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DV2 NGC株感染BALB/C小鼠后IL-4、IFN-γ产生动态的研究
目的: 观察2型登革病毒NGC株感染BALB/C小鼠后其IL-4、IFN-γ产生动态,研究登革病毒感染的免疫机制.方法: 用不同含量的DV2 NGC株经皮下多点注射,间接ELISA法测定感染后不同时间各组小鼠血浆IL-4、IFN-γ含量.
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贵州自然界白纹伊蚊体内登划病毒带毒情况
目的:利用细胞、分子生物学技术对贵州省自然界白纹体内带登革病毒(DEN)情况进行调查.方法:采集贵州省9个地(州)市共计18个县(区)白纹伊蚊幼虫标本,饲养为成蚊;
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DV2 NGC株感染BALB/C小鼠后IL-4、IFN-γ产生动态的研究
目的: 观察2型登革病毒NGC株感染BALB/C小鼠后其IL-4、IFN-γ产生动态,研究登革病毒感染的免疫机制.方法: 用不同含量的DV2 NGC株经皮下多点注射,间接ELISA法测定感染后不同时间各组小鼠血浆IL-4、IFN-γ含量.结果: DV2 NGC株感染小鼠产生IL-4和IFN-γ动态不同.初次感染早期,IL-4水平明显升高,而IFN-γ处于较低水平;再次感染后第1天,IL-4水平达高峰(4 294.668±349.038)pg/ml,IFN-γ则于第4天和第11天达较高水平,两者的产生彼消此长,且产生动态与感染病毒量有关.结论: DV2 NGC株感染早期,体液免疫和细胞免疫相互影响,体液免疫占主导作用,为Th2应答优势.但在登革热感染后期,细胞免疫一定程度抑制Th2应答,使病情好转.
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贵州自然界白纹伊蚊体内登革病毒带毒情况
目的: 利用细胞、分子生物学技术对贵州省自然界白纹伊蚊体内登革病毒(DEN)带毒情况进行调查.方法: 采集贵州省9个地(州)市共计18个县(区)白纹伊蚊幼虫标本,饲养成蚊;制备蚊悬液,碘化钠法提取RNA,用DEN NS1基因区通用引物经逆转录-聚合酶链反应(TR-PCR)检测DEN核酸,限制性内切酶酶切鉴定阳性PCR产物并分型;蚊悬液接种C6/36细胞进行病毒分离,制作细胞片,间接免疫荧光法检测DEN抗原.结果: 从独山县麻尾镇白纹伊蚊标本中分离到1株DEN-2型病毒,从凯里、黄果树和镇远3处地方株白纹伊蚊体内检测出DEN核酸,用抗DEN1～4型单克隆抗体经间接免疫荧光(IFA)和RT-PCR产物酶切分型鉴定,分别为登革病毒2型、4型.结论: 贵州省存在DEN感染的自然循环.
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登革病毒2型感染BALB/c小鼠的IL-4、IFN-γ产生动态观察
目的: 探讨登革病毒2型(DEN2)临床分离株感染BALB/c小鼠后其血浆中IL-4、IFN-γ产生动态及相关关系.方法: 用不同剂量DEN2临床分离株经皮下多点注射,建立BALB/c小鼠感染模型,并用双抗体夹心ELISA法检测感染后不同时间各组动物血浆中IL-4、IFN-γ浓度.结果: DEN2感染可使BALB/c小鼠产生IL-4、IFN-γ增加(P＜0.05),且细胞因子浓度与病毒感染剂量有关.初次感染阶段两者水平均有升高,而再次感染阶段以IL-4升高为主.结论: 在初次感染阶段TH1/TH2应答均发挥重要作用;而再次感染阶段以TH2应答为主.
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埃及伊蚊与白纹伊蚊传播登革病毒的研究进展
登革病毒(DEN-V)感染已成为热带和亚热带地区的一个严重的公共卫生问题.据统计,全球约有25亿人生活在登革热流行的高危地区,每年约有1亿登革病毒感染者,其中45万例属于登革出血热-登革休克综合征(DHF-DSS).1978年以来,我国两广以及海南岛地区先后出现了登革热(DF)流行,[1,2].
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登革病毒致病相关因素与体液免疫机制研究进展
登革病毒(Dengue virus,DEN)属黄病毒科、黄病毒属的一个血清学亚群,包括四个不同血清型(DEN1～DEN4).是能引起人类发生从自限性的类似流感样综合征的登革热(dengue fever,DF)到严重威胁生命的登革出血热(Dengue hemorrhagic fever,DHF)及登革休克综合征(Dengue shock s yndrome,DSS)的病原体.近年来登革病毒感染在全世界范围内播散,但对登革病毒的确切致病机制仍不清楚.许多资料提示:病毒自身结构及毒力变化与宿主免疫系统状态在疾病的发展中起重要作用,但目前对登革病毒致病的确切机制尚不清楚.本文主要从病毒致病相关因素与宿主体液免疫功能相互关系的研究进展作一综述.
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2型登革病毒非结构蛋白NS3的表达及其相互作用蛋白的纯化
目的 构建2型登革病毒(DENV2)非结构蛋白3(NS3)与亲和标签融合蛋白的表达质粒,串联亲和纯化(TAP)法获得与NS3相互作用的蛋白.方法 根据DENV2基因序列,设计引物;以DENV2 cDNA为模板,PCR扩增出NS3基因,经酶切后克隆至含有串联亲和标签(FLAG-StrepⅡ)的哺乳真核表达载体pCI-SF,获得重组表达质粒pCI-NS3-SF;将上述重组质粒通过转染试剂LipofectamineTM 2000瞬时转染进入HEK293T细胞,Westem blot法验证NS3融合蛋白的表达;通过TAP法分离纯化与NS3相互作用的蛋白.结果 成功构建了NS3融合蛋白表达载体,利用TIAP系统分离得到与NS3蛋白相互作用的宿主蛋白.结论 串联亲和纯化法可以有效的分离与DENV2 NS3相互作用的细胞蛋白.
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登革病毒感染对人血管内皮细胞PGIS表达及PGI2分泌的影响
目的:研究登革病毒感染对人血管内皮细胞分泌血管活性物质前列环素(PGI2)的影响, 以了解登革出血热/登革休克综合征(DHF/DSS) 的发病机制.方法:用登革病毒Ⅱ型感染人脐静脉内皮细胞(HUVEC), 于感染后6、 12、 24、 48、 72、 96 h, 分别收集病毒感染的HUVEC, 用RT-PCR检测细胞内前列环素合酶(PGIS)mRNA的水平;分别收集病毒感染的上清液, 用放射免疫检测法测定PGI2 的含量.结果:登革病毒感染可使PGIS mRNA 的水平增高, 导致HUVEC分泌PGI2的量明显升高.在病毒感染后48、 72、 96 h, 与对照组比较HUVEC表达PGIS mRNA的水平和HUVEC 分泌PGI2 的量明显升高(P＜0.05).结论:DV2感染可显著上调HUVEC中PGIS mRNA 转录及PGI2 的分泌, 导致登革病毒所致血管内皮细胞的功能障碍, 可能与DHF/DSS的发病机制有关.
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人IL-6、TNF-α对登革病毒感染人树突状细胞的影响
目的: 探讨IL-6和TNF-α对登革病毒感染人树突状细胞(DC)的影响.方法: 从人外周血中常规分离单核细胞,以GM-CSF和IL-4诱导成DC并进行形态学特征、细胞表型和淋巴细胞刺激能力的鉴定.用不同浓度的IL-6、TNF-α作用于Ⅱ型登革病毒 (DV2)感染的DCs,于感染后6、24、48、72、96 h收集上清,采用甲基纤维素微量病毒空斑法检测病毒的滴度,以MTT比色法测定IL-6和TNF-α对DV感染DC及正常DC数量的变化.结果: 中、低浓度的IL-6对DC中DV2的增殖均有增强作用;高、中浓度的TNF-α对DC中DV2的增殖具有抑制作用.IL-6和TNF-α对DV感染DC及正常DC数量无明显影响.结论: IL-6和TNF-α通过对DC的影响在DV2感染中具有重要作用.
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由构建的基因组全长cDNA所回收的我国登革2型病毒株的鉴定
目的由构建的病毒基因组全长cDNA回收具有感染性的我国登革2型病毒株,为进一步阐明登革2型病毒的致病机制及其新型疫苗的研制奠定基础.方法用SP6 RNA聚合酶系统制备我国登革2型病毒(D2-43)株基因组全长cDNA的体外RNA转录物,纯化后经电穿孔法转染C6/36细胞,观察致细胞病变作用以判断其感染性.从病变的细胞和培养上清中提取总RNA,通过RT-PCR扩增及克隆测序的方法证实细胞病变确为RNA转录物感染所致.同时收集可产生细胞病变的培养上清,再感染C6/36细胞以进一步证实所回收的登革2型病毒感染的稳定性.结果以我国D2-43病毒株基因组全长cDNA为模板制备的体外RNA转录物可使C6/36细胞产生病变,从病变细胞和培养上清中可扩增获得病毒特异的基因片段.在培养细胞中进行连续传代仍可产生细胞病变作用.结论构建的我国D2-43株基因组全长cDNA的体外RNA转录物对传代蚊细胞具有感染性,表明可产生完整的病毒颗粒.本研究可为阐明登革2型病毒的致病机理及探索新的预防和治疗措施奠定基础.
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抗Ⅳ型登革病毒NS1单克隆抗体的制备及特性鉴定
目的:研制Ⅳ型登革病毒(DENV-4)非结构蛋白1(NS1)特异性的单克隆抗体(mAbs),并鉴定其特异性.方法:在表达具有良好抗原性的重组DENV4-NS1蛋白的基础上,用重组DENV4-NS1蛋白和灭活的DENV-4免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞进行融合,用间接ELISA法筛选阳性的杂交瘤细胞,并结合免疫荧光测定法(IFA)和Western blot分析对mAb的特异性进行鉴定;通过竞争抑制试验对mAb识别的抗原位点进行分析.结果:获得15株特异性针对DENV4-NS1的mAbs,与其他3型DENV的NS1不产生交叉反应.mAb的Ig亚类测定均为IgG1.竞争抑制试验显示,15株mAb8存在2个不同识别抗原位点.结论:成功地获得特异性针对DENV4-NSI蛋白的mAbs,为进一步研究DENV4-NS1蛋白的结构与功能及研制DENV-4的临床诊断试剂奠定了基础.
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我国D2-43株PrM-E基因的复制型载体质粒DNA的免疫原性研究
目的通过观察含我国登革2型病毒株(D2-43)的PrM-E基因的复制型SFV重组质粒DNA的免疫原性,为登革新型疫苗的研制提供依据.方法将PrM-E基因自T载体上切下,插入复制型SFV病毒载体质粒DNA中.将此重组质粒DNA以电穿孔法导人BHK21细胞,表达产物的特异性用间接免疫荧光法进行鉴定.采用去除内毒素的质粒提取试剂盒制备重组质粒DNA,然后以不同剂量通过肌肉注射途径免疫Balb/c鼠,鼠血清中的抗体用间接免疫荧光法进行检测.结果含PrM-E基因的重组SFV质粒DNA在BHK21细胞中可表达登革2型病毒的特异蛋白;经免疫Balb/c鼠后,鼠血清可与登革D2-43感染的C6/36抗原片起特异的抗原抗体反应.结论含登革2型病毒PrM-E基因的复制型SFV病毒载体质粒DNA在Balb/c鼠中可诱导登革2型病毒特异抗体的产生,但抗体水平较低.
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319例登革热临床观察及护理
登革热是由伊蚊传播登革病毒引起的急性传染病，其临床特点为急性起病，发热，全身肌肉、骨、关节痛，极度疲乏，皮疹，淋巴结肿大及血液白细胞、血小板减少[1]。近年来，由于厄尔尼诺现象的影响，登革热在东南亚一些国家肆虐流行，本病已成为仅次于疟疾的重要热带传染病，曾在世界各地发生过多次流行，有近20亿人口受到感染的威胁[2]。2014年夏秋季节，广州地区暴发登革热疫情。我院于2014年5月~12月共收治登革热患者319例，现总结如下。
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登革病毒受体的研究进展
登革病毒(Dengue virus,DENV)是登革热(DF)、登革出血热和登革休克综合征(DHF/DSS)的病原体.根据包膜蛋白的抗原性的不同,DENV可分为4个血清型,即DENV1～4.由于血清型比较复杂,目前关于病毒受体仍未得出明确一致的结论.但近几年取得了一些引人注目的进展,比如研究发现甘露糖受体(MR)、CLEC5A等作为DENV的受体,可能在病毒进入宿主细胞过程中发挥重要作用.为此,就近几年关于DENV受体以及病毒进入细胞的机制作一综述.
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登革病毒疫苗研究进展
登革病毒属黄病毒属,可通过蚊虫传播,感染人体后可引发一系列临床症状,从轻微发热到严重的并发症,称为登革热、登革出血热以及登革休克综合征.过去50年,全球登革热感染病例增加了约30倍.目前,全球热带、亚热带地区约占世界2/5的人口存在感染风险.由于缺乏有效的治疗药物,疫苗研究已成为登革热疾病防控的重心.然而,由于缺乏对病毒致病机理及病毒感染免疫应答深入的了解,候选疫苗的研发受到阻碍.但经过几十年的努力,疫苗研究取得了明显进展.目前正在研究的登革病毒疫苗依托各种技术平台,种类多样,对正处于临床前研究及临床试验阶段的不同类型疫苗进行阐述.
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登革病毒ADE发生机制的研究进展
在登革病毒致病机理中,抗体依赖增强感染效应( Antibody-dependent enhancement,ADE)占据重要地位,可能在人体二次感染登革病毒后引起严重疾病.对近年来重症登革病毒感染作用机制研究中常用的细胞系、动物模型、ADE对于病毒进入宿主细胞的促进作用以及ADE引起的细胞因子变化等方面的研究进展进行了综述.
关键词： 登革病毒 抗体依赖增强感染效应(ADE) 动物模型 细胞因子 -
登革病毒进化遗传学与毒力关系研究进展
登革病毒感染是世界上流行的虫媒病毒性疾病之一,致病机制尚不清楚.登革病毒的进化遗传学研究发现,其基因多样性正在增加,导致产生大量不同毒力的病毒株,这意味着人类将受到更多样的致病性登革病毒的攻击.此研究成果为强毒力病毒理论提供了依据.
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登革疫苗研究进展
登革病毒是一种危害较严重的病原体,在世界范围内的流行颇为频繁,然而目前仍设有安全有效的疫苗.近年来,人们对传统疫苗(灭活疫苗、减毒疫苗和亚单位疫苗)及新型疫苗(cDNA疫苗、嵌合体疫苗和DNA疫苗)的研究已取得了一定的成果.本文就这方面的进展作一综述.
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Ⅱ型登革病毒NS1蛋白的表达及其免疫血清的制备
目的 原核表达、纯化II型登革病毒NS1A蛋白(NS1蛋白1～180氨基酸即DENV2 NS1A),将其免疫动物制备免疫血清并鉴定.方法 构建重组融合质粒pET22b-p64K-L-DENV2 NS1A,转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,IPTG低温诱导表达.表达的融合蛋白经Hitrap Talon crude柱亲和层析纯化后,免疫雌性日本长耳兔获得抗DENV2 NS1A兔抗血清,用Western blot和免疫荧光检测免疫血清对重组麻疹病毒MV(S191)-DENV2 NS16Xhis的识别和结合特性.结果 重组融合质粒pET22b-p64K-L-DENV2 NS1A经双酶切和测序证明构建正确.表达的重组融合蛋白相对分子质量为100000,纯化后蛋白纯度在85％以上,免疫获得的抗DENV2 NS1A兔抗血清可识别重组病毒MV(S191)-DENV2 NS16XHis表达的DENV2 NS1蛋白.结论 原核表达并纯化了DENV2 NS1A蛋白,建立了基于NS1蛋白的重组病毒MV(S191)-DENV2 NS16XHis的Western blot和免疫荧光检测方法,为登革热疫苗研制中重组病毒MV(S191)-DENV2 NS16XHis的质检奠定了基础.
