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登革1～4型病毒prM-E基因的双价和四价重组质粒DNA在小鼠中的免疫原性观察
目的在鼠模型中观察登革(DEN)病毒双价和四价重组质粒DNA的免疫原性,为登革多价DNA疫苗的研究奠定基础.方法采用可去除内毒素的试剂盒大量提取质粒DNA.将双价质粒DNA及将它们配伍后再与鼠源GM-CSF进行联合免疫,免疫途径采用肌肉注射,并加以电刺激,以提高质粒DNA的摄入效率.于初次免疫后第2和4周各加强免疫1次.然后在小鼠中分别测定针对登革1～4型病毒的体液和细胞免疫应答水平.采用间接免疫荧光法和中和试验测定血清抗体效价,细胞免疫应答水平通过测定脾淋巴细胞的增殖指数和其分泌的IFN-γ浓度进行评价.细胞浸润实验通过对免疫部位的肌肉进行HE染色确定.结果小鼠在初次免疫后第4周即开始产生针对DEN1～4型病毒的抗体,随着时间的延长,抗体效价逐渐上升.第14周中和抗体效价高达1∶32.淋巴细胞的刺激指数及其分泌IFN-γ的浓度均显著高于对照组.GM-CSF对体液免疫应答有促进作用,但对细胞免疫应答无显著的促进作用.结论本研究所构建的双价和四价重组质粒DNA在鼠模型中具有较好的免疫原性,这为登革多价DNA疫苗的研究奠定了基础.
关键词： 登革病毒 DNA疫苗 免疫原性 粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 -
登革3型病毒prM-E和NS1多基因重组质粒DNA免疫原性增强效果观察
目的观察登革3型病毒的prM-E和NS1基因重组质粒DNA混合免疫对免疫原性的增强作用,为登革DNA疫苗混合免疫提供实验依据. 方法将登革3型病毒的prM-E和NS1基因重组质粒DNA分别混合及单独免疫BALB/c小鼠,采用中和试验及MTT法检测免疫小鼠血清中和抗体及脾细胞特异性CTL(cytotoxic T-lymphocytes)杀伤率. 结果混合重组质粒DNA免疫组与单一prM-E基因重组质粒DNA免疫组均在末次免疫后第14天检测到中和抗体,在第33天达到高峰,为1∶32.在末次免疫后第41天,当效靶比为40∶1时,混合重组质粒DNA免疫组的特异性CTL杀伤率为15%,而2个单质粒DNA组分别为10.9%和12.4%. 结论重组质粒DNA混合免疫可同时诱发小鼠产生体液免疫和细胞免疫,而且细胞免疫应答具有一定的增强作用,但没有出现特异性CTL杀伤率的协同增强效果.
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登革病毒非结构蛋白NS4A的克隆表达及与其相互作用蛋白质的亲和纯化
目的 克隆表达登革病毒非结构蛋白NS4A,分离纯化与其相互作用的细胞蛋白.方法 用特异性引物PCR扩增出FLAG-NS4A-HA基因片段,克隆至真核表达载体pSG5中,将重组质粒通过脂质体法瞬时转染入A549细胞,并通过Western blot检测NS4A融合蛋白的表达情况.利用串联亲和纯化系统(TAP)纯化分离与NS4A相互作用的蛋白,Western blot技术及银染SDS-PAGE验证NS4A蛋白复合物的纯化和分离情况.结果 成功构建NS4A蛋白融合表达载体和FLAG、HA串联亲和纯化系统,SDS-PAGE和银染结果显示TAP系统分离得到了NS4A蛋白带和2条可能与NS4A相互作用的蛋白质片段.结论 成功分离纯化与NS4A相互作用的细胞蛋白,为进一步研究机体抗登革病毒感染的机制奠定了基础.
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2006-2007年广东省登革病毒Ⅰ型分离株E基因序列的分子进化
目的 揭示广东省2006-2007年各地登革病毒流行株的遗传关系,探讨其可能来源.方法 收集广东省2006年5个流行区、2007年4个流行区登革毒株和近几年广东省分离的登革病毒流行毒株,设计覆盖登革Ⅰ型病毒E(包膜蛋白)基冈的3对扩增片段瓦相嵌套的引物,应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)进行扩增,扩增产物纯化后直接进行序列测定,所得序列经拼接成E基因全长序列后,同时与GenBank上扶得的登革Ⅰ型病毒E基因序列一起,用MEGA 4.1软件进行分析.结果 2006年广州流行株来源于越南;阳江、南海流行株来源于阳江本地;汕头、潮州流行株来源于新加坡.2007年流行株都来源于新加坡.结论 广东省2006年发生的登革热疫情来源多样,而2007年疫情来自同一源头,近几年广东省流行的登革病毒主要来源于东南亚等国,但在广东省局部地区已形成地方性流行.
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应用长链RT-PCR法扩增我国登革2、4型病毒株全长cDNA
目的采用长链RT-PCR技术扩增登革2型及4型病毒基因组全长cDNA,为构建登革病毒全长cDNA克隆、表达,深入阐明致病机理及探索新型疫苗奠定基础. 方法根据已测定的登革2、4型病毒全基因组序列,设计上下游引物.从感染登革病毒的乳鼠脑中提取病毒基因组RNA,采用长链RT-PCR技术进行扩增.为检验扩增产物的特异性,以PCR产物为模板扩增覆盖基因组的10个片段.将含有复杂二级结构的5′非编码区的扩增片段,在377A型自动测序仪进行序列分析. 结果扩增出登革2、4型病毒基因组全长近11kb cDNA分子,非编码区测序结果表明扩增产物为登革2、4型病毒所特有. 结论利用长链RT-PCR首次成功扩增出登革病毒全长cDNA分子.
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登革2型病毒海南分离株全长E基因的测定与分析
目的测定我国登革2型病毒海南分离株E基因的全序列,并分析其病毒学特性和分子进化特征. 方法运用RT-PCR法扩增我国登革2型病毒海南分离株(D2V-HN89)E基因,测序并用计算机分析序列,作毒株感染细胞及乳小白鼠试验. 结果 D2V-HN89株E基因核苷酸全长1?464bp,核苷酸和氨基酸序列与D2V-NGC株的同源性分别为95%和98%,系统树分析显示其与登革2型牙买加株及登革2型巴西90株的亲缘关系近.D2V-HN89株的细胞病变效应与D2V-NGC株相同,但对乳小白鼠神经毒力较弱. 结论 D2V-HN89株的E基因区有缺失,该流行毒株可能来源于牙买加或巴西登革热流行区.
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登革病毒在白纹伊蚊细胞内免疫的研究
目的研究白纹伊蚊对登革病毒产生细胞内免疫现象的分子机制. 方法扩增与克隆登革病毒NGC株的前膜蛋白基因prM,将prM基因以3种不同表达形式重组入昆虫表达载体pBhspEGFP,以3种重组质粒分别转染白纹伊蚊C6/36细胞,测定转染后的细胞对登革病毒感染的免疫效果. 结果构建了包含prM基因的3种昆虫表达载体,Western blot和荧光显微镜观察证明在C6/36细胞中成功表达了prM-EGFP融合蛋白.MTT实验和空斑形成实验反映了C6/36细胞对登革病毒产生了细胞内免疫. 结论 3种重组质粒均可诱导细胞内免疫现象,说明无论是否表达prM蛋白,只要有prM基因转录就可引起细胞内免疫现象;prM基因正义和反义转录形式均可诱导细胞内免疫;其形成机制可能是通过RNA干扰作用而产生.
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我国登革2、3、4型病毒全长cDNA体外RNA转录体的感染性研究
目的研究我国登革2、3、4型病毒全长cDNA体外RNA转录体的感染性,为构建登革病毒的感染性克隆、深入阐明病毒的致病机理奠定基础. 方法以我国登革2、3、4型病毒基因组全长cDNA为模板,用SP6 RNA聚合酶系统制备体外RNA转录体,经电穿孔转染细胞,观察其致细胞病变效应.从病变细胞培养上清中提取总RNA,用病毒特异引物进行RT-PCR扩增,以证实细胞病变为转录体RNA的恢复病毒所致. 结果我国登革2、3、4型病毒全长cDNA的体外RNA转录体均可使细胞产生病变,从细胞培养上清中可扩增出登革病毒特异的片段. 结论构建的我国登革2、3、4型病毒全长cDNA的体外RNA转录体具有感染性,可在蚊传代细胞内恢复为登革病毒颗粒.
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登革病毒Ⅱ型对人脐静脉血管内皮细胞通透性的研究
目的 研究登革病毒Ⅱ型(DENV-2)对人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)通透性的影响.方法 DENV-2病毒滴定,DENV-2接种HUVEC单层细胞,用间接免疫荧光法动态观察DENV-2感染HUVEC的情况(30 min,l、3、6、12、24、30、36、42、48、72 h),实时定量荧光PCR方法检测病毒载量,transwell法检测DENV-2对HUVEC通透性的影响,透射电镜观察细胞超微结构的改变.结果 DENV-2对HUVEC通透性的影响30 min时作用为明显,其次为42 h时.且病毒载量与HUVEC通透性改变呈正相关.透射电镜结果显示有细胞微绒毛脱落,胞质溶解,部分核膜间隙增宽,甚至是细胞核中也存在裂隙,部分线粒体嵴消失甚至空化,线粒体髓样变,包膜不完整.结论 DENV-2对HUVEC通透性有影响,为探究登革病毒的发病机制提供一定的理论依据.
关键词： 登革病毒 人脐静脉血管内皮细胞 通透性 -
广东登革Ⅰ型病毒株变异性的初步研究
目的 通过探讨广东部分登革Ⅰ型病毒的变异性,初步了解我国毒株的可能来源.方法 对来自广东省不同年代的登革Ⅰ型毒株LD-25(1985年)、LD-36(1991年)和登革Ⅰ型血清95-142(1995年),采用RT-PCR方法扩增其E/NS1部分基因片段,然后克隆测序.将所测序列中的240bp的片段与国际上已知的多个登革Ⅰ型毒株的相应序列进行比较,并以6%的核苷酸差异(divergence)作为分亚型的标准.结果 LD-25与LD-36、95-142分别属于两个不同的亚型,其中LD-25与泰国1980年毒株及中国台湾1987年、1988年毒株的同源性高达(97.1～98.8)%,属于一个亚型.LD-36和95-142则与菲律宾(1988年)、澳大利亚(1981年)、印度尼西亚(1978年)及瑙鲁(1974年)等地的毒株同源性高达(97.5～100)%,同属于另一个亚型.结论 广东登革Ⅰ型病毒可能不仅是从一个地方传入,来源比较复杂.
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我国登革2型病毒43株包膜E蛋白MBP-B165抗原性的研究
目的通过对我国登革2型病毒株包膜E蛋白包括B区在内的第267～432氨基酸编码基因片段的表达，研究MBP-B165蛋白的抗原性。方法首先采用PCR方法扩增了编码B165蛋白的基因片段，并将其插入到pMal-C2 原核载体进行融合表达。采用蛋白印迹和ELISA法对表达产物进行特异性鉴定。用表达的融合蛋白MBP-B165免疫大白兔，并通过ELISA法检测兔免疫血清中登革2型病毒特异的抗体。结果表达的融合蛋白MBP-B165可与我国登革2型病毒株抗体特异结合，而且与登革1、3和4型病毒参考株的多克隆抗体均具有较高的反应性。用表达蛋白免疫大白兔可产生针对我国登革2型病毒株E蛋白的特异抗体，并且该抗体与其他3个型病毒参考株有交叉反应。结论我国登革2型病毒43株E蛋白包括B区在内的第267～432氨基酸序列具有一定的抗原性，而且具有黄病毒亚组特异的反应性表位，即4个型登革病毒的结构保守性表位。
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登革2型病毒E蛋白免疫优势表位的筛选鉴定
目的用噬菌体展示肽库筛选登革2型病毒(DEN2)E蛋白的抗原表位,并确定该抗原表位性质. 方法以DEN2型特异的E单克隆抗体作为筛选分子,生物淘洗噬菌体随机12肽库,将筛选的噬菌体阳性克隆进行ELISA检测、DNA序列测定及展示肽的氨基酸序列推导,通过噬菌体展示肽序列与DEN2 E蛋白的氨基酸一级结构的对比,初步确定E蛋白的抗原表位;用模拟该表位线性序列的合成十肽进行抗体结合试验、噬菌体竞争抑制试验及与DEN感染患者的血清学试验,确定其为免疫优势线性表位. 结果肽库淘洗获得的11个ELISA阳性的噬菌体克隆有相似的结构基序WFKKGSS,其展示肽与DEN2 E蛋白390～398 AA序列有3～5个氨基酸相同.对应于DEN2 E蛋白390～399 AA的合成十肽能与淘洗单抗特异反应,并可抑制噬菌体阳性克隆与该单抗结合.该合成肽与DEN2感染患者血清有较高的免疫反应性. 结论本实验通过噬菌体随机肽库的生物淘洗确定的DEN2 E蛋白(E390～398 AA)线性序列为免疫优势表位,其对应的合成肽E10可望用于DEN2感染的快速诊断.
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登革病毒2型感染BALB/c小鼠的IL-4、IFN-γ产生动态观察
目的探讨登革病毒2型(DEN2)临床分离株感染BALB/c小鼠后其血浆中IL-4、IFN-γ产生动态及相关关系. 方法用不同剂量DEN2临床分离株经皮下多点注射,建立BALB/c小鼠感染模型,并用双抗体夹心ELISA法检测感染后不同时间各组动物血浆中IL-4、IFN-γ浓度. 结果 DEN2感染可使BALB/c小鼠产生IL-4、IFN-γ增加(P<0.05),且细胞因子浓度与病毒感染剂量有关.初次感染阶段两者水平均有升高,而再次感染阶段以IL-4升高为主. 结论在初次感染阶段TH1/TH2应答均发挥重要作用;而再次感染阶段以TH2应答为主.
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广东省登革病毒的分子流行病学研究
目的通过对广东省90年代以来流行的登革病毒分子流行病学研究，初步了解我国毒株的可能来源。方法采用RT-PCR方法扩增广东省不同年份分离的登革病毒(DEN)1型和2型NS1部分基因片段，然后进行克隆测序。测序后的基因片段与国际上已知的多个DEN1和DEN2相应的序列进行比较，并以核苷酸的差异在6%以上作为基因亚型分型的标准。结果①广州1991年分离的DEN1（GD03/91）与潮洲1995年分离的DEN1（GD23/95）同源性很高，为97%，属同一基因亚型，而两者与从潮洲1997年分离的DEN1（GD14/97）同源性均为93%，分属不同的基因亚型。基因系统树分析提示：GD03/91和GD23/95可能来自东南亚或瑙鲁等地，GD14/97可能来自新加坡。②佛山市1993年分离的DEN2（GD06/93）和南海市1998年分离的DEN2（GD01/98）同源性为93%，分属不同的基因亚型。基因系统树分析提示：GD01/98与泰国流行株ThNH-P28/93株共享序列非常接近，核苷酸同源性为98%，氨基酸同源性为100%，因此推测GD01/98可能来源于泰国。结论广东省90年代以来流行的登革热来源于不同的传染源。
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广州4株登革1型病毒E基因的全序列测定和分子进化分析
目的 通过对广州市不同年份分离的4株登革1型病毒(DEN-1)蛋白E基因进行全序列测定及分子进化分析,了解各流行株之间的遗传差异及进化关系,追踪其可能的传染来源.方法 应用RT-PCR技术分别扩增各株病毒的蛋白E基因,克隆到pGEM-T Easy载体,转化DH5α宿主菌,经PCR和酶切鉴定后进行序列测定.测序结果与国内外流行株进行同源性比较和毒力位点分析,并绘制基因系统发生树.结果 4株DEN-1病毒E基因序列长度均为1485 bp,编码495个氨基酸,核苷酸序列同源性为91%～98%,推导的氨基酸序列同源性为96.0%～99.2%.广州1995年流行的DEN-1和2002、2004、2006年流行株的毒力位点氨基酸存在差异.结论 通过对登革1型病毒E基因的进化分析,GZ01/95、GZ01/02和GZ01/04这3株同属于基因型Ⅳ,而GZ17/06属于基因型Ⅰ.1995年广州地区流行的DEN-1可能来源于印度尼西亚,而2002和2004年的流行可能与澳大利亚流行株有关.2006年广州又出现的DEN-1可能与泰国2002年的流行株输入有关.
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pSFV1载体系统的改造
目的获得具有多种稀有酶位点和CMV IE增强子/启动子及SV40晚期poly(A)加尾信号的pSFV1载体系统. 方法首先将含有多种稀有酶位点的人工接头插入到pSFV1的BamHⅠ和SmaⅠ位点(获得的载体称为mpSFV1),然后在mpSFV1和辅助载体Helper2的SpeⅠ和SphⅠ位点分别插入SV40晚期poly(A)加尾信号和CMV IE增强子/启动子序列.以间接免疫荧光法检测构建的表达载体mpSFV1-A-CMV表达登革2型病毒PrME基因的效率,并用RT-PCR法鉴定辅助载体Helper2-A-CMV包装形成重组病毒的能力. 结果经PCR和酶切鉴定证明,接头、CMV IE增强子/启动子序列和SV40晚期poly(A)加尾信号序列均已导入pSFV1载体系统中;测序结果也与已知序列一致.间接免疫荧光法证明,PrME蛋白在BHK21细胞中获得了表达,同时,改造后的辅助载体也具有包装形成重组病毒的能力. 结论已将以RNA为基础的pSFV1载体系统构建成以DNA为基础的表达载体系统.
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登革2型病毒NS3蛋白NTPase/RNA解旋酶结构域的原核表达及活性研究
目的表达登革病毒非结构蛋白NS3 NTPase/RNA解旋酶结构域(dNS3),纯化表达产物并对其活性作初步研究.方法提取感染登革2型病毒的BHK-21细胞总RNA,RT-PCR扩增目的基因,经NcoⅠ、HindⅢ双酶切后连入表达载体pET28a,转化宿主菌BL21(DE3),优化诱导表达条件,SDS-PAGE和免疫印迹鉴定表达蛋白.表达产物经亲和层析纯化,超滤浓缩脱盐,孔雀绿钼酸铵法检测NTPase活性.结果成功构建重组表达载体pET28a-dNS3并在大肠杆菌中获得可溶性表达,纯化产物经测定具有良好的NTPase活性及抗原性.体外条件下证实登革2型病毒非结构蛋白NS5(RDRP)对dNS3的ATPase活性有促进作用,提示在病毒复制时NS3与NS5间的相互作用对NS3的生物活性及对病毒复制过程可能具有调控作用.结论本研究为基于抑制NS3 NTPase/RNA解旋酶活性的抗病毒药物的筛选提供了实验依据.
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两株登革2型病毒E、NS1蛋白基因序列测定及其系统发生分析
目的对从登革出血热(dengue hemorrhagic fever, DHF)病人血清分离到的一株登革2型病毒(dengue virus type 2, DEN-2 B株)和DEN-2 NGC株作E、NS1蛋白部分基因序列测定并进行系统发生树分析,了解其变异及分子进化特征.方法利用RT-PCR法扩增B株和NGC株E、NS1部分基因片段,PCR产物直接测序;利用DNAssist软件预测其氨基酸序列,以及PHYLIP软件的CLUSTAL方法绘制系统发生树.结果 B株与NGC株E蛋白基因区第1～476nt(476bp)碱基序列存在8个位点的差异;编码氨基酸存在4个位置的不同;NS1基因区第589～1002nt (413bp) 碱基序列存在7个位点的差异,编码氨基酸有2个位置的改变;B株与NGC株和DEN-2 44株E区部分片段核苷酸同源性分别为99.1%和98.7%;与NS1区部分片段核苷酸同源性分别为98.3%和98.1%.B株E基因、NS1基因序列已登录GenBank,注册号分别为AY179733和AY238471.结论 B株E、NS1基因序列和氨基酸序列与NGC株存在差异;B株与我国海南1989年流行的DEN-2 44株和NGC株系统进化关系较近.
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登革病毒动物模型的研究进展
登革病毒每年威胁数以亿计人的生命健康.动物模型是进行病毒致病机制研究和疫苗评价的一种有效工具.目前,人是自然界中唯一感染登革病毒产生症状的宿主,从而使登革病毒动物模型的建立更具挑战性.登革病毒动物模型主要有两种,非人灵长类动物(NHP)模型和小鼠模型.一般来说,非人灵长类动物已经被用于研究登革热感染和候选疫苗研发,因为能够使登革病毒在其体内细胞中进行复制增殖,引起机体的免疫应答,但是不会产生明显的临床症状.此外,NHP模型不适合早期临床前研究,因为使用这些动物的成本很高.因此,小鼠模型可以更加经济地用于登革热疫苗临床前研发.目前小鼠模型主要有野生型小鼠模型和免疫功能缺陷的小鼠模型.不同的模型都有其优缺点,均可用于研究致病机制和研发疫苗及抗病毒药物.
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登革病毒拮抗干扰素系统分子机制的研究进展
登革病毒（ dengue virus， DENV）是一种经蚊虫传播的黄病毒，主要流行于热带及亚热带地区。登革病毒有4种血清型（ DENV1、DENV2、DENV3和DENV4），均可引起登革热或有更严重临床表现的疾病，如登革出血热（ dengue henor-rhagicfever，DHF）、登革休克综合征（ dengue shock syndrome， DSS）［1］等。登革热是一种急性发热性疾病，并伴有头痛、后眼窝丛痛、肌痛、关节痛、皮疹、出血表现和或白细胞减少。登革出血热的主要特征性表现是血小板减少、出血性表现、血浆渗漏迹象；可能导致低血压性休克和死亡［2］。新统计每年全世界有超过5000万人感染登革病毒，出现登革热症状的案例达到960万［3］；近50万人住院，25000人死亡，主要高发于儿童［4］。研究发现登革病毒可逃逸人类免疫应答，尤其是固有免疫应答。本综述旨在介绍宿主干扰素产生和效应，以及登革病毒拮抗干扰素系统分子机制的新研究进展［5］。
