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清开灵注射液体外抗2型登革病毒的作用
目的 研究清开灵注射液(简称清开灵)体外抗2型登革病毒(dengue virus 2,DENV2)的作用.方法 ①稀释清开灵至不同质量浓度(72.000、63.000、54.000、45.000、22.500、11.250 mg/mL),同时稀释利巴韦林注射液(简称利巴韦林,12.500、6.250、3.125、1.563、0.781、0.391 mg/mL)作为阳性对照,生理盐水为空白对照,利用MTT比色法分别检测上述药物对人肝癌细胞HepG2株的细胞毒性作用,并确定各药物的大无毒质量浓度;②分别稀释清开灵和利巴韦林并与DENV2(MOI =0.5)等体积混合孵育30 min后,接种于HepG2细胞,于2、8、24 h后取细胞上清,利用间接免疫荧光(indirect immunofluorescence assay,IFA)检测阳性细胞率和实时定量聚合酶链反应(realtime quantitative polymerase chain reaction,qPCR)检测DENV2基因组表达水平,验证清开灵对DENV2的直接灭活作用;③稀释清开灵或利巴韦林并与DENV2(MOI =0.5)等体积混合后接种于HepG2细胞,2h后收获细胞,利用IFA验证清开灵对DENV2的抑制作用;④DENV2(MOI=0.5)感染HepG2细胞1h后,弃上清加入含清开灵或利巴韦林的维持液,于感染后2、8、24 h收获细胞上清,利用IFA和qPCR验证清开灵直接给药的抗病毒作用;⑤用清开灵或利巴韦林预处理HepG2细胞2h,加入DENV2(MOI=0.5)孵育1h弃上清,再次相应加入清开灵和利巴韦林(维持治疗),于感染后2、8、24 h收获细胞上清,IFA和qPCR验证清开灵预给药联合维持治疗的抗病毒作用.结果 ①清开灵的大无毒质量浓度为11.250 mg/mL,利巴韦林的大无毒质量浓度为1.563 mg/mL;②直接灭活:2、8、24 h,清开灵和利巴韦林检测水平均优于空白对照(P＜0.01),而且清开灵在2h和24h的IFA检测水平均优于利巴韦林(P＜0.01),以及8h和24 h的qPCR检测水平均优于利巴韦林(P＜0.01);③抑制病毒进入:清开灵与利巴韦林的IFA检测均优于空白对照(P＜0.01);④直接给药:药物作用2、8、24 h后,清开灵和利巴韦林不同时相点检测水平均优于空白对照(P＜0.01);⑤预给药联合维持治疗:药物作用2、8、24 h后,清开灵和利巴韦林不同时相点检测水平均优于空白对照(P＜0.01),而且清开灵的不同时相点的IFA检测水平均优于利巴韦林(P＜0.01).结论清开灵具有明显的体外抗DENV2的作用,且以预给药联合维持治疗的给药方式抗病毒作用佳.
关键词： 清开灵注射液 登革病毒 抗病毒作用 间接免疫荧光染色 实时定量聚合酶链反应 -
GM-CSF作为Ⅱ型登革病毒E蛋白免疫佐剂的免疫效果观察
目的 观察粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor, GM-CSF)作为II型登革病毒E蛋白免疫佐剂的保护效果,评估GM-CSF作为蛋白疫苗免疫佐剂的可行性.方法 提取GM-CSF质粒(pCAG-GM)、将表达II型登革病毒E蛋白的重组质粒(E/pGEX-6P-1)进行诱导,表达产物用亲和层析纯化.将BALB/c小鼠随机分为E蛋白组、佐剂组(E蛋白+GM-CSF)和对照组进行免疫,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清抗体终点效价;采用蚀斑减少中和试验(PRNT)检测II型登革病毒中和抗体水平;酶联免疫斑点试验(ELISPOT)检测小鼠免疫后细胞因子的水平;用攻毒试验观察各组小鼠保护率.结果 E蛋白组和佐剂组小鼠血清中抗体终点效价、中和抗体水平均在免疫后有一定的升高,差异无统计学意义(P>0.05);佐剂组细胞因子(IFN-γ和IL-10)水平较E蛋白组均有明显上升,差异具有统计学意义(P<0.05);但攻毒试验显示,佐剂组小鼠全部死亡,生存率为0,而E蛋白组的小鼠保护率为33%.结论 GM-CSF免疫佐剂可抑制II型登革病毒E蛋白的免疫保护作用,其作为蛋白疫苗免疫佐剂仍需慎重.
关键词： 登革病毒 E蛋白 粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 佐剂 免疫效果 -
PCR-RFLP技术用于中国登革2型病毒株基因型快速分型
利用RT-PCR的方法,对中国5株登革2型病毒的prM-E基因进行扩增,选择合适的限制性内切酶将扩增产物特异地切割成若干长度不同的片段,经5%聚丙烯酰胺凝胶电泳后,对获得的银染带型进行分析.结果表明FJ-10株和FJ-11株属同一基因型,D2-43株和D2-44株属同一基因型,D2-04株与上述4株基因型不同,这与核苷酸测序分析结果完全一致.在此基础上建立PCR-RFLP技术用于登革2型病毒基因型快速分型,具有省时、操作简单、不需使用同位素等特点,为登革热疫区实验室和临床诊断提供了一种快速有效的分子生物学方法.
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一种前景广阔的单剂量、四价减毒登革热疫苗候选物
登革病毒( Dengue virus, DENV)的迅速传播在全球范围内造成了巨大的健康威胁,居住在超过100个国家,约占全球40%的人口面临着登革病毒传播的风险,其中包括美国。2010年,全球共报告登革病毒感染案例3.9亿,其中0.96亿出现了感染症状。感染登革病毒会造成一系列临床症状,包括与其他疾病无明显差别的轻微发热、典型登革热或者重症登革热。重症登革热的特征是出血和/或血浆渗漏(登革出血热和登革休克综合征),以及器官衰竭。据估算,每年约有50万重症病例以及2万死亡病例。这些综合征是由4种抗原不同的血清型( DENV-1-4)引起的,它们在西太平洋、南亚、东南亚、非洲、美洲等地区共循环传播。
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登革病毒动物模型的研究进展
登革病毒(dengue virus)属于黄病毒属,是一种以蚊虫为传播媒介的RNA病毒.根据 E 蛋白抗原性的不同,登革病毒被分为四个血清型(DEN-1,2,3,4) [1-2],它威胁着数以亿计的、居住在热带和亚热带地区的人们的健康.
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云南省瑞丽市2013年登革热暴发的分子流行病学研究
目的 调查云南省德宏州瑞丽市2013年登革热(denguefever,DF)暴发疫情的情况,掌握其分子流行病学特点.方法 收集登革热病例资料,采集急性期患者血清标本,用RT-PCR法检测登革病毒(dengue virus,DENV)核酸,并进行登革病毒C/PreM区核苷酸序列测定和分析.结果 2013年8～11月,瑞丽市共确诊登革热232例,其中本地感染病例145例(62.50％),缅甸输入性病例87例(37.50％).2013年瑞丽市登革热本地感染病例发病率为77.69/10万.主要流行地区为瑞丽市城区(53.45％,124/232)、姐告镇(16.81％,39/232)和勐卯镇(8.19％,19/232).经序列测定,获得17株病毒的C/PreM区基因核苷酸序列,系统进化分析表明,5株为登革Ⅰ型病毒,12株为登革Ⅱ型病毒,均与东南亚登革病毒流行株具有较近的亲缘关系.结论 瑞丽市在2013年发生了输入性和本地感染并存的登革热流行,并存在登革Ⅰ型和Ⅱ型病毒共同流行,来自缅甸的登革热输入性病例是引起本次登革热本地流行的主要原因.加强输入性病例的监测和管理是防止该病再次流行的关键措施.
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登革Ⅱ型病毒E蛋白DⅢ区的表达及其免疫反应性鉴定
目的 在大肠埃希菌中表达登革Ⅱ型病毒E蛋白DⅢ结构域,并进行免疫反应性鉴定.方法 用C6/36细胞培养病毒,提取病毒RNA,经RT-PCR扩增获得目的基因片段D2E-DⅢ.双酶切D2E-DⅢ和表达质粒pET-30a(+),经回收纯化后连接构建重组质粒pET30a-D2E-DⅢ.筛选阳性菌落,提取质粒转化BL21 (DE3)感受态细胞,用异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导表达目的蛋白并进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析和Western blot鉴定.结果 RT-PCR扩增得到约300 bp的目的基因片段D2E-DⅢ,双酶切鉴定重组质粒pET30a-D2E-DⅢ位置正确,经测序分析表明插入序列及开放读码框正确.经15％分离胶SDS-PAGE电泳分析,重组菌在相对分子质量为10×10 3附近有明显的诱导表达带,其大小与预测值一致；Western blot结果显示重组蛋白与确诊登革热Ⅱ型阳性血清存在特异性反应.结论 成功地在大肠埃希菌中表达登革Ⅱ型病毒E蛋白DⅢ区,并进行免疫反应性鉴定,结果显示其具有良好的免疫活性.
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登革病毒非结构蛋白NS5研究进展
登革热(dengue fever,DF)是一种主要在热带、亚热带地区流行的蚊媒传染疾病,近年来疫情愈发严重.登革病毒(dengue virus,DENV)非结构蛋白(non-structural protein,NS) NS5是所有黄病毒属蛋白中大也是保守的.DENV NS5具有三种酶活性:甲基转移酶(methyltransferase,MTase)、核苷酸末端转移酶(terminal nueleotide transferase,TNTase)和RNA依赖的RNA聚合酶(RNAdependent RNApolymerase,RdRp).DENV NS5的MTase和RdRp活性在结构和功能上具有鲜明特点,在病毒基因组复制过程起着核心作用,因此NS5蛋白具有成为阻断或抑制病毒增殖靶标的潜力.本文综述了近年来DENVNS5的研究进展.
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登革病毒复制分子机制的研究进展
登革病毒(dengue virus,DV)是登革热(dengue fever,DF)、登革出血热/登革休克综合征(DHF/DSS)的病原体,按血清型分为四型(DV1～4).DV以埃及伊蚊和白纹伊蚊为传播媒介,广泛流行于全球热带及亚热带的60多个国家和地区[1].我国多在广东、广西、海南、台湾等地流行,已分离出所有四型登革热病毒[2].近年来随着全球气候变暖和国际旅游的f增多,DV感染呈扩大蔓延之势,发病率不断升高.
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登革热患者IgM/IgG抗体动力学及相关因素分析
目的 了解我国登革热患者登革病毒IgM/IgG抗体动力学,分析免疫状态与疾病严重程度相关性.方法 应用登革病毒IgM和IgG抗体捕获ELISA法动态检测1371例登革热患者登革病毒特异性IgM和IgG抗体,依据其水平判断患者的初次或二次感染状态.结果 登革病毒IgM抗体水平随着病程进展迅速升高,至发病第6天阳性率即达95%以上,IgG抗体水平上升相对缓慢;初次感染与二次感染发生率分别为75.02%和24.98%;轻症和重症患者二次感染发生率无明显差别;老年患者二次感染发生率(52.79%)显著高于青壮年患者(18.39%).结论 我国登革热患者以初次感染为主,老年患者二次感染发生率高.
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Ⅱ型登革病毒DNA疫苗在小鼠体内免疫保护作用与性别相关性的研究
目的 探讨Ⅱ型登革病毒DNA疫苗pVAX1-D2ME对不同性别小鼠的免疫保护效果的差异.方法 利用pVAX1-D2ME质粒分别免疫雄性和雌性小鼠,每次免疫前及末次免疫后取其血清,检测体液免疫应答的各项指标;并于末次免疫后两周攻毒,观察小鼠的生存率.结果 不同性别小鼠对该疫苗均产生良好的免疫应答,免疫应答具有Th1趋向性;且免疫后不同性别小鼠均可抵抗致死量病毒的攻击,生存率为100%.结论 小鼠性别对免疫应答和免疫保护无明显影响,pVAX1-D2ME免疫小鼠能够诱导产生良好的免疫应答和免疫保护作用.
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重症登革热二例
登革热是由登革病毒引起，经伊蚊传播的一种急性传染病，其主要临床特点为突起高热、头痛、全身肌肉关节痛、极度乏力、皮疹、白细胞和血小板减少。多数登革热患者为轻症病例，极少数为重症，表现为：（1）严重出血：包括皮下血肿、呕血、黑便、阴道流血、肉眼血尿、颅内出血等。（2）休克。（3）重要脏器功能障碍或衰竭：如心肌及肝脏损伤、急性呼吸窘迫综合征、急性肾功能衰竭、脑病（脑炎、脑膜脑炎）等。现对两例重症登革热病例进行报告。
