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登革病毒质粒型微复制子载体的构建和鉴定
目的 构建登革病毒质粒型微复制子载体,并对其功能进行鉴定.方法 以登革病毒4型感染性cDNA克隆p4为分子基础,通过融合PCR方法构建删除病毒结构基因和大部分非结构基因的表达盒,并将其克隆入真核表达载体pCDNA3.1(+)的CMV启动子下游以构建包含病毒复制和翻译必需顺式作用元件和NS5关键序列的质粒型微复制子载体pcDEN-△prME.结果 为验证微复制子载体的包装功能,将定性的绿色荧光蛋白报告基因和定量的海肾荧光素酶基因分别克隆至pcDEN-△prME构建工程载体pcDEN-△prME-EGFP和pcDEN-△prME-GLUC.转染实验结果显示,微复制子载体可成功表达绿色荧光蛋白报告基因及海肾荧光素酶报告基因.结论 本研究所构建的DNA型微复制子载体pcDEN-△prME在保留病毒必要的顺式作用元件和NS5部分关键序列的同时缺失了大部分非结构基因,使得该载体在简化实验操作的同时大大提高了病毒载体的容量,为深入研究以登革为代表黄病毒抗病毒药物筛选和新型疫苗研发提供了有力工具,更为病毒复制及翻译的分子调控机制提供了新的技术平台.
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登革病毒疫苗研究进展
登革病毒(Dengue virus,DENV)是登革热、登革出血热和登革休克综合征(DHF、DSS)的病原体,伊蚊为主要传播媒介,广泛流行于全球热带及亚热带的100多个国家和地区,超过25亿人受到登革病毒感染的危胁[1].据估计每年有5000万～1亿登革热患者,25～50万登革出血热患者,登革出血热与登革休克综合征的病死率高达10%～15%[2].近年来随着全球气候变暖、旅游和交通事业发展,伊蚊的分布范围不断扩大,登革热已成为世界上分布广、发病人数多、危害大的虫媒传染病之一.
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反向遗传学在登革病毒研究中的应用
关于登革病毒及其感染的研究迄今还有很多尚未解决的问题,利用反向遗传学技术(reverse genetic8 approache8)对登革病毒进行研究是目前的热点.本文将就近年来反向遗传技术在登革病毒研究中的研究进展进行综述.
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登革病毒毒力研究进展
登革病毒(Dengue Virus,DV)是一类有包膜的单股、正链RNA病毒，基因组10～11kb，编码3种结构蛋白(C，PrM和E)和7种非结构蛋白(NS1,NS2a，NS2b，NS3，NS4a，NS4b和NS5)。自然界存在的登革病毒有四种血清型，均可引起温和的登革热(DF)和严重的致死率很高的登革出血热(DHF)、登革休克综合征(DSS)，而关于DF至DHF/DSS的发病机理迄今尚未阐明。近年来强毒力病毒理论〔1〕开始获得一些直接证据，越来越受到研究者的重视，该理论认为DHF/DSS的发生是受一种毒力更强的登革病毒株的感染。随着DNA测序技术的发展，登革病毒毒力的研究正进入一个新时期。
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提高早期发现能力加强我国登革热防控工作
登革热是由4型登革病毒引起的一种争性传染病,主要通过埃及伊蚊和白疑义伊蚊叮咬传播,是《中华人民共和国传染病防治法》规定的乙类传染病.
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水凝胶上培养的原代人脐静脉内皮细胞感染登革病毒Ⅱ型对细胞产生 IL-29的表达影响
目的：利用水凝胶（ hydrogel ）模拟人血管内皮细胞基底膜弹性硬度，以登革病毒2型（DENV-2）NGC株感染接种于水凝胶为基底的原代人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endotheli-al cells，HUVECs），观察HUVECs在不同弹性硬度材质上培养产生IL-29的情况。方法分离培养原代HUVECs，将细胞接种于水凝胶，以MOI（multiplicity of infection）＝10的DENV-2感染原代HUVECs，流式细胞术检测48 h细胞凋亡率及病毒感染率，并送检mRNA基因表达谱芯片，通过实时荧光定量PCR及双抗体夹心ELISA法检测IL-29的表达情况。结果 DENV-2感染原代HUVECs 48 h，培养于水凝胶上的细胞的病毒感染率较低，细胞凋亡率与未感染组比较，差异无统计学意义（P＞0．05），基因芯片检测发现IL-29的产生与普通塑料培养瓶接种的脐静脉内皮细胞受到DENV-2感染后存在差异，实时荧光定量PCR和双抗体夹心ELISA法检测IL-29的表达，差异均存在统计学意义（P＜0．05）。结论水凝胶模拟人血管内皮细胞基底膜硬度，用DENV-2感染接种于水凝胶上脐静脉内皮细胞，基因芯片检测发现IL-29的产生，与体外正常培养条件下受到DENV-2感染后存在差异，水凝胶的建立可能为DENV发病机制的研究提供一个新的模型。
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DENV-2感染的HUVECs与调节性T细胞相互作用对主要炎性细胞因子产生的影响
目的 研究人原代脐静脉内皮细胞( primary human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)被登革病毒2型( DENV-2)感染后,与调节性 T 细胞( regulatory T cells, Treg)共培养, HUVEC与Treg细胞相互作用对各自主要炎性细胞因子的影响.方法 用密度梯度离心法从人浓缩白细胞分离外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC),磁珠阴性分选Treg细胞,流式细胞术检测CD4+CD25+CD127+细胞纯度. HUVECs经DENV-2感染后,用Transwell与Treg细胞共培养,对照组用鞘氨醇-1-磷酸(sphingosine-1-phosphate, S1P)1型特异性受体激动剂CYM-5442预处理24 h去除药物后感染病毒,并与Treg细胞共培养,real-time RT-PCR分别检测HUVECs的IL-6、IL-8、TNF-α和Treg细胞的IL-10、TGF-β的mRNA转录水平;双抗体夹心ELISA法检测培养上清中上述细胞因子表达.结果 感染后HUVECs中DENV-2 NS1基因转录水平逐渐上升,在24 h达到峰值(3. 03 ±0. 26,P<0. 01)后下降.流式细胞术检测经免疫磁珠阴性分选的Treg细胞纯度为(84. 3±0. 5)% .DENV-2感染后HUVECs的IL-6、IL-8、TNF-α mRNA转录均有上调,感染后24 h IL-6、IL-8、TNF-α的mRNA转录量分别为16. 64±2. 64、26. 80±5. 81和5. 25±0. 42,而未感染组的转录水平分别为1. 70± 0. 68、1. 68±0. 74、1. 45±0. 15,与Treg共培养后上述细胞因子在各时间点的转录有所降低,但仍高于未感染DENV-2的对照组. CYM-5442预处理后被感染的HUVECs IL-6、IL-8、TNF-α的mRNA转录水平显著下降;共培养的 Treg 细胞所产生的 IL-10、 TGF-β 也下调.结论 被 DENV-2感染的原代HUVECs能增强Treg细胞IL-10与TGF-β的分泌,同时Treg细胞产生的抑制性细胞因子能降低被感染的HUVECs炎性细胞因子的产生.
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2型登革病毒对原代人肝窦内皮细胞凋亡、自噬以及相关基因表达的影响
目的：研究2型登革病毒（DENV-2）感染原代人肝窦内皮细胞（HHSECs）后，HHSECs的凋亡、自噬，细胞间黏附分子-1（ICAM-1）及 Beclin-1 mRNA 水平的表达，分析 DENV-2致病过程中可能的作用机制。方法用 DENV-2（MOI=1）作用于 HHSECs，Real-time PCR 动态检测 DENV-2 NS1部分序列；CCK-8法动态检测 DENV-2对 HHSECs 的毒性作用。real-time PCR 动态检测被感染 HH-SECs 的 ICAM-1、Beclin-1 mRNA 的表达水平。流式细胞术检测被感染 HHSECs 的细胞凋亡率，以及LC3B 和 ICAM-1的表达。结果被 DENV-2作用后的 HHSECs 有 NS1部分基因序列的表达。DENV-2感染细胞后，CCK-8法检测细胞的抑制率分别为（10.90±1.24）%（12 h）、（16.40±0.42）%（24 h）、（17.00±0.46）%（36 h）、（29.60±0.26）%（48 h）。Real-time PCR 检测 HHSECs 中 Beclin-1及 ICAM-1 mRNA 的表达，以未感染组为对照，2-△△Ct值于24 h 达峰值，分别为46.77±2.55和40.97±4.91。流式细胞术动态观察被 DENV-2感染的 HHSECs 的凋亡，于12 h 较明显，凋亡率为13.17%；36 h 时LC3B 的表达率（35.50%）达到峰值；ICAM-1的表达率分别为9.17%（12 h）、14.7%（24 h）、12.7%（36 h）、11.6%（48 h）。结论 HHSECs对 DENV-2易感。DENV-2可激活 HHSECs，诱导 ICAM-1上调；可促进自噬的发生，于早期诱导 HHSECs 细胞凋亡。
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登革2型病毒调控血管内皮细胞纤溶系统相关蛋白的表达
目的观察登革2型病毒(DV2)对人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)表达组织纤溶酶原激活物(tPA)和纤溶酶原激活物抑制物1(PAI-1)的影响. 方法应用胰酶消化分离HUVEC并进行传代培养,用生长良好的第2、3代细胞进行试验.用cell counting kit-8(CCK-8)测定DV2感染后细胞活性变化;发色底物法测定感染DV2组和对照组培养液中tPA、PAI-1活性;RT-PCR检测细胞内tPA和PAI-1 mRNA水平. 结果 DV2感染对细胞活力的影响与对照组相比差异无统计学意义.感染DV2组培养液中tPA活性在12～72 h显著升高(P＜0.05);DV2诱导HUVEC表达tPA mRNA的水平显著上调,12 h达到峰值,以后渐降,72 h mRNA表达水平仍高于对照组(P＜0.01).而DV2感染组培养液中PAI-1活性和PAI-1 mRNA的表达与对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05). 结论 DV2感染可显著上调HUVEC的tPA mRNA转录,增强内皮细胞tPA蛋白的分泌,而不影响PAI-1 mRNA的转录或改变内皮细胞PAI-1的分泌.结果提示DV2可活化但并不损伤内皮细胞,诱发内皮细胞增强表达纤溶酶原激活物而致使纤溶系统失衡,引起纤溶亢进,这可能是诱发DHF/DSS患者急性期出血、低血容量性休克等体征的主要因素之一.
关键词： 登革病毒 血管内皮细胞 组织纤溶酶原激活物 纤溶酶原激活物抑制物1 -
转录因子 p53通过激活Ⅰ型干扰素通路抑制登革病毒感染
目的：探讨转录因子p53在登革病毒感染中的作用。方法用逆转录病毒载体介导的RNA干扰技术构建p53低表达的人肝癌细胞株HepG2，并采用Western blot 进行鉴定。设定野生组和干扰组，分别用2型登革病毒感染。采用Vero细胞噬斑法检测病毒滴度；间接免疫荧光检测病毒增殖；流式细胞术检测病毒感染后细胞凋亡；酶联免疫吸附试验检测IFN-β分泌。结果与野生组比较，干扰组p53表达明显下调，表明构建p53低表达的HepG2细胞株成功。登革病毒感染24 h后，干扰组病毒滴度比野生组高100倍；免疫荧光显示干扰组发绿色荧光的细胞数明显多于野生组，说明p53抑制了登革病毒的感染。但是，登革病毒感染24 h后两组凋亡细胞的数目并没有明显差异，而野生组IFN-β分泌量增加6倍。结论转录因子p53抑制登革病毒感染可能不是通过促进细胞凋亡，而是通过激活Ⅰ型干扰素通路来发挥作用。
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登革病毒Ⅱ型E基因片段在大肠杆菌中的表达及免疫原性分析
目的 分析登革病毒Ⅱ型(DEN2)重组包膜蛋白的免疫原性,为登革Ⅱ型亚单位疫苗的研制奠定基础.方法 扩增DEN2 E基因片段(254～395 AA),与表达载体pET-30a连接,构建重组表达载体,在大肠杆菌BL21(DE3)中表达重组蛋白.重组蛋白经高效液相色谱(HPLC)柱纯化后,进行阻断DEN2感染C6/36细胞试验,同时用重组蛋白免疫小鼠,采用中和实验法测定血清中和抗体效价.结果 该基因片段在大肠杆菌中高效表达重组蛋白,重组蛋白可被抗DEN2多克隆抗体识别,纯化后的重组蛋白能有效地抑制DEN2感染C6/36细胞,经重组蛋白免疫的小鼠可产生中和抗体.结论 表达的DEN2重组包膜蛋白具有良好的免疫原性,能诱导中和抗体的产生.
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登革重组抗原与登革IgM抗体反应的敏感性和特异性分析
选用登革病毒1-4型E蛋白(包膜糖蛋白)型特异性多肽(约120个氨基酸)作抗原,重组抗原在大肠杆菌(E.coli)中表达,采用多步液相层析进行纯化.本文对该抗原的敏感性和特异性进行了分析,为开发"登革病毒IgM抗体酶联免疫诊断试剂盒"进行了基础研究.
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登革2型病毒43株NS1基因重组质粒DNA的免疫原性及保护作用研究
目的研究以pcDNA3.1为载体的登革2型病毒43株(D2-43)NS1基因重组DNA的免疫原性及对登革病毒感染所致小鼠神经毒的免疫保护作用. 方法将纯化的pcDNA-NS1重组质粒DNA采用肌肉多点注射途径免疫3周龄BALB/c小鼠,剂量为每只100μg/次,检测了免疫鼠血清抗体滴度及特异性细胞毒作用.并以D2-43病毒脑内攻击6周龄BALB/c小鼠产生的神经毒症状为实验模型,对pcDNA-NS1的免疫保护作用进行了初步探讨. 结果用间接ELISA测得pcDNA-NS1免疫后抗体滴度为1∶800,在补体存在下,对D2-43病毒感染的BHK-21细胞特异性杀伤率可达到61.6%.由免疫的BALB/c小鼠脾制备的效应细胞在体外可特异性地杀伤D2-43感染的P-815细胞(H-2d).当效靶比(E/T)为20∶1时,pcDNA-NS1质粒免疫后的特异性CTL杀伤百分率为22.6%.将100 LD 50的D2-43病毒经脑内攻击BALB/c小鼠,结果表明免疫pcDNA-NS1组小鼠存活率高(90.9%);与免疫 pcDNA3.1对照组比较,P值＜0.05. 结论 pcDNA-NS1质粒免疫BALB/c小鼠不仅可诱导体液免疫,还可诱导特异性细胞免疫.初步结果还显示,用含NS1基因的重组质粒DNA免疫的小鼠能免受致死剂量登革病毒的攻击,为登革热新型疫苗的研究奠定了基础.
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登革病毒3型E蛋白的原核表达及抗体的制备
目的 原核表达并纯化登革病毒3型(DENV-3)E蛋白,并用于制备其抗体.方法 采用PCR技术克隆DENV-3 E蛋白基因,插入原核表达质粒载体pET-32a(+),转化大肠杆菌Rosetta(DE3),IPTG诱导表达.表达产物经纯化后,免疫家兔,制备DENV-3 E蛋白抗血清,并用于Westernblot鉴定.同时,采用ELISA测定其抗体效价,并初步应用于DENV-3的检测.结果 重组表达载体经双酶切及测序证实构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约为65×103,主要以包涵体形式表达;用纯化的包涵体蛋白免疫家兔后,获得的特异性抗血清效价为1∶20 480,该血清可与DENV-3发生特异性反应.结论 本研究原核表达并纯化了DENV-3 E蛋白,制备了高滴度的特异性兔抗血清.制备获得的DENV-3 E蛋白抗体可用于登革病毒的鉴定,为登革病毒相关研究奠定了基础.
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两株登革2型病毒感染BALB/c小鼠后发病情况的观察
登革病毒(dengue virus, DEN)属于虫媒病毒,其致病机制一直是研究的热点,更多的学者注意到登革出血热/登革休克综合征(dengue hemorrhagic fever/dengue shock syndrome, DHF/DSS)可能是由病毒毒力变异,不同毒株感染的流行所致[1].目前,许多相关研究多通过体外试验完成,难以准确反映体内情况.本研究采用DEN2 NGC株和从患DHF的病人血清中分离得到的一株DEN2[2],经腹部皮下多点注射分别感染BALB/c小鼠,观察登革2型病毒不同毒株感染BALB/c小鼠后的发病情况,为探索DEN感染的致病机制提供线索.
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登革2型病毒广东流行株结构蛋白基因序列测定及分析
目的对广东省90年代以来流行的3株登革2型病毒(DEN2)的结构蛋白基因序列测定及分析,了解流行株之间的相互关系、变异及基因型. 方法应用RT-PCR技术扩增广东省不同年份流行的3株DEN2型病毒的结构蛋白基因(C、PrM、E基因).分别克隆到pMD18 T载体,转化JM109宿主菌,挑取阳性克隆进行鉴定及序列测定. 结果 3株DEN2病毒结构蛋白基因序列长度均为2?325bp,编码775个氨基酸.三者核苷酸(氨基酸)的同源性分别是:GD06/93与GD19/2001为96%(97%)、GD06/93与GD08/98为94%(97%)、GD08/98与GD19/2001为92%(94%).其在相关毒力位点E383～385处均为GLU-PRO-GLY、E126处均为GLU.3株DEN2与国际参考株比较表明:GD06/93与GD19/2001和澳大利亚TSV01株共享序列非常接近,核苷酸(氨基酸)的同源性为98%(98%);GD08/98与泰国株ThNH-P28/93核苷酸(氨基酸)同源性为98%(98%).此3株DEN2二级结构与对乳鼠不致病的04株比较,主要差别位于其393～400氨基酸处,本室分离的3株对乳鼠致病毒株为EEEEHHHH,而04株为EEEE----;337～343处本室分离的3株对乳鼠致病毒株为HH-------HHHHH,而04株为--------HHHHE-,恰好位于Dengue病毒E基因的Ⅲ区. 结论 GD06/93、GD19/2001与TSV01亲缘关系较近,属同一基因型.GD08/98与ThNH-P28/93共享序列非常接近,属同一基因型.3株DEN2病毒在E蛋白Ⅲ区结构有一定变异,可能与毒力有关.
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抗DEN-2基因核酶的克隆及其体外切割活性的研究
目的探索核酶抗登革病毒活性.方法根据DEN-2基因结构的特点,按照锤头状核酶的结构模型和作用模式,设计、合成针对172～174 GUC位点的核酶基因;定向插入质粒pGEM-3Zf(+)的SacⅠ和SalⅠ位点之间;核酶基因克隆和DEN-2靶基因克隆分别进行体外转录,生成核酶和靶RNA,体外进行切割反应.结果核酶与登革病毒靶序列体外产物电泳见预期切割条带.结论该核酶具有切割相应靶RNA的活性,可进一步用于细胞内核酶抗登革病毒的研究.
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新分离登革2型病毒福建株基因组全序列的测定
目的对新近分离的导致1999年福建省登革热流行的登革2型病毒FJ-10株进行基因组全序列测定及系统发生树分析。方法利用RT-PCR和5′、3′RACE法扩增FJ-10株cDNA，并进行克隆测序。利用DNASTAR软件的Clustal方法绘制系统发生树。结果 FJ-10株基因组全长10723个核苷酸，有1个单一开放读码框架（ORF,第97～10269nt），编码3391个氨基酸，5′和3′非编码区长度分别为96和454个核苷酸。通过与标准株NGC株和我国其他地区分离株DEN2-04、43、44株比较，核苷酸同源性分别为94.0%、92.8%、93.9%和93.9%，氨基酸同源性分别为97.9%、97.2%、97.7%和97.9%。以47株登革2型病毒E/NS1连接区240个核苷酸序列进行系统发生树分析，福建株与印度尼西亚和斯里兰卡分离株亲缘关系较近，同属于第Ⅳ基因型。结论 FJ-10株基因组全序列一级结构与其他登革2型病毒类似，其基因型不同于我国其他地区分离株DEN2-04、43和44株。
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贵州独山、兴义不明原因发热病人登革病毒的分离和鉴定的初步研究
目的 对贵州独山、兴义两地夏秋季不明原因发热病人血清进行登革病毒(DEN)分离及鉴定,从病原学角度证实贵州省人群DEN的感染情况.方法 于2005年6至10月份收集贵州独山县、兴义市两地不明原因发热病人血清356份,并接种于生长良好的单层C6/36细胞盲传3代,观察细胞病变,用抗DEN1～4型单克隆抗体通过间接免疫荧光法进行型别鉴定;用DEN NSl基因区特异性通用引物进行RT-PCR检测分离的DEN毒株核酸,经序列测定并作系统发生树分析.结果 3份病人血清标本可使C6/36发生细胞病变,用单克隆抗体、RT-PCR扩增和序列测定,鉴定为DEN2;系统发生树分析证明,分离的病毒与DEN2-43、DEN2-44株系统进化关系近.结论 贵州省独山、兴义两地人群中存在DEN感染.
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登革病毒感染对血管内皮细胞ICAM-1表达的影响
目的 探讨登革病毒2型(DV2)体外感染对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)表达细胞间黏附分子(intercellular adhesion molecule,ICAM-1)的影响.方法 原代分离培养HUVEC,用生长良好的2、3代细胞进行实验.用CCK-8法测定DV2感染前后的细胞活性.流式细胞仪测定DV2感染组和对照组细胞在不同实验时间点细胞表面ICAM-1蛋白表达的情况.采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法和图像定量分析技术分析DV2感染组和对照组在不同实验时间点HUVEC内ICAM-1 mRNA水平.结果 病毒感染HUVEC对细胞活力的影响与对照组相比差异无统计学意义.DV2感染HUVEC促进ICAM-1 mRNA转录,DV2组与对照组相比差异有统计学意义(P＜0.05).其中,正常状态下HUVEC有一定水平ICAM-1 mRNA转录,但感染后显著增加(P＜0.05),24～72 h维持于高水平,与其他时间表达差异有统计学意义(P＜0.05).DV2感染HUVEC,细胞表达ICAM-1蛋白在12～72 h显著升高,与对照组相比差异有统计学意义(P＜0.05).结论 DV2感染上调HUVEC的ICAM-1 mRNA水平和蛋白表达,从而诱发并加重血管内皮局部的损伤,破坏血管的屏障功能,促进血管渗漏的形成与发展.这可能是DV2感染诱发患者血管通透性升高和血浆渗漏的重要分子机制之一.
