脲霉素按200 mg/kg注射到昆明小鼠腹腔内,48、72 h后测血糖,连续测两次≥20 mol/L作为实验动物糖尿病型.腹腔内移植入胰岛细胞的量为8 000 IE/kg,环孢素用量为1.5 mg/(100 g·d).实验分3组:(1)经胃灌注免疫抑制剂与腹腔内注射微囊化胰岛细胞;(2)单纯腹腔内注射微囊化胰岛细胞;(3)腹腔内注射载有免疫抑制剂的微囊化的活性炭颗粒与微囊化的胰岛细胞.检测移植后大鼠的血糖及病理的变化.结果 1组与3组血糖变化差异无统计学意义(P＞0.05),与2组相比(P＞0.05)差异无统计学意义.局部应用免疫制剂后,胰岛细胞作用时间较对照组长,胰岛周嗣纤维化程度较轻,C肽水平明显高于单纯移植组.结论 与经胃灌注应用免疫抑制相比,局部应用缓慢释放免疫抑制剂的活性碳颗粒效果与之相当,但后者可延长移植胰岛细胞的作用时间并可减轻局部反应.
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胰岛肾联合移植进展
胰岛肾联合移植是目前胰岛移植的主要形式之一,由于其操作简单安全、疗效肯定,近年来受到越来越多的重视.本文就胰岛肾移植中胰岛的来源、移植部位的选择、免疫保护等作一综述.
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胰岛干细胞移植
胰岛细胞的替代治疗是糖尿病治疗的新方向,但由于受到供体来源的限制无法推广.利用干细胞移植分化成为胰岛功能细胞是目前的热门科研项目.本文综述了近年来从胚胎干细胞和成体干细胞分化为胰岛细胞的试验成果.
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微囊化新生猪胰岛异种移植治疗糖尿病大鼠的实验研究
目的观察微囊化新生猪胰岛异种移植对糖尿病大鼠的治疗效果及其对糖尿病并发症的预防作用.方法糖尿病大鼠随机分为3组:①海藻酸钠-聚赖氨酸-海藻酸钠(APA)微囊包膜胰岛移植组;②未微囊包膜胰岛移植组,两组均接受胰岛腹腔移植;③未移植组.定期监测移植后血糖、白内障发生情况.并进行肾脏组织病理学检查,比较各组结果.结果微囊化胰岛移植逆转了糖尿病大鼠的高血糖状态,长达235天,明显长于未微囊胰岛移植组.有效的早期微囊胰岛移植的大鼠未出现糖尿病性白内障及肾小球基底膜改变,而未移植组及未微囊化胰岛移植组大鼠2～3个月后均出现白内障及肾小球基底膜改变.结论 APA微囊能有效保护移植物的体内存活,微囊化新生猪胰岛移植对大鼠糖尿病及其并发症有较好的治疗及预防作用.
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腹腔镜微囊化猪胰岛小网膜腔内异种移植的临床研究
目的探讨腹腔镜技术应用于海藻酸钠-聚赖氨酸-海藻酸钠(APA)微囊包裹猪胰岛小网膜腔内异种移植术的可行性.方法采用腹腔镜技术对5例6人次Ⅰ型糖尿病病人进行了APA微囊新生猪胰岛小网膜腔内异种移植治疗,观察病人移植前后空腹血糖、C肽和胰岛素用量变化.结果全部病例均未出现手术并发症.术后受体C肽较术前升高3～23倍,胰岛素用量明显减少,其中1例完全停用胰岛素,成为胰岛素不依赖者达31个月.结论腹腔镜技术用于临床微囊化新生猪胰岛小网膜腔移植术治疗Ⅰ型糖尿病安全可行、有较高的临床应用价值.
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微囊化猪胰岛肝动脉内移植治疗犬Ⅰ型糖尿病
目的观察放射介入方法行微囊化猪胰岛细胞肝动脉肝内移植的可行性及有效性.方法采用放射介入技术经股动脉穿刺将微囊猪胰岛经肝动脉植入糖尿病模型犬肝内,术后监测空腹血糖、C肽、胰岛素用量变化,行肝功能、肝脏组织病理学检查.结果移植后糖尿病犬血清C肽水平升高2～6倍,胰岛素用量逐步减少,3只犬停用胰岛素并维持空腹血糖正常;移植后肝转氨酶一过性升高,2周后降至正常.结论经肝动脉肝内微囊猪胰岛素异种移植治疗移植Ⅰ型糖尿病犬安全、可行.
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细胞外基质通过调节α3整合素的表达促进小鼠胰岛存活
目的 确定重组基底膜提取物(BME)作为细胞外基质促进体外胰岛存活的分子通路.方法 分离提纯小鼠胰岛并植入BME凝胶体外培养.蛋白印迹法检测Caspase-3,α1、α5整合素,胰岛功能相关蛋白PDX-1,信号传导相关蛋白Akt、FAK、Erk等的表达.结果 研究显示BME可预防胰岛凋亡的发生.和未处理胰岛相比,胰岛植入BME后的Caspase-3表达水平下降和磷酸化Akt表达增加.此外,α3整合素的表达、FAK蛋白水平、磷酸化FAK的表达也显著提高.PDX-1和磷酸化Erk在培养48 h时间点的表达显著增加,显示了BME对体外胰岛保存起到了正性调节的作用.结论 胰岛体外BME包埋培养可以上调α3整合素及其下游信号转导,以提高其生存能力和胰岛细胞的功能.
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瑞典肝移植简介
本人自2000年6月至2001年6月受中国教育部的委托,在瑞典世界著名的Karolinska医学院Huddinge医院器官移植外科进修学习一年,现将所知瑞典肝移植情况简要介绍如下.瑞典位于北欧,风光秀丽,环境优美,人口890万.由于政府实行高税收,高福利制度,公民从出生到死亡均享受免费医疗保障制度,加之人们对器官捐献、器官移植的认可,所以,尽管瑞典国家小,人口少,但器官移植在Groth教授领导下处于世界领先水平,尤其在胰岛细胞移植、肾移植、肝移植方面.
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经腹腔镜微囊化猪胰岛异种移植术
目的探讨腹腔镜技术应用于海藻酸钠-聚赖氨酸-海藻酸钠(APA)微囊包裹猪胰岛小网膜腔内异种移植术的可行性. 方法采用腹腔镜技术对5例6人次Ⅰ型糖尿病患者进行了APA微囊新生猪胰岛小网膜腔内异种移植治疗,观察患者移植前后空腹血糖、C肽和胰岛素用量变化. 结果全部病例均未出现手术并发症.术后受体C肽较术前升高3-23倍,胰岛素用量减少,基中1例完全停用胰岛素,成为胰岛素不依赖者达31个月. 结论腹腔镜技术用于临床微囊化新生猪胰岛小网膜腔移植术治疗Ⅰ型糖尿病安全可行.
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紫外线对大鼠胰岛树突状细胞的影响
目的探讨紫外线对大鼠胰岛树突状细胞(Dendritic cell, DC)结构和功能的影响. 方法分离大鼠胰岛经紫外线照射后利用免疫组织化学(ABC)方法显示胰岛Ia+DC,透射电镜观察其超微结构,同时将处理的胰岛移植于糖尿病小鼠模型. 结果分离胰岛经紫外线照射后内分泌细胞变化不明显,Ia+DC的突起缩短,着色变浅,电镜观察胞质中形成抗原肽-MHC Ⅱ复合物的小泡状结构及吞饮小泡减少,异种移植实验胰岛移植存活期10.54±2.06天,紫外线照射组存活期17.58±1.88天,差异有显著性(P＜0.05). 结论适量的紫外线照射对胰岛内分泌细胞无明显损伤,DC结构受损,功能受到抑制.异种移植实验表明紫外线照射后胰岛移植物存活期延长.
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模拟微重力培养大鼠胰岛的形态学观察
目的应用电子显微镜观察模拟微重力培养对大鼠胰岛形态的影响. 方法将新鲜分离和消化的大鼠胰岛分别进行普通培养和模拟微重力条件培养,应用扫描电镜和透射电镜观察各组大鼠胰岛的大体结构及超微结构的变化,并与新鲜分离的胰岛对照. 结果培养7 d时透射电镜下观察微重力组的胰岛形态类似新鲜组的胰岛,胞浆内有发育良好的分泌颗粒和丰富的线粒体;扫描电镜显示只有微重力组胰岛与胰岛之间形成了许多小洞. 结论模拟微重力培养时,胰岛的形态保持良好.
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新生大鼠胰腺nestin阳性细胞的体外分离、培养和分化的研究
目的探索新生大鼠胰腺nestin阳性细胞体外分离、培养并使之形成类胰岛样细胞团的方法.方法应用胶原酶消化新生大鼠胰腺,将消化的组织碎片培养形成类胰岛样细胞团后传代.免疫荧光细胞化学法检测贴壁细胞胰岛素、胰高血糖素及nestin的表达.RT-PCR检测培养1周的贴壁细胞nestin及细胞角蛋白(CK19)的表达.结果在pH 7.6条件下培养24～36 h有部分细胞贴壁生长,改用pH 7.4无血清RPMI 1640培养液培养18～24d可形成类胰岛样细胞团,传代后可有单层细胞生长.培养24～36 h的贴壁细胞nestin呈阳性,但胰岛素、胰高血糖素阴性,形成的类胰岛样细胞团传代后24 h胰岛素、胰高血糖素呈阳性.培养1周的单层细胞经RT-PCR扩增获得nestin片段,但未获得CK19相应的片段.结论类胰岛样细胞团传代培养后可表达胰岛素、胰高血糖素;胰腺nestin阳性细胞具有胰岛干细胞的特点.
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阻断CXC趋化因子受体3途径对同种异体胰岛移植急性排斥反应影响的实验研究
目的 研究CXC趋化因子受体3(CXC chemokine receptor 3,CXCR3)反义肽核酸(peptide nucleic acid,PNA)对同种异体胰岛移植急性排斥反应的影响.方法 实验模型为小鼠同种异体胰岛移植模型.分为生理盐水对照组,PNA CXCR3组和随机错配PNA组.体外T细胞增殖应答能力通过淋巴细胞增殖反应来评估.应用RT-PCR和Western blot检测CXCR3 mRNA和蛋白表达水平.应用流式细胞仪测定脾CD3+T细胞CXCR3表达水平.结果 与生理盐水组[(6.72±1.48)d]和随机错配PNA组[(6.54±0.86)d]相比,PNA CXCR3组[(9.70±1.57)d]受体有功能胰岛移植物存活时间明显延长.移植后第7天,PNA CXCR3组CXCR3 mRNA水平(1.06±0.07)同生理盐水对照组(1.98±0.22)和随机PNA组(1.87±0.10)比较明显下调(P＜0.01).PNA CXCR3组移植物CXCR3蛋白水平以及小鼠淋巴细胞增殖能力与另两组比较明显降低(P＜0.01).结论 PNACXCR3通过降低T淋巴细胞活性来延长同种异体胰岛移植物存活时间,在抑制同种异体急性排斥反应中具有潜在的治疗效应.
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巢蛋白和神经元素3在人胚胎胰腺中的表达和分布
目的探讨胰腺干细胞标志巢蛋白(nestin)和神经元素3(Ngn3)在人胚胎胰腺组织中的表达及其与内分泌细胞、导管细胞和外分泌细胞标志的共表达情况.方法以因病理因素行药物引产的12周～14周前人胚胎胰腺14例为材料,应用免疫荧光染色和逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测nestin和Ngn3的表达情况,免疫荧光染色检测胰腺内分泌标志胰岛素、胰高血糖素和外分泌标志CK-PAN和CK-19.结果 nestin和Ngn3在12～14周人胚胎胰腺组织均广泛表达.nestin和Ngn3阳性细胞中均无胰岛素及胰高血糖素表达;在胰岛中未见到nestin与Ngn3共表达,但在导管中可见共表达.RT-PCR 结果显示12～14周人胚胎胰腺中均有nestin和Ngn3的表达.结论Ngn3和nestin在人胚胎胰腺未分化细胞中表达,而具有分泌功能的内分泌细胞无表达.
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源于体外培养胰岛中表达Ngn3的细胞是胰腺内分泌前体细胞的新证据
目的评估表达Ngn3的细胞对成体胰岛维护和更新的作用及其意义.方法用6～8周龄的C57BL/6小鼠分离胰岛.胆总管内插管成功后,切除胰腺组织并用浓度为2.5 mg/ml胶原蛋白酶V灌注消化.手工拣取胰岛后, 置于60 mm培养皿内,每个培养皿内含10～12个胰岛,用RPMI-1640(12.5 mmol/L HEPES, 5.2 mmol/L 葡萄糖和 2% 胎牛血清)培养液培养.用A6抗体, 胰岛素抗体,胰高血糖素抗体,Nestin抗体, Ngn3抗体和 5′-溴-2-脱氧尿嘧啶(5-bromo- 2′-deoxy-uridine,BrdU)抗体进行胰岛细胞免疫荧光染色.结果在增殖的胰岛细胞中,只有不到15%的细胞表达Ngn3,其中约有30%以上的细胞同时表达A6.在培养的胰岛细胞中存在表达Ngn3的细胞,这一结果与其他在胚胎发育和成体胰岛中的研究结果一致.本研究发现培养的胰岛细胞中存在同时表达A6和Ngn3的细胞.A6被认为是可分化为胆管上皮细胞的肝脏前体细胞的标记物.胰岛内表达A6的细胞可能来源于成体胰管,并迁移至胰岛内.细胞表达A6的同时表达Ngn3,表明这些细胞在胰岛内可分化为内分泌细胞.结论培养的胰岛细胞中发现共同表达Ngn3 和A6 的细胞,表明胰岛内的4种内分泌细胞可能来源于成体胰岛中的同一内分泌细胞系.A6 和 Ngn3是对胰岛内成体干细胞研究很有帮助的标记物.这可以让我们进一步了解IPC的增殖和分化,并且有可能通过胰岛内成体干细胞来治疗糖尿病.
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成人胰腺干细胞转分化为胰岛的研究
目的通过对成人胰腺干细胞转分化为胰岛过程的研究以便更深入了解及改进胰腺干细胞分离、培养、鉴定方法. 方法成人胰腺组织经胶原酶消化后,用密度梯度离心法将胰腺外分泌细胞、导管上皮细胞和胰岛分离、纯化,导管上皮细胞即具有转分化潜能的干细胞,在体外先后以CMRL1066和无血清DMEM/F12培养液共培养27 d,在培养的不同时间点取样本于光镜和电镜下观察细胞形态学变化及干细胞特异性转录基因PDX-1,CK-19蛋白等单抗的免疫组化染色,并测定培养液中的淀粉酶和胰岛素含量. 结果上述方法可获得大量以往在胰岛分离时丢弃的胰腺导管上皮细胞.经体外一定条件的培养后,第1天即可见 PDX-1,CK-19阳性细胞,胰腺导管上皮细胞迅速分裂增殖并转变为有分化能力的干细胞继而转分化为三维结构的胰岛细胞.培养27 d后,平均每克胰腺组织可生成760个胰岛. 结论成人胰腺的导管上皮具有干细胞潜能并可在体外转分化为大量具有内分泌功能的胰岛,用此方法获得大量的胰岛可能为克服胰岛移植的供体短缺提供一条新的途径.
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成人胰岛大容量分离技术的改进及胰岛功能检测
目的通过对人胰岛分离技术的改进以获得大量高活力胰岛并检测其功能,为利用同种异体胰岛移植治疗1型和部分2型糖尿病提供理论依据和技术基础.方法采用改良的自动分离技术连续分离28例人胰岛,然后用连续性密度样度离心法纯化胰岛.胰岛收获量以国际标准的胰岛当量(islet equivalent,IEQ)表示.胰岛功能的测定分别为体外测定胰岛的胰岛素/DNA比率;静止葡萄糖刺激试验(SGS)及将胰岛移植至糖尿病裸小鼠的体内胰岛功能鉴定并随后进行腹腔糖耐量试验,连续测定移植鼠血糖水平及其体内C肽浓度.结果28例成人胰腺分离的胰岛收获量为5 000～1 030 000 IEQ/胰腺,平均为291 635 IEQ/胰腺,前13例平均每个胰腺收获49 123 IEQ,平均每克组织收获846 IEQ,平均纯度为87%,随着技术的改进后15例的分离结果则分别为:平均每个胰腺501813 IEQ,平均每克组织7 003 IEQ,平均纯度89%.体外胰岛素刺激试验结果表明分离纯化后的人胰岛有正常功能,将12次分离得到的胰岛分别移植至34只糖尿病裸鼠肾包膜下,其中29只糖尿病裸鼠于12 h内血糖恢复正常且糖耐量试验接近正常鼠,血中C肽水平亦接近正常鼠.结论采用改进的人胰岛分离方法,可以获得大量高活力的具有正常功能的胰岛,为同种异体胰岛移植用于临床奠定了必要的实验基础.
