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多重逆转录-聚合酶链反应快速检测登革病毒及其临床应用
目的建立登革1～4型病毒的多重逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)快速检测及分型方法.方法参照登革1～4型病毒核酸序列设计多重RT-PCR引物,并检索国际基因序列数据库初步验证其特异性,随后对PCR反应条件进行优化,以同属于黄病毒科的黄热病毒、流行性乙型脑炎病毒为对照,验证其特异性.并对2003年30份临床疑似登革患者血清标本进行了检测,阳性片段克隆测序验证扩增片段特异性.结果采用多重PCR引物对登革1～4型病毒进行扩增,分别获得295、237、118、347 bp片段,与设计相符;而黄热病毒及流行性乙型脑炎病毒均无非特异性扩增条带,对引物的相关性实验结果表明引物之间不会因相互干扰而出现假阳性结果,30份疑似患者血标本RT-PCR扩增阳性率为83.3%(25/30),其核酸序列与登革1型病毒柬埔寨株以及中国1997、1999年流行株GD14/97、GD05/99同源性分别为97%、97%、98%.结论实验证明,所建立的多重PCR方法能够快速地检测和鉴定登革1～4型病毒,为登革病毒的检测及分型提供了一种方便易行的方法.
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广东省江门地区登革病毒分离株的鉴定及结构蛋白序列分析
目的对广东省江门地区2001年夏、秋季一批发热、出疹患者进行确诊,并从分子水平分析流行株的可能来源.方法分别采用免疫荧光、细胞毒力、乳鼠毒力实验以及逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术进行病毒鉴定,并对其结构蛋白基因序列进行克隆、测序及同源性搜索.结果 37份患者血清登革病毒(DV)IgM抗体阳性率为97%(36/37),IgG抗体阳性率为59%(22/37),高抗体滴度均可达1∶640.所得病毒可致C6/36细胞病变,具有乳鼠神经毒力;其结构基因序列长度为2 325 bp,编码774个氨基酸;与其他登革2型病毒株TSV01、GD06/93、NGC、44、ThNH、04、GD08/98及S1进行比较,其核酸序列同源性(%)分别为98、96、94、94、92、92、92、91.结论 2001年江门地区登革热流行为登革2型病毒感染所致,推测其可能是输入性传染.
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三株登革2型病毒广东分离株结构蛋白E基因序列测定及分析
目的对广东省分离的3株登革2型病毒(DEN2)的结构蛋白E基因扩增、克隆、测定及分析,了解流行株之间的相互关系及基因型.方法应用RT-PCR技术扩增广东省不同年份流行的3株DEN2型病毒的结构蛋白E基因.分别克隆到PMD18 T载体,转化JM109宿主菌,挑取阳性克隆进行鉴定及序列测定.结果3株DEN2病毒结构蛋白E基因序列长度均为1 485 bp,编码495个氨基酸.其核苷酸(氨基酸)的同源性分别是:GD06/93与GD19/2001为98%(98%)、GD06/93与GD08/98为92%(95%)、GD08/98与GD19/2001为91%(94%).3株DEN2与国际参考株比较表明:GD06/93与澳大利亚TSV01株共享序列非常接近,核苷酸(氨基酸)的同源性为99%(99%);GD19/2001和澳大利亚TSV01株核苷酸(氨基酸)的同源性为98%(98%);GD08/98与泰国株ThNH-P28/93核苷酸(氨基酸)同源性为98%(98%).结论GD06/93、GD19/2001与TSV01亲缘关系较近,属同一基因型.GD08/98与TnNH-P28/93共享序列非常接近,属同一基因型.
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登革病毒感染致登革出血热一例
登革病毒引起人的登革热、登革出血热及登革休克综合征,是热带、亚热带地区的一个严重公共卫生问题[1].2001年5月以来,泰国爆发登革热流行,国内目前尚未见病例报告,我院确诊一病例,患者男,19岁,工人,无外出史,主因恶心、呕吐5 d,发热2 d,于2001年10月12日到广州市东山区人民医院就诊,体温达39.5℃,伴头痛、眼眶痛,4 d后热退,而后四肢皮下出血.
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2017年河南省登革热疑似病例的实验室诊断与分子溯源
目的 对2017年河南省报告的登革热疑似病例进行实验室确诊,从分子水平追踪其来源.方法 血液标本(3～5 ml)来源于2017年河南省传染病监测网络直报系统中上报的8例登革热疑似病例,按照《全国登革热监测方案》对病例进行个案调查.血液样本分离血清后,通过检测血清中登革病毒非结构蛋白1抗原(NS1)、IgM和IgG抗体以及病毒RNA进行实验室确诊;对于登革病毒RNA检测阳性的样本进行荧光PCR分型诊断和E基因序列扩增,阳性扩增产物测序后进行同源性比对.结果 8个登革热疑似病例中6例确诊为登革热实验室诊断病例,均为境外输入;其中5例病例登革病毒RNA检测阳性,经分型检测发现,登革病毒1型为1例,2型和3型各2例;对1例登革病毒2型和1例3型病例成功进行了分子溯源,其中由巴基斯坦输入的登革病毒2型病例核酸序列属于cosmopolitan基因型,与巴基斯坦2013年登革病毒2型KJ010186一致性高,为99.0%;由马来西亚输入的登革病毒3型病例核酸序列属于Ⅰ型基因型,与2014年新加坡登革病毒3型KX224276一致性高,为99.0%.结论 2017年河南省登革热病例经实验室诊断和分子溯源证实均为输入性病例,未引起本地流行.
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登革疫苗研发新进展与面临的问题
登革病毒(Dengue virus,DENV)是一种通过伊蚊传播的单股正链RNA病毒,属于黄病毒科(Flaviviridae)黄病毒属(Flavivirus).DENV有4种血清型:DENV1、DENV2、DENV3和DENV4,无论感染了哪一型,出现的症状多为发热、头痛、关节疼痛等,大多数人初次感染会自然痊愈,但若再次受到不同型DENV的感染,很容易引发严重的登革出血热(dengue hemorrhagic fever,DHF)或是登革休克综合征(dengue shock syndrome,DSS)[1].
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刺络拔罐为主治疗登革热36例
登革热是由登革病毒经蚊子传播的急性传染病,根据症状不同有轻重型之分,治疗多对症治疗.
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两种品系小鼠建立登革病毒感染的湿热证模型研究
目的 建立两种不同品系小鼠登革病毒感染的湿热证模型,并比较感染情况差异,确定适合造模的小鼠.方法 根据中医温病湿热证的造模方法,采用复合因素:高糖高脂饲料加高温舱加感染因子(登革病毒),分别处理BALB/C和C57BL/6小鼠,同时设正常对照组(对照组)、病毒组(单纯病毒感染造模)、湿热组(单纯湿热条件干预造模),通过观察小鼠的体温、血小板数量、分离血清中病毒、肝脏病理学改变及血清学指标比较模型建立的情况.结果 造模后小鼠于高温舱处理时出现低热.与对照组比较,BALB/C模型组血小板降低,两种小鼠模型组和病毒组血清AST均升高,BALB/C模型组、湿热组血清TC、TG升高,差异有统计学意义(P＜0.05).各组肝组织均有不同程度的病理改变,以BALB/C模型组病变严重.用Real-time PCR检测造模后血清病毒滴度,各组无明显差异,病毒含量2.9×104～5.5×104拷贝数/mL.结论 初步构建登革病毒感染的湿热证小鼠模型,比较BALB/C 和C57BL/6小鼠感染情况,BALB/C更适合造模.
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Ⅲ型登革病毒D9964株在人胚肺二倍体细胞KMB17上适应株选育纯化及其增殖动力学研究
选育出Ⅲ型登革病毒中国株在人胚肺二倍体细胞KMB17上的适应株并对其生物学特性和增殖动力学进行研究,为研究登革病毒减毒活疫苗奠定基础.Ⅲ型登革病毒中国株D9964经RT-PCR鉴定型别正确后,进行毒种扩增和滴度测定;以4.0 MOI接种KMB17细胞,反复传代直至病毒能在细胞中适应和增殖;连续传10代,选育出KMB17细胞适应株,经三轮噬斑纯化筛选适应株,微量滴定法检测10代病毒培养液的感染性滴度;免疫荧光法检测纯化病毒株的抗原性;将病毒纯化株接种KMB17细胞,取第3～7 d细胞提取RNA,以Real-time PCR检测病毒适应株在细胞中的增殖动态.结果显示,经适应性培养后Ⅲ型登革病毒中国株D9964能在KMB17细胞中稳定增殖,经噬斑纯化获得了高纯度的细胞适应株,病毒保持了原始毒株良好的抗原性;增殖动力学研究显示第5～6 d为病毒在细胞内的增殖高峰期.
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抗登革病毒NS1单抗的制备及检测NS1方法的建立
制备抗登革病毒NS1蛋白单克隆抗体,建立检测NS1的ELISA方法.表达1～4型登革病毒NS1蛋白,将1型NS1蛋白纯化后免疫BALB/c小鼠,通过杂交瘤技术制备单克隆抗体.经ELISA、Western blotting、间接免疫荧光筛选和鉴定单克隆抗体,进行纯化和HRP标记.通过鉴定每两株单抗之间是否存在竞争作用,选择非竞争单抗组合并建立NS1捕获法ELISA.结果获得7株高滴度抗NS1单抗,捕获法ELISA可以检出10ng/mL NS1.原核表达登革病毒NS1蛋白制备的单抗可以和天然病毒抗原反应,NS1捕获法ELISA可以用于登革病毒感染检测.
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Ⅰ～Ⅳ型登革病毒包膜蛋白B细胞中和表位的鉴定
登革病毒包膜蛋白(Dengue virus envelope protein,DENV E)是诱导中和抗体主要的蛋白,登革病毒包膜蛋白Ⅲ区(Dengue virus envelope protein domainⅢ,DENV EDⅢ)是构建DENV亚单位疫苗的主要靶标,但是其B细胞中和表位目前了解不多.我们采用两组覆盖DENV-1EDⅢ的重叠多肽(12肽和16肽)同27株针对DENV-1EDⅢ中和单抗反应,筛选DENV EDⅢ上B细胞表位.采用该方法,我们发现了一高度保守的Ⅰ～Ⅳ型DENV共同交叉中和B细胞表位和一高度保守的DENV-1血清型特异性B细胞中和表位,分别位于DENV-1 E蛋白氨基酸残基序列第309～320位和第381～392位(Amino acid residues 309～320,and 381～392;aa 309～320和381～392).Ⅰ～Ⅳ型DENV共同交叉中和B细胞表位在Ⅰ～ Ⅳ型DENV分离株中存在高度保守共同序列310KE-VAETQHGT"9,DENV-1E蛋白中E309、V312、A313和V320不影响蛋白抗原性.DENV-1血清型特异性B细胞中和表位(DENV-1 E蛋白氨aa 381～392)在DENV-1分离株中高度保守,在黄病毒属其它病毒中不保守.我们也发现一具有DENV-1分离株特异性的B细胞中和表位位于DENV-1 E蛋白氨基酸残基序列第329～348位.这些新发现的DENV-1 E蛋白EDⅢ上B细胞中和表位可能有助于研制新的DENV亚单位疫苗.
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登革病毒非结构蛋白1结构及功能研究进展
登革病毒(Dengue virus,DENV)是一种严重威胁我国南方地区公众健康的虫媒病毒,无特异性的治疗方法和疫苗.单纯的登革病毒结构蛋白疫苗不能诱导针对四种血清型DENV的均衡、持久的保护性免疫,可能需要非结构蛋白成分.DENV非结构蛋白1(Non-structural 1 protein,NS1)在登革病毒致病和保护性机制中具有重要的作用,该蛋白诱导的免疫可能在防治登革疾病中具有重要的作用.本文就DENV NS1结构及功能的研究进展作一综述.
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两例输入性登革病毒合并基孔肯雅病毒感染实验室检测
对不明原因发热病人开展登革病毒和基孔肯雅病毒合并感染的检测,明确合并感染的可能性,为防御这两种虫媒传染病的传播提供依据.通过流行病史调查,临床症状和实验室检测对两名从泰国普吉岛旅行归来的发热病人进行了登革病毒和基孔肯雅病毒感染的诊断.两名患者在泰国旅行停留10天,在此期间两人均有蚊虫叮咬史.回国3天后两患者相继出现高热症状(39℃以上),且伴有皮疹,肌肉酸痛和乏力.实验室血常规检测发现轻度血小板降低伴淋巴细胞减少,登革病毒IgG/IgM快速诊断试剂盒检测发现一名患者登革病毒IgM阳性.实时荧光RT-PCR检测证实两患者血液中登革病毒和基孔肯雅病毒核酸均阳性,同时用RT PCR方法扩增获得了登革病毒C-prM蛋白部分基因,经测序和同源性分析,证实感染登革病毒属于Ⅰ型登革热病毒.这是我国首次出现的输入性登革病毒合并基孔肯雅病毒感染病例,本研究建议对流行病史和临床症状满足的病例要同时进行两种病毒的实验室检测.
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登革病毒样颗粒疫苗的研究现状
登革病毒引起的疾病是一种严重威胁人类健康的蚊媒性急性传染病.但至今仍没有获批准的疫苗可用.近年,一种新的病毒样颗粒(VLPs)能使免疫小鼠产生中和性抗体和持久、特异的T淋巴免疫记忆细胞.VLPs克服了传统疫苗的很多不足,具有较大应用潜力.
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荧光定量PCR检测感染登革2型病毒C6/36细胞和埃及伊蚊复制动态研究
本研究采用实时荧光定量PCR (FQ-PCR)方法,检测感染登革病毒C6/36细胞1～7d及感染埃及伊蚊1、3、5、7、9、11、13 d后,病毒在细胞和蚊虫体内增殖的动态变化.结果显示,随着时间增加,登革病毒增殖出现规律性变化.登革病毒在感染细胞1～2d后增殖不明显,3d后病毒开始大量复制达到高峰,但6d后有所下降.在蚊虫体内1～7d病毒增殖不明显,9d开始快速复制达到高峰,但11～13 d后下降至病毒载量稳定.实验表明登革病毒在细胞内复制增殖的佳时间在接种病毒3d后,在蚊虫体内9d开始快速复制达到高峰增殖,到11 ～13 d后蚊虫体内病毒增殖稳定波动.
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C6/36细胞感染登革Ⅱ型病毒后
本研究在C6/36细胞感染登革Ⅱ型病毒24h后,用DDRT-PCR对细胞基因表达的变化进行了研究,并对其中2条表达有变化的基因进行了序列分析,1条为感染后表达量增加的基因片段,1条为感染后表达量减少的基因片段,通过GenBank查询尚未发现同源序列.这一发现对于阐明登革病毒和其宿主细胞之间的关系,探讨病毒感染的细胞内机制有积极的意义.
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蚊虫抗登革病毒天然免疫效应
埃及伊蚊和白纹伊蚊是传播登革病毒(Dengue viruses)的主要媒介,通过一次感染血餐,登革病毒被蚊摄取,病毒首先感染蚊中肠组织,病毒越过蚊中肠到达蚊其它组织,包括涎腺.当感染病毒的蚊再次叮吸另一健康人血时,将涎腺中病毒传播给下一个人.蚊利用它的天然免疫系统抗登革病毒而使其"不发病",并能生存传播这种病毒.蚊抗登革病毒天然免疫主要涉及血细胞、Toll、JAK-STAT、RNAi通道等.本文就蚊抗登革病毒天然免疫效应做了综述.
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登革病毒受体的研究进展
登革热(Dengue Fever,DF)和登革热出血热(Dengue Hemorrhagic Fever,DHF)均是由登革病毒引起的一种病毒流行病，登革病毒在自然界中以4种不同的血清型存在，自然宿主是人和低等灵长类动物，主要由埃及伊蚊(Aedes aegypti)与白纹伊蚊(Ae.albopictus)作为传播媒介，是重要的虫媒病毒病；它广泛流行于全球的亚热带和热带地区，在我国则多发于台湾、海南、广东等沿海省分(Pinheiro and corber,1997).
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登革基因疫苗研究进展
登革热是由登革病毒引起的一种严重的虫媒病毒性传染病[1].登革病毒属于黄病毒科(Flaviviridae)黄病毒属(Flavivirus),其基因组为单股正链RNA,长约11kb,共编码3种结构蛋白(C、prM、E)和7种非结构蛋白(NS1、NS2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b、NS5)[2].
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登革病毒包膜蛋白疫苗的研究进展
登革热由登革病毒引起,有时会发生更严重的登革出血热和登革休克综合征,严重威胁人类的健康.登革病毒疫苗的研究已有50多年的历史,迄今仍无有效的疫苗被批准使用.病情加重的发病机制可能与抗体依赖的增强作用有关,理想的登革疫苗是对四种血清型登革病毒都具有保护作用.包膜蛋白是登革病毒的主要抗原,现以包膜蛋白为目的抗原的登革疫苗的研究作一综述.
