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登革4型病毒广东流行株NS2a-NS2b基因序列分析
目的分析登革4型病毒(DV4)广东株的基因序列,比较其同源性,追查DV4的地理来源.方法RT-PCR扩增DV4 NS2a-NS2b基因片段,克隆至PGEM T载体,分析其序列.结果1990年分离的4个毒株在所分析的区段具有相同的序列,与DV4H241、814669株、1978年广东株(GD7856B2)和1993年广东株(GZB5)的核苷酸(氨基酸)同源性分别是97%(98%)、94%(96%)、93%(98%)和99%(98%).GD7856B2株与DV4H241、814669株和1993年广东株(GZB5)的核苷酸(氨基酸)同源性分别是93%(98%)、96%(97%)和98%(93%).结论1990年引起广东省登革热流行的毒株很可能只有1个,1990年的毒株与1978年的毒株可能来自不同的疫源地.
关键词： 登革病毒 逆转录/聚合酶链反应 DNA序列分析 同源性 -
3株登革病毒1型广东分离株NS 1基因序列测定
登革热(Dengue fever,DF)是一种急性虫媒传染病,严重者表现为严重的登革出血热或登革休克综合征,后者死亡率可达5%.广东省自1978年以来,先后有10多次登革热暴发流行.
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分子信标实时荧光PCR检测登革病毒方法初步建立
目的 建立登革病毒分子信标实时荧光PCR检测方法.方法 针对登革病毒3'-UTR保守区设计引物和分子信标探针,构建阳性参考质粒,建立登革病毒分子信标实时荧光PCR检测方法.应用建立方法对血清标本进行检测,检测结果与TaqMan探针法进行比较.结果 所建立的分子信标荧光PCR检测方法灵敏度达102 copies/μL,与其它病毒无交叉反应;对70份血清标本检测结果与TaqMan探针法一致.结论 所建立的分子信标荧光探针法具有较高的灵敏度和特异度.
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登革热疫情流行病学特征分析和防控措施
由虫媒病毒传播的登革热(DF)是常见的感染性疾病之一,在全球热带和亚热带地区流行.然而,在过去30年中,DF有向温带地区周边蔓延的趋势.登革病毒(DV)是黄病毒科单股正链RNA病毒,分别为DV-1型、DV-2型、DV-3型、DV-4型,这四种血清型均可以引起DF.目前,DF疫情波及全球100多个国家,每年全世界约发生1亿例DF.尽管通常无症状或仅限于轻微的发烧,但是每年约有20 000死亡病例,可见DF已成为一个严重的公共卫生问题.目前在很多方面对DF认识不足,因此就需要针对DF的流行病学特征展开分析并提出相应的解决措施.
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我国登革热流行概况与预防控制措施研究进展
登革热(DF)是由登革病毒1-5型(DENV1-5)引起的经埃及伊蚊或白纹伊蚊传播的急性蚊媒传染病,该病多发生在全球热带和亚热带地区,已有128个国家发生DF病例,东南亚国家DF流行严重.1978年以来,我国经常有输入病例引起的DF疫情,广东、广西、云南、河南和福建等省均报告因输入病例引起暴发流行,2014年广东省和广西发生登革热暴发疫情.我国DF媒介白纹伊蚊分布广及密度高,因经济全球化发展,我国与东南亚国家交往密切.中国-东盟博览会落户广西,与东盟十国人员交往频繁,近年来,我国输入病例引起的DF暴发流行风险不断升高,目前本病无疫苗可供预防.为做好DF预防控制工作,该文收集近年DF文献资料,对我国该病流行概况、流行病学特征和预防控制措施等相关的研究进展予以综述.
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登革病毒诊断与疫苗研究进展
登革病毒(Dengue virus,DV)属于黄病毒科,是一种蚊媒急性传染病的病原体,所致疾病主要有登革热(Dengur fever,DF)、登革出血热(Dengue haemorrhagic fever,DHF)和登革休克综合征(Dengue shock syndrome,DSS),多发于热带和亚热带地区.该病具有世界性,全世界每年有上千万病例,过去25年约有3 500人死于此病.近年来,此病又有暴发流行的趋势.在临床上,登革热主要表现为高热、头痛、肌肉关节痛等,同时伴有白细胞减少;登革出血热则以高热、出血、休克和高病死率为特征;登革休克综合征则以临床过程较严重,伴有休克综合征为特点.本文就登革病毒的主要诊断方法及其疫苗研制的现状作一综述.
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佛山市南海区2012-2014年1型登革病毒基因特征研究
目的 测定佛山市南海区2012-2014年登革病毒1型(DENV 1)的E基因序列,探讨其来源及基因特征.方法 收集佛山市南海区2012-2014年本地登革热疑似病例急性期血清标本进行登革病毒核酸及分型检测,用RT-PCR法扩增1型登革病毒的全长E基因,经测序后获得E基因序列,并绘制进化系统发育树进行分子流行病学分析.结果 554份病例标本中检出279份DENV核酸阳性,其中DENV 1 271份(97.1％),DENV 2 8份(2.9％),测序获得15株DENV 1 E基因序列,DENV 1碱基同源性为90.3％～99.9％,推导氨基酸同源性为97.2％～100.0％,其同源性与1998、2004、2006、2010和2013年国内DENV 1流行株接近.进化分析发现DENV 1可归属于两个亚型,亚洲型和美洲/非洲型.结论 佛山市南海区2012-2014年以DENV 1型流行为主,其存在两种基因亚型流行,登革病毒与周边相邻地区如佛山及广州市的登革病毒存在明显关联性,具有地方性登革热流行趋势.
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Ⅱ型登革病毒非结构蛋白NS1的克隆表达及抗体制备
目的 克隆表达Ⅱ型登革病毒(dengue virus 2,DV2)非结构蛋白1(DV2-NS1)基因,并制备其单克隆抗体.方法 提取Ⅱ型登革病毒的RNA,扩增其NS1全长基因片段,经TA克隆将NS1基因克隆至pQE30载体中进行诱导表达,表达产物经变性处理后用Ni柱亲和层析纯化并复性,经免疫印迹法(Western Blot)鉴定抗原性.用复性后的NS1蛋白和灭活Ⅱ型登革病毒交替免疫Balb/c小鼠,取小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合,杂交瘤细胞经间接ELISA法、间接免疫荧光法(IFA)进行单抗亚类、特异性的筛选与鉴定.结果 携带重组质粒pQE30/DV2-NS1的菌株经诱导,可高效表达重组DV2-NS1蛋白,经复性获得可溶性蛋白,Western Blot证实重组的DV2-NS1蛋白具有抗原性;用重组蛋白和病毒混合免疫,共获得10株抗NS1蛋白的单抗,其中3株为特异性抗DV2-NS1蛋白,与其他3型登革病毒无交叉,另7株为混合交叉型;亚类分析一株为IgG2b,余为IgG1.结论 获得重组Ⅱ型登革病毒非结构蛋白NS1,并得到10株抗DV2-NS1蛋白的杂交瘤细胞株,为进一步研究NS1的生物学特性和临床诊断试剂建立奠定了基础.
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登革2型病毒感染小鼠体内病毒迁移及分布
目的观察登革病毒在感染动物模型体内的迁移和分布特点,了解登革病毒的感染致病机制.方法以2型登革病毒新几内亚(NGC)株和临床分离株病毒悬液皮下注射,建立登革病毒感染的小鼠模型.于感染后不同时间采集小鼠血浆、肝、脾、肾、脑等脏器组织,用病毒分离及RT-PCR方法检测病毒的存在.结果2株2型登革病毒感染小鼠后,在小鼠血浆、肝脏、脾脏、肾脏和大脑组织中均可检测到病毒,病毒在脑组织中持续存在的时间长,在肝脏中滞留时间短.临床分离株感染小鼠体内病毒持续时间较NGC株长.结论登革病毒感染后病毒呈全身性多脏器组织分布,临床分离株的致病作用较NGC株强.
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不明原因发热病人血清中登革病毒核酸检测
目的 对贵州省独山县、兴义市两地夏秋季不明原因发热病人血清进行登革病毒(DEN)核酸检测,以了解贵州省人群DEN的感染情况.方法 2005年6～10月份,收集贵州省独山县、兴义市不明原因发热病人血清356份;用常规碘化钠法提取发热病人血清总RNA,用DEN NS1基因区特异性通用引物进行逆转录-聚合酶链式反应法(RT-PCR),对部分目的 条带进行序列测定,并进行氨基酸序列预测和序列同源性分析.结果 贵州省独山县、兴义市两地夏秋季不明发热病人血清中DENNS1基因区的核酸阳性率为9.83%(35/356);对其中7份标本(兴义5份,独山2份)进行序列测定,均为DEN-2;根据核酸序列进行同源性分析,证实其与DEN-2-43同源性较高,为97.4%(525/539),7份标本之间的同源性为97.6%(526/539).结论 贵州省独山县、兴义市两地人群中存在DEN感染.
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广州市天河区登革热流行现况及防制调查
登革热(dengue fever,DF)是由登革病毒(dengue virus,DV)经蚊媒传播引起的一种急性传染病.DF是分布广、发病多的一种虫媒病毒性疾病,主要在热带、亚热带地区流行[1].广东省是我国登革热流行的严重地区[2,3],研究该地区该病相关流行因素,为有效控制流行提供相关理论依据,我们进行了流行现况及控制措施调查.现将结果报告如下.
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登革病毒感染C57BL/6j小鼠动物模型建立
目的 建立登革病毒2型(DEN-2)感染C57BL/6j小鼠模型,测定小鼠血液中的登革病毒含量.方法 构建标准品质粒;用2种不同剂量(2×108 copies/只;2×109 copies/只)的DEN-2国际标准(NGC)株腹腔感染C57BL/6j小鼠;绝对定量荧光PCR法测定感染后小鼠外周全血病毒含量.结果 C57BL/6j小鼠经腹腔感染病毒后,2×108 copies/,只感染组和2×109 copies/只感染组测得第1,3,5 d的病毒含量分别为1.05×103.5～1.05×103.7,1.05×103.8～1.05×103.9,1.05×103.5～1.05×103.7;1.4×103.5～1.4×104.4,1.4×106.9～1.4×107.32,1.4×103.8～1.4×104.8 copies/mL.结论 成功建立登革病毒感染小鼠模型,外周血液中病毒含量呈峰状,于感染后第1 d病毒含量增加,第3 d达到高峰,第5 d呈下降趋势.
关键词： C57BL/6J小鼠 登革病毒 动物模型 -
登革1型病毒荧光定量PCR快速检测
目的 建立登革1型病毒的快速特异的荧光定量PCR检测方法.方法 设计登革1型病毒特异的引物和TaqMan探针,制作标准曲线,并检测其特异性、重复性、再现性和敏感性,采用荧光定量PCR和常规PCR对临床标本进行检测比较.结果 成功构建了标准曲线,回归方程为Y=-3.41010gX +45.10,相关系数R2=0.999,扩增效率Eft =96.5％,灵敏度可达103copies/mL,此荧光定量PCR方法对登革1型病毒检测高度特异,与其他3型登革病毒和乙型脑炎病毒之间并无交叉反应；采用登革病毒种特异引物探针和本研究建立的登革1型病毒型特异引物探针对166份cDNA样本进行荧光定量PCR检测,均发现126份为阳性,阳性率均为75.9％,Ct值为20.84～36.36,浓度范围为1 ～1.3×104copy/μL;常规PCR方法检测到其中36份为阳性,阳性率为21.7％.结论 荧光定量PCR方法能够快速灵敏地检测登革1型病毒,并能实现对病毒滴度的绝对定量.
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4种病原抗体液相芯片同步检测方法建立
全球经济化的发展、贸易的开通,交通的便捷,无不为各国旅行、探亲、交易打开了方便之门,人口流动速度加快,与此同时传染病的传播也随之蔓延[1].为保障居民生命健康安全,进行国境口岸传染病病原抗体的快速筛查,为传染病的传入与传出建立一道屏障有重要意义[2].本研究建立针对登革病毒、土拉菌、禽流感病毒、西尼罗病毒4种病原抗体高通量快速筛查的液相芯片检测方法.结果报告如下.
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登革热减毒活疫苗研究进展
登革病毒(Dengue Virus,DV)感染引起的疾病是重要的虫媒病毒病之一.自1978年以来我国南方每隔几年就暴发一次.1999年8月在福州市城乡结合部发生登革热流行,患者达1000多人[1].南亚、东南亚均是登革热高发区.
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登革热和登革出血热
登革热和登革出血热是由登革病毒引起、经伊蚊传播的一种急性传染病.主要流行于热带和亚热带地区.为乙类传染病.登革热临床特征为起病急骤、发热、头痛、全身肌肉及骨关节疼痛、极度乏力,部分患者可有皮疹、淋巴结肿大和白细胞减少.登革出血热还表现有肝脏肿大、血小板减少、严重出血和休克.
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登革病毒感染树突状细胞的分子机制研究进展
1 登革病毒的流行病学及生物学特征1.1 流行分布特点 世界分布:登革病毒(DENV)由埃及伊蚊和白纹伊蚊传播,在热带和亚热带地区广泛分布,随着城市化进程逐步向城市扩散.登革病毒感染能引起登革热(DF)、登革出血热(DHF)和登革休克综合征(DSS).登革热流行的特点是出现突然、来势猛、传播快.据WHO估计,近50年全世界感染率增加了30倍,每年大约有1亿人感染,50万人患登革出血热、登革休克综合症,其中2.5万人死亡,并且患者多数是15岁以下的儿童[1].尽管登革病毒感染严重威胁人类的健康,但目前还没有有效的治疗方法.
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DV2 NGC株感染BALB/C小鼠后IL-4、IFN-γ产生动态的研究
目的:观察2型登革病毒NGC株感染BALB/C小鼠后其IL-4、IFN-γ产生动态,研究登革病毒感染的免疫机制.方法:用不同含量的DV2 NGC株经皮下多点注射,间接ELISA法测定感染后不同时间各组小鼠血浆IL-4、IFN-γ含量.结果:DV2 NGC株感染小鼠产生IL-4和IFN-γ动态不同.初次感染早期,IL-4水平明显升高,而IFN-γ处于较低水平;再次感染后第1天,IL-4水平达高峰(4 294.668±349.038 pg/ml),IFN-γ则于第4天和第11天达较高水平,两者的产生彼消此长,且产生动态与感染病毒量有关.结论:DV2 NGC株感染早期,体液免疫和细胞免疫相互影响,体液免疫占主导作用,为Th2应答优势.但在登革热感染后期,细胞免疫一定程度抑制Th2应答,使病情好转.
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登革病毒E蛋白抗原基因肌肉注射诱导小鼠免疫应答的初步研究
目的:研究登革病毒E基因免疫的可行性.方法:用脂质体转染法将构建的E基因重组真核表达质粒pcDNA3-E导入小鼠成纤维细胞NIH3T3细胞,SDS-PAGE和蛋白质印迹试验检测E基因的体外表达.然后将该重组真核表达质粒经肌肉注射免疫BALB/c小鼠,检测其诱发特异性免疫应答水平.结果:重组真核表达质粒pcDNA3-E在小鼠体内诱发一定水平的体液和细胞免疫应答,且持续时间较长.结论:登革病毒E基因免疫可诱发特异性免疫应答,为登革病毒疫苗的研制提供了实验依据.
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登革病毒抗原肽免疫小鼠诱导特异性CD4+ T细胞反应
目的:探讨4条登革病毒抗原肽在不同遗传背景小鼠中的免疫原性.方法:4条登革病毒抗原肽(C45-57KLVMAFIAFLRFL,E396-408SSIGKMFEATARG,NS323-35YRILQRGLLGRSQ 和 NS3141-155NREGKIVGLYGNGVV) 中每条肽分别免疫BALB/c小鼠和C57BL/6小鼠;3周后,处死小鼠并制备脾细胞悬液;不刺激或同样抗原肽刺激脾细胞后,采用细胞内细胞因子染色流式细胞术(ICS) 检测小鼠脾细胞CD4+ T细胞中肽特异性产生IFN-γ或IL-4的CD4+ T 细胞的百分比.结果:肽C45-57可诱导BALB/c小鼠产生特异性的IFN-γ+ CD4+ T细胞(0.72%±0.04% vs 0.04%±0.02%,P＜0.05)而肽E396-408 则诱导产生特异性的IL-4+ CD4+ T细胞(0.09%±0.01% vs 0.01%±0.01%,P＜0.05);肽E396-408、NS323-35和NS3141-155均可诱导C57BL/6小鼠产生特异性的IFN-γ+ CD4+ T细胞(分别为0.31%±0.03% vs 0.02%±0.01%,P＜0.05;0.21%±0.03% vs 0.04%±0.01%,P＜0.05;0.44%±0.04% vs 0.02%±0.01%,P＜0.05),而肽C45-57可诱导产生特异性的IL-4+ CD4+ T细胞(0.45%±0.05% vs 0.02%±0.02%,P＜0.05).结论:肽C45-57和E396-408在BALB/c小鼠中具有免疫原性而肽C45-57、E396-408、NS323-35和NS3141-155在C57BL/6小鼠中具有免疫原性.
