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登革病毒特异性抗原片段的筛选鉴定及其ELISA方法的建立
目的 筛选、鉴定登革病毒共同及型特异性抗原,用纯化抗原建立检测登革病毒抗体的ELISA方法.方法 分别利用DNAStar及ANTHEPROT软件对登革病毒1～4型、流行性乙型脑炎及黄热病毒M、E、NS1蛋白进行分析,预测可能的抗原表位.并根据表位位置和氨基酸序列的相似性,分析登革病毒的共有及型特异性抗原表位,并参考GenBank中的序列信息进行比对,分析其在不同登革病毒株中的保守性.然后选择预测得分值较高的表位,利用pET32a、pMAl-c2x原核表达系统进行原核表达,Western blot验证其免疫学反应特异性.Western blot检测阳性抗原片段经亲和纯化后,包被ELISA微孔板,并对ELISA反应条件进行系统优化.结果经系统的生物信息学分析,共预测获得登革病毒抗原表位18个,登革病毒型特异性抗原表位25个,并对其中得分值较高的5段进行了高效表达,经Western blot分析,获得登革1～4型(Den-Ag5),登革2、4型(Den-Ag3),登革1～3型(Den-Ag2)病毒共同抗原片段各一段,登革1、2、4型( Den-Ag1、Den-Ag4)共同抗原片段两段,与流行性乙型脑炎病毒、黄热病毒及所用甲病毒多克隆抗体均无交叉反应.选择Den-Ag5、Den-Ag1和Den-Ag2作为检测用抗原,建立了检测登革病毒抗体的ELISA方法,初步应用表明,所建立方法具备良好特异性,可检测50～200倍稀释的患者血清,S/N比值均在15以上.结论 经系统筛选,获登革病毒特异性抗原片段5段,并建立了检测登革病毒抗体的ELISA方法.
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微孔杂交快速检测主要黄病毒方法的建立
登革病毒1～4型(dengue virus type 1-4,DV1-4)、流行性乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)及黄热病病毒(yellow fever virus,YFV)均为黄病毒属的重要传染病病原,其流行季节及临床症状都极为相似,且暴发日益频繁,发展特异、敏感的快速诊断及鉴别诊断方法,对这类疾病的预防及控制具有重要意义.本研究在对其基因组序列系统分析的基础上,建立了快速检测及鉴别诊断上述病毒的微孔杂交(PCR-ELISA)方法.
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细胞培养基底刚度对人原代脐静脉内皮细胞增殖率及经登革病毒感染后释放 NO、ET-1的影响
目的：探讨细胞培养基底刚度在登革病毒（ Dengue virus，DENV）感染人原代脐静脉内皮细胞（ HUVEC）中的影响。方法利用丙烯酰胺和双丙烯酰胺制备模拟正常人血管内皮细胞基底刚度的水凝胶[（0±4）kPa]，MTS法检测细胞的增殖，流式细胞仪检测细胞周期和凋亡，常规方法鉴定增殖登革病毒2型（DENV-2），DENV-2（MOI＝10）感染人原代脐静脉内皮细胞，MTS法比较种植在传统塑料基底与水凝胶上的HUVEC被DENV-2感染后对细胞增殖率的影响，并通过硝酸还原酶法检测两组细胞释放一氧化氮（NO）的水平以及双抗体夹心ELISA法检测内皮素-1（ET-1）的表达。结果自重弯曲法测得2％双丙烯酰胺和40％丙烯酰胺配比水凝胶的弹性模量为（3030±0．44） Pa；血管内皮细胞经登革病毒感染后其细胞增殖率与培养基底刚度呈正相关；两组不同刚度基底培养的细胞生长周期和细胞凋亡率无明显差异，但可引起NO和ET-1水平的变化。结论实验结果证实基底刚度可影响人原代HUVEC的增殖效率及释放的NO与ET-1浓度的变化，血管内皮受损后，其分泌合成的血管活性物质减少，参与了登革热的致病发生。同时水凝胶模型的建立为研究DENV感染的体外模型提供一定的新思路。
关键词： 基底刚度 登革病毒 人原代脐静脉内皮细胞 增殖 细胞因子 -
1型登革病毒抗原表位嵌合人3型腺病毒六邻体重组病毒的构建及免疫学鉴定
目的：构建六邻体嵌入1型登革病毒（ DENV1）抗原表位的人3型重组腺病毒，鉴定其抗原性。方法以人3型腺病毒骨架质粒pBRAdΔE3GFP为模板，overlap PCR在六邻体高变区HVR1插入DENV1的抗原表位，突变的六邻体片段克隆到穿梭载体，酶切后与线性化的3型腺病毒骨架质粒pBRAdΔE3GFP在大肠杆菌BJ5183同源重组，获得阳性重组腺病毒质粒pBRAdΔE3GFP-DENV1。线性化后转染AD293细胞拯救重组腺病毒rAdΔE3GFP-DENV1并大量培养。纯化后腺病毒免疫BALB／c小鼠，通过ELISA和Western blot检测小鼠的体液免疫应答。结果在人3型腺病毒六邻体成功插入DENV1抗原表位并包装出重组腺病毒，ELISA和Western blot结果显示小鼠免疫后能产生血清识别DENV1。结论成功构建六邻体HVR1嵌入DENV1抗原表位的重组腺病毒，为多价登革病毒疫苗的研究奠定了基础。
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深圳市2014年登革热流行病学和病原学特征研究
目的：研究深圳市2014年登革热疫情的流行病学特征，分析流行毒株的分子进化特征，为今后登革热的防控提供科学指导。方法采用描述性流行病学方法分析2014年深圳市登革热疫情，分别采用胶体金免疫层析法和荧光 PCR 检测疑似登革热患者血清中的特异性 IgM、IgG 抗体和病毒核酸，并用 C6/36细胞对急性期血清进行病毒分离，采用荧光 PCR 方法对其进行型别鉴定。同时扩增病毒 E 基因后进行序列测定，并与不同国家和地区的登革热毒株进行同源性比较和进化树分析。结果2014年深圳市累计报告登革热病例454例，以本地病例为主（占76.21%），输入病例以东南亚国家及周边城市为主（占23.79%）。发病高峰为9—11月（占97.14%）。发病人群以20~50岁青壮年人群为主，占病例总数的76.73%，男女比为1.43∶1。对332份病毒核酸阳性标本进行分型检测，共检出270例，型别以1型登革病毒（DENV-1）为主（占87.41%），其次为 DENV-2（占8.89%）。进化分析发现深圳地区流行的 DENV-1分布在两个分支上，其一为基因Ⅰ亚型，与深圳市2010年首次本地暴发疫情流行株同源性较高；其二为基因Ⅴ亚型，为深圳市首次报道。DENV-2核苷酸序列的差异相对较小，均为基因Ⅳ亚型。结论2014年深圳市报告登革热病例达到历年高峰，其流行具有输入病例与本地传播并存特点，主要是 DENV-1流行，同时今年新出现 DENV-2型病例明显增多，推测主要流行株由东南亚国家及周边城市输入，是否具有地方性登革热流行趋势还需进一步研究。
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细胞因子在登革病毒感染人皮肤成纤维细胞中的作用
目的探讨登革病毒(dengue virus, DV)对人皮肤成纤维细胞(HSF)的感染性和细胞因子在DV感染HSF中的作用. 方法采用微量病毒空斑法检测登革Ⅱ型病毒(dengue type-2 virus, DV2)感染HSF后病毒繁殖动态变化,间接免疫荧光法检测HSF内DV抗原.透射电镜观察病毒感染细胞的超微结构改变.用不同浓度的IL-6、TNF-α、GM-CSF分别作用于DV2感染HSF的不同环节(病毒吸附时和病毒吸附后),于感染后48*!h收集感染上清,测病毒滴度;用DV2感染HSF后,于不同时间收集感染上清,用ELISA法定量测定IL-6、TNF-α的含量. 结果病毒感染后24*!h即可在培养上清中测出病毒,病毒滴度在48*!h达到高峰,以后逐渐下降.用间接免疫荧光法证明感染的HSF胞浆及胞膜上携带DV抗原.在光镜和电镜下,感染细胞均未见明显的形态和结构改变.在病毒吸附时10*!ng/ml浓度的IL-6能显著提高病毒产量;在病毒吸附时和吸附后100*!ng/ml浓度的TNF-α能抑制病毒的产量.GM-CSF对DV感染HSF无明显影响.DV感染能促进HSF分泌IL-6;对TNF-α的分泌无明显影响. 结论 HSF是DV的允许性细胞.HSF可能是蚊叮咬后在原位组织中首先支持DV感染的细胞之一;细胞因子在DV感染HSF的致病和免疫过程中起重要作用.
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登革热疫苗研发的机遇与挑战
登革病毒是黄病毒科的单链 RNA 包膜病毒，是导致登革热、登革出血热及登革休克综合征的病原体。登革病毒主要通过埃及伊蚊和白纹伊蚊在全球热带和亚热带地区广泛传播。目前已有数个登革疫苗进入临床试验阶段，赛诺菲巴斯德（Sanofi Pasteur）的四价重组疫苗（CYD）是现在唯一已在部分南亚和美洲国家上市的登革疫苗产品。但该疫苗仍有免疫保护不平衡、增加5岁以下儿童的重症率等缺陷。因此研究可诱导均衡持久的抗登革病毒保护性免疫应答的疫苗仍是我们现在所面临的挑战。本文就登革病毒的免疫机制及疫苗研发过程中遇到的机遇与挑战做一简要综述并对开发新型登革疫苗做出展望。
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登革病毒Ⅰ～Ⅳ型外膜基因的表达及重组抗原的血清学应用
目的 选取登革病毒Ⅰ～Ⅳ外膜蛋白DⅢ区基因进行克隆、表达和纯化,以获得能应用于血清学诊断的纯化重组蛋白.方法 用RT-PCR法扩增登革病毒Ⅰ～Ⅳ毒株外膜蛋白DⅢ区基因,与表达载体pET-30a连接,构建重组表达载体,在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,重组蛋白用电洗脱法进行纯化.纯化的重组蛋白用间接ELISA法、捕获ELISA法和夹心ELISA应用于血清学检测,检测结果与间接免疫荧光法进行比较.结果 重组表达质粒在大肠杆菌中表达高产量的重组蛋白,纯化的重组蛋白对登革热病毒感染者具有很高的检出率,与间接免疫荧光法检测结果基本相符.结论 登革病毒Ⅰ～Ⅳ外膜蛋白DⅢ区基因在大肠杆菌中成功表达,重组蛋白可应用于血清学检测.
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登革病毒的基因组结构及其基因检测
登革病毒是登革热的病原体,在分类上属黄病毒科黄病毒属.根据抗原性的不同,登革病毒分为1,2,3,4 4个血清型.登革热是一种由伊蚊传播的急性传染病,在临床登革热可分为普通型登革热(dengue fever, DF)和登革出血热(dengue hemorrhagic fever, DHF)/登革休克综合征(dengue shock syndrome, DSS)2个类型.前者病情较轻,后者病势较重,致死率高[1].
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登革病毒快速检测方法研究进展
登革病毒(dengue virus,DV)属黄病毒科黄病毒属,是登革热的病原体.根据抗原性不同,可将登革病毒分为1、2、3、4 四个血清型.登革病毒感染(dengue virus infect,DVI)可引起登革热(dengue fever,DF)和登革出血热(dengue hemorrhage fever,DHF),后者死亡率较高[1].登革热是一种热带传染病,主要由埃及伊蚊和白纹伊蚊为传播媒介,其传染性仅次于艾滋病和非典.1779年印度尼西亚雅加达首次发生登革热流行,1869年由英国伦敦皇家内科学院命名为登革热[2].
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登革热诊疗指南2014年第2版
登革热是由登革病毒引起的急性传染病，主要通过埃及伊蚊或白纹伊蚊叮咬传播。
一、病原学
登革病毒属黄病毒科黄病毒属。登革病毒颗粒呈球形，直径45～55nm。登革病毒共有4个血清型（DENV-1、DENV-2 DENV-3和DENV-4），4种血清型均可感染人，其中2型重症率及病死率均高于其他型。 -
丙型肝炎病毒融合蛋白及融合机制
丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）属于黄病毒科、肝病毒属，是有包膜的单正链RNA病毒，其包膜糖蛋白E1、E2均位于病毒颗粒外表面，主要参与子代病毒颗粒的形成（如组装）及病毒新一轮感染（如细胞黏附、受体结合以及膜融合等过程）。目前研究认为，有包膜病毒均通过一个共同机制--膜融合将自身基因组输送至靶细胞，然后进行复制、转录与翻译、子代病毒组装与释放。经受体结合[如Ⅰ型人免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV-1）]、pH改变[如流感病毒、登革病毒（dengue virus，DENV）和塞姆利基森林病毒（Semliki forest virus，SFV）]或二者兼具（如鸟类肉瘤病毒、白血病病毒）的方式，与细胞膜或内体（endosome）膜发生融合[1]。本文将对近年来HCV E1、E2所介导的膜融合研究作一综述。
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登革2型病毒中国分离株感染性全长cDNA克隆的构建与鉴定
目的:构建登革2型病毒中国分离株(DEN2-43)的感染性全长cDNA克隆.方法:根据我室测定的DEN2-43株病毒全基因组序列,利用长链RT-PCR及融合PCR技术扩增此病毒基因组全长cDNA分子,并将其克隆至低拷贝载体pWSK29中构建该病毒株的全长cDNA克隆.将此克隆体外转录后,通过电穿孔导入宿主细胞获得恢复病毒.结果与结论:构建的DEN2-43基因组全长cDNA克隆具有感染性,所获得的恢复病毒具有与原型病毒类似的生物学性质及小鼠乳鼠神经毒力,且可稳定传代.该感染性克隆的构建为深入探讨登革病毒的致病机制及研制新型登革疫苗奠定了基础.
关键词： 登革病毒 感染性全长cDNA克隆 恢复病毒 -
登革2型病毒NS5蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达及纯化
目的:构建登革2型病毒(DEN-2)NS5表达体系,摸索适宜的诱导表达条件,克服大分子蛋白难以表达的瓶颈,获得DEN2-2 NS5(相对分子质量104×103)表达产物,为以后对其活性、抑制剂等方面的研究奠定基础.方法:自DEN-2感染组织提取总RNA,RT-PCR扩增NS5基因片段(2.7kb),插入质粒pQE30,转化XL1Blue大肠杆菌得表达菌株XL1Blue/QENS5.同时优化诱导表达和目的蛋白的纯化条件.结果:表达菌株XL1Blue/QENS5增菌培养后更换新的培养基,在一定温度范围条件下诱导可以表达出高占菌体总蛋白22.8%的NS5蛋白,在较低温度下诱导目的蛋白能以可溶性形式表达,经过纯化后的NS5蛋白纯度可达90%以上.结论:在国内首次实现了DEN-2 NS5蛋白的表达,获得的诱导表达条件可能对于其他大分子蛋白的表达有一定的借鉴意义.
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登革4型病毒基因组cHP发卡结构对病毒复制和翻译的调控作用
目的:探讨登革4型病毒C基因中保守的cHP发卡结构对病毒复制和翻译的调控作用.方法:首先在获得含有海肾荧光素酶(Renilla luciferase, R.luc)报告基因的复制子(DEN-R.luc2A-RP)基础上,利用重叠PCR构建cHP发卡结构系列突变体(cHP1～cHP6).将构建的突变体(包括相关的阳性和阴性对照复制子)分别线性化并体外转录成RNA后,取等量各转录体RNA,以脂质体法分别转染BHK-21细胞.通过间接免疫荧光(IFA)、RT-PCR、R.luc报告基因检测技术和实时定量RT-PCR对突变体的复制和翻译进行检测.结果:cHP发卡结构系列突变体均可在BHK-21细胞中复制并稳定表达病毒特异蛋白,在该发卡结构中引入缺失或突变对病毒早期翻译并无显著影响,但病毒RNA复制均显著下调.结论:cHP发卡结构在基因组RNA复制过程中可能具有重要的调控作用.
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融合蛋白D2C-SN对登革2型病毒增殖的影响
目的:观察登革2型病毒衣壳蛋白(D2C)与葡萄球菌核酸酶(SN)融合蛋白在哺乳动物细胞中对登革2型病毒增殖的影响.方法:通过基因重组构建可在哺乳动物细胞中表达融合蛋白D2C-SN的重组质粒pc/D2C-SN,同步构建pc/D2C-SN*用作对照.病毒感染BHK21细胞后,通过阳离子转染试剂将重组质粒导入感染细胞,在此基础上评价融合蛋白D2C-SN抗登革病毒感染的治疗效果.结果: 融合蛋白D2C-SN能够在哺乳动物细胞中表达,对宿主细胞没有明显的毒性;与正常BHK21细胞相比较,可导致病毒感染性滴度降到原来的1/60～1/12.结论:融合蛋白D2C-SN在细胞水平能够有效抑制登革病毒的增殖,有可能成为潜在的抗登革病毒感染的治疗性药物.
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基于登革2型病毒PrM基因的新型脱氧核酶对病毒RNA降解作用的初步观察
目的:针对登革2型病毒(DEN2)PrM基因设计新型脱氧核酶并观察其抗病毒作用.方法:根据脱氧核酶(DRz)裂解RNA靶位的特异性,选择DEN2 PrM基因中符合5'…R↓Y…3'(R=A/G,Y=U/C)特征且其二级结构中以未配对与配对碱基的磷酸二酯键为靶位,设计合成DEN2特异性脱氧核酶,筛选具有裂解PrM RNA活性的DRz.观察DRz与靶序列浓度比、Mg2+浓度及反应时间对DRz裂解效率的影响.结果与结论:体外裂解实验显示,在所设计合成的8个脱氧核酶中,DRz614对登革病毒的PrM RNA靶序列具有裂解活性,降解效率高达82%.本研究为进一步探讨新型抗登革病毒策略奠定了基础.
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含有海肾萤光素酶报告基因的登革4型病毒亚基因组复制子的构建
目的:构建含有海肾萤光素酶(Renilla luciferase, R.luc)报告基因的登革4型病毒亚基因组复制子,为探讨病毒基因组中保守序列和元件在复制和翻译调控机制中的作用提供新的手段.方法:利用定点诱变PCR技术构建prM-E基因缺失的登革4型病毒亚基因组复制子(DENRP),用顺式水解酶元件(cis-acting hydrolase element,CHYSEL)技术将R.luc报告基因插入到DENRP缺失的结构基因区,构建含有R.luc报告基因的复制子(DEN-R.luc2A-RP).将构建的复制子线性化并体外转录成RNA后,经电穿孔转染BHK-21细胞,通过间接免疫荧光、RT-PCR和R.luc检测技术对复制子进行鉴定.结果:所构建的prM-E基因缺失的复制子和含有海肾萤光素酶报告基因的复制子,均可在BHK-21细胞中自主复制并稳定表达病毒特异蛋白.DEN-R.luc2A-RP可持续表达外源R.luc报告基因21 d,在转染后24~96 h R.luc荧光信号呈线性增强.在该区间进行实时检测可显示复制子复制和翻译水平的变化.结论:获得了两株可在BHK-21细胞中稳定表达的复制子,为进一步研究登革4型病毒复制和翻译机制奠定了基础.
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登革病毒C基因突变对病毒RNA复制的影响
目的:分析C基因及其编码蛋白突变对登革病毒RNA复制的影响.方法:利用融合PCR方法在登革病毒复制子中引入C基因相应部位的缺失突变,将复制子RNA转染细胞后,利用报告基因活性分析、间接免疫荧光及实时定量PCR等方法分析其复制水平.结果:获得了含有不同α螺旋缺失突变的C基因的复制子质粒,并发现△α1复制子复制水平明显下降.结论:登革病毒C蛋白α1螺旋或其编码序列对病毒RNA复制具有重要作用.
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D2-43病毒E蛋白在酵母细胞表面的展示
目的:在酵母细胞表面展示登革2型病毒43株(D2-43)的E基因,探索利用酵母表面展示系统建立DNA改组筛选平台的可行性.方法:通过RT-PCR扩增获得D2-43的E基因,将该基因亚克隆至T载体后,再克隆至酵母表面展示载体pYD1,于酿酒酵母EBY100中利用半乳糖进行诱导表达.表达产物采用间接免疫荧光法和FACS进行检测.结果:酵母表面展示产物可与D2-43的腹水抗体特异性地结合;在半乳糖诱导后24 h,展示E蛋白的酵母细胞百分数达22.07%.结论:本研究为建立基于酵母表面展示系统的DNA改组筛选平台奠定了基础.
