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PINK1参与调节多巴胺的合成
目的 探讨PINK1基因对多巴胺合成的调节作用.方法 用高压液相色(HPLC)电化学方法检测多巴胺(DA)含量,用Western blots和Real-Time PCR法检测DA合成限速酶酪氨酸羟化酶(TH)和多巴脱羧酶(DDC)的表达量,通过免疫共沉淀(Co-IP)和免疫组织化学染色观察PINK1和TH之间是否存在相互作用.结果 PINK1基因敲减后,细胞内DA水平为5.356±0.536 μg/L,显著低于对照组的11.630±1.559 μg/L (P ＜0.05)；TH mRNA和蛋白的表达分别为0.371±0.140和0.195 ±0.062,显著低于对照组的1.009±0.152和0.386 ±0.044 (P＜0.05)；DDC mRNA和蛋白的表达分别为0.396 ±0.124和0.149±0.029,显著低于对照组的1.100±0.070和0.323±0.037 (P ＜0.05)；免疫荧光化学检测PINK1和TH存在共定位,Co-IP显示PINK1和TH存在相互作用.结论 PINK1可以通过调控DA的合成酶TH和DDC的表达影响DA的合成.
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RNA干扰沉默BAX基因抑制大鼠软骨细胞凋亡及其可能机制
目的 研究RNA干扰沉默BAX基因表达对经线粒体途径大鼠软骨细胞凋亡的影响.方法 体外分离培养SD大鼠软骨细胞；BAX siRNA干扰沉默BAX基因表达.RT-PCR检测BAX mRNA；MTT法检测细胞活力；Annexin V-FITC/PI双标记法检测细胞凋亡率；Western blot检测BAX、BCL-2、细胞色素C蛋白的表达.结果BAX siRNA干扰24h后,BAXmRNA表达为1.030±0.153,对照组为1.836±0.164；蛋白质的表达为0.359±0.089,对照组为0.766±0.082,实验组较对照组明显下调(P＜0.01).细胞凋亡受到明显抑制,对照组、model组、model+ BAXgiRNA组和model+ control siRNA组细胞凋亡率分别为2.87％、20.07％、9.21％和21.19％,并且在BAX基因沉默的细胞中,细胞色素C蛋白表达水平降低,同时BCL-2蛋白表达水平升高.结论RNA干扰沉默BAX基因可抑制大鼠软骨细胞凋亡并且促进其存活,其机制可能与线粒体途径相关.
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DNMT2在胃癌的表达及靶向抑制
目的 研究DNA甲基化转移酶2(DNMT2)在胃癌的表达,并分析靶向抑制DNMT2对胃癌的影响.方法 免疫组化法对60例胃癌与癌旁组织,免疫荧光法对胃癌细胞SGC-7901行DNMT2表达研究.构建3个靶向抑制DNMT2的siRNA(DNMT2-siRNA-1,DNMT2-siRNA-2,DNMT2-siRNA-3).转染DNMT2-siRNA入SGC-7901,RT-PCR 及Western免疫印迹法验证DNMT2的抑制效果.噻唑蓝比色法检测SGC-7901增殖率.结果 胃癌组织DNMT2表达率43.3％,显著低于癌旁组织的93.3％(P＜0.05)；晚期及低分化胃癌组织的DNMT2表达率更低(P＜0.05).DNMT2在胃癌细胞核表达显著.DNMT2-siRNA可成功转染SGC-7901,并成功筛选靶向抑制DNMT2的siRNA(DNMT2-siRNA-3).发现转染DNMT2-siRNA-3后96 h与120 h,SGC-7901增值率1.138±0.110与1.078±0.060较对照增殖率1增加(P＜0.05).结论 DNMT2在胃癌表达降低,抑制DNMT2可能利于胃癌增殖.
关键词： DNA甲基化转移酶2 胃癌 RNA干扰 表观遗传 -
CD44RNAi对EJ细胞增殖、迁移及其与特异性单抗结合力的影响
目的 研究EJ细胞中CD44小RNA干扰后细胞增殖、迁移功能以及其与特异性单抗KMP1结合力的改变.方法 小RNA干扰的方法抑制EJ细胞中CD44表达,Western blot和流式细胞仪检测EJ细胞与CD44特异性单抗KMP1的结合功能变化,细胞划痕实验和Boyden小室检测shCD44-EJ细胞的迁移功能,[3H]掺入法检测shCD44-EJ细胞的增殖能力.结果 shCD44-EJ细胞与KMP1的结合能力下降,CD44的表达量也降低,Wide type组和shCD44-EJ组的迁移到划痕中央的细胞数分别为257 ±32个和132±29个,shCD44-EJ组和Vector组细胞迁移到膜中和下室中的平均细胞数为356±13和672±17个,显示shCD44-EJ细胞的迁移能力较Wide type组和Vector组分别降低52％和53％,shCD44-EJ细胞的增殖活性是Vector组的73％.结论 特异性沉默CD44可降低EJ细胞与其特异性单抗KMP1的结合功能,并抑制EJ细胞的迁移和增殖能力.
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ATP1A1基因沉默抑制人胶质瘤细胞U251侵袭
目的探讨沉默Na+/K+ATP酶A1亚基(ATP1A1)对人U251胶质瘤细胞系侵袭能力的影响及其机制.方法用shRNA-ATP1A1慢病毒感染人U251胶质瘤细胞,RT-qPCR及Western blot分别检测ATP1A1 mRNA和蛋白的表达;MTT法检测细胞体外的增殖;细胞划痕实验及Transwell小室检测细胞的迁移及侵袭能力;Western blot检测基质金属蛋白酶2/9(MMP-2/9)的表达.结果沉默ATP1A1细胞的ATP1A1 mRNA和蛋白表达均受到了明显抑制;细胞的增殖和迁移、侵袭能力也显著受抑(P<0.05);MMP-2和MMP-9的表达也明显降低(P<0.05).结论靶向ATP1A1干扰能够明显抑制胶质瘤U251细胞的体外增殖、迁移及侵袭,其机制可能与MMP-2、MMP-9的下调相关,ATP1A1可能作为胶质瘤治疗的一个潜在靶点.
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Wnt2在肝细胞肝癌中的表达及对HepG2细胞增殖的影响
目的 探讨Wnt2在原发性肝细胞肝癌(HCC)中的表达及转染靶向Wnt2的siRNA对人肝癌HepG2细胞的抑制效果.方法 实时荧光定量PCR法和免疫组化法检测Wnt2在肝癌组织,癌旁组织及正常肝组织的表达差异；使用siRNA沉默人肝癌HepG2细胞Wnt2的表达后,检测Wnt2基因和蛋白的表达变化,并检测细胞的增殖和周期变化.结果 1)Wnt2在癌内表达高,癌旁次之,正常肝低.2)使用siRNA沉默人肝癌HePG2细胞Wnt2后,Wnt2基因和蛋白表达下调,细胞增殖受抑制,其生长主要停滞在G0/G1期,而S期细胞所占比例下降.结论 肝细胞肝癌中存在Wnt2的高表达；siRNA可抑制HepG2细胞Wnt2的表达,并抑制HepG2生长,Wnt2基因可能是调控肝癌基因表达的新的靶基因.
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下调Notch1信号抑制人神经母细胞瘤SH-SY5Y的增殖能力
目的 探讨Notch1基因与人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞增殖能力的关系.方法 应用-分泌酶抑制剂DAPT或表达Notch1-shRNA慢病毒载体阻断SH-SY5Y细胞Notch1信号的活化,RT-PCR和Western blot法行Notch1及Hes1表达水平的检测,MTT法和裸鼠体内种植检测瘤细胞体内外增殖能力的变化.结果 DAPT处理和表达Notch1-shRNA慢病毒载体转染均能减少细胞内NICD和Hes1表达,其细胞体外增殖能力受到明显抑制(P＜0.01),Notch1 RNAi细胞体内种植瘤重为0.20±0.13 g,明显轻于对照组的0.89 ±0.58 g(P ＜0.01).结论 Notch1信号的活化与人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞的增殖能力密切相关,有望成为神经母细胞瘤基因治疗的潜在靶点.
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人膀胱癌EJ细胞EZH2基因表达降低后基因表达谱的差异分析
目的 利用基因芯片技术筛选膀胱癌EJ细胞EZH2基因RNA干扰后的差异表达基因,探讨EZH2基因在肿瘤中的作用机制.方法 构建EZH2基因的shRNA表达载体,转染膀胱癌EJ细胞,基因芯片筛选差异表达基因并上传passway miner服务器(http://www.biorag.org./passway.htm)进行功能分类.结果 差异表达基因436条,下调179条,上调257条,功能聚类分析显示115个差异表达基因定位于已知的生物通路中,有EGF信号传导通路、P53传导通路、细胞增殖、细胞周期通路、Notch、Wnt通路等.EZH2靶基因WNT1、MYT1、CNR1、WT1表达上调,部分通路及基因与肿瘤干细胞和细胞分化有关.结论 EZH2基因通过多个基因介导参与细胞分化,对EZH2相关基凶的研究有助于明确EZH2在细胞癌变过程中的作用机制.
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MYH9在人肝癌组织中的表达及其对肝细胞系增殖和凋亡的影响
目的 探讨非肌肉肌球蛋白重链(MYH9)在肝癌组织中的表达及通过沉默MYH9基因对肝癌细胞系SMMC-7721的增殖及凋亡的影响.方法 收集50组人肝癌组织及癌旁组织,选用人肝癌细胞系SMMC-7721和HepG2及人正常肝细胞系LO2,免疫组织化学方法及Western blot检测肝癌组织及癌旁组织中MYH9蛋白的表达,Western blot检测SMMC-7721、HepG2及L02中MYH9蛋白的表达;将MYH9 siRNA转染SMMC-7721,CKK8法及流式细胞术检测沉默MYH9对肝癌细胞增殖及细胞凋亡的影响.结果 MYH9蛋白在肝癌组织中的表达明显高于癌旁(P ＜0.05);MYH9蛋白在SMMC-7721及HepG2中的表达均明显高于L02(P＜0.05);沉默MYH9基因可抑制细胞增殖(P＜0.001),促进细胞凋亡(P＜0.05).结论 MYH9蛋白在肝癌组织的表达显著高于癌旁组织;MYH9低表达能有效抑制肝癌细胞的增殖,促进其凋亡.
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siRNA阻断NF-κB信号通路抑制宫颈癌HeLa229细胞的增殖及侵袭
目的 通过RNA干扰阻断宫颈癌HeLa229细胞中NF-κB信号通路,研究其与肿瘤细胞增殖、耐药和侵袭力的关系.方法 利用RNAi技术,将HeLa229分为转染组和对照组,MTY法检测细胞增殖,Boyden chamber体外侵袭实验检测细胞体外侵袭力.结果 MTT实验表明,转染组细胞存活率比对照组明显下降,联合应用化疗药,转染组和对照组细胞的存活率均随着5-Fu浓度的增加而下降,但在同一浓度,siRNA与5-Fu联合应用可明显提高HeLa229细胞对化疗药的敏感性.体外侵袭实验结果表明,和对照组相比,转染P65 siRNA组穿越Matrigel胶的细胞数明显减少(P0.05).结论 应用RNAi技术可有效阻断NF-κB信号通路,抑制宫颈癌细胞的增殖和体外侵袭力,增强对5-Fu的敏感性.因此,可将NF-κB信号通路作为宫颈癌基因治疗的靶点.
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生长因子受体结合蛋白-2抑制肠癌细胞HT29增殖
目的 研究Grb2 shRNA转染对肠癌细胞HT29增殖相关信号通路的影响,探讨以Grb2为肠癌治疗靶点的可行性.方法 应用shRNA慢病毒质粒系统,将Grb2 shRNA转染至293T细胞,获得5株不同序列Grb2 shRNA慢病毒颗粒,并感染肠癌HT29细胞,分别获得的5株感染Grb2 shRNA慢病毒颗粒的肠癌HT29细胞系为实验组(即感染Grb2 shRNA的细胞HT29/shGrb2-69、HT29/shGrb2-70、HT29/shGrb2-71、HT29/shGrb2-72、HT29/shGrb2-73),以eGFP shRNA慢病毒感染肠癌HT29细胞为阴性对照组.MTT法检测细胞增殖情况,RT-PCR检测Grb2 mRNA表达,Western blot检测Grb2、P42/44 ERK、磷酸化P42/44 ERK、Akt、磷酸化Akt(P-Akt)和STAT5等信号通路分子表达的改变.结果 感染shGrb2病毒72 h,HT29/shGrb2-69、HT29/shGrb2-73两株细胞在mRNA和蛋白水平均出现抑制现象.HT29/shGrb2-69、HT29/shGrb2-73细胞在感染后24h A值分别为0.176±0.045,0.186±0.013,感染48 h后为0.347±0.048、0.382±0.041均显著高于空白对照、阴性对照(P ＜0.001),72 h为0.934±0.038、0.983±0.205高于空白对照、阴性对照(P＜0.01);感染后72 h,phospho-P42/44 ERK、Akt、phospho-Akt明显下降,而ERK、STAT5表达不受影响.结论 在HT29细胞,Grb2 mRNA和蛋白水平上明显抑制,可诱导HT29细胞增殖和相关信号传导通路分子表达下调.
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siRNA阻断鼠成肌细胞myostatin表达对细胞增殖及分化能力的影响
目的 研究myostatin表达被阻断后鼠成肌细胞的增殖及分化能力.方法 构建可阻断myostatin表达的siRNA表达载体,并转染鼠成肌细胞,用实时荧光定量RT-PCR和Western印迹鉴定myostatin表达.培养myostatin表达被阻断的成肌细胞,计数不同时间的细胞数和测定细胞表达的肌酸激酶.使用诱导分化培养液培养myostatin表达被阻断的成肌细胞,观察其分化成肌管的能力.结果 siRNA表达载体对成肌细胞myostatin表达的干扰率为81.6%,其干扰效果也被Western印迹所证实.Myostatin表达被阻断的成肌细胞数目增加(P<0.05),细胞内肌酸激酶活力升高(P<0.05).正常成肌细胞培养7 d可分化成肌管,myostatin表达被阻断后需10 d才分化成肌管.结论 siRNA表达载体阻断成肌细胞的myestatin表达后细胞的增殖能力增强,分化被延迟,或许可成为治疗肌肉萎缩的一种新途径.
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P53 shRNA对肝癌细胞增殖的影响
目的 观察用RNA干扰(RNAi)下调SMMC-7721人肝癌细胞系P53表达后对细胞增殖及P21蛋白表达的影响.方法 设计合成P53基因的短发夹RNA(shRNA),并构建pGPU6/GFP/Neo-P53 shRNA重组质粒.重组质粒转染SMMC-7721细胞,经G418抗性筛选获得阳性克隆.克隆形成实验观察细胞的增殖,RT-PCR法及Western blot 法分别检测P53、P21的mRNA及蛋白表达.BALB/c裸鼠皮下注射SMMC-7721细胞,建立移植瘤模型,瘤部位多点注射pGPU6/GFP/Neo-P53 shRNA,观察瘤体积变化和瘤重.结果 P1、P2、P33条P53 shRNA均可明显降低P53mRNA水平(P＜0.05,P＜0.05,P＜0.01)；干扰P53表达明显升高SMMC-7721细胞克隆形成率(P＜0.05),P21mRNA和蛋白的表达均随着P53的沉默而显著降低(P＜0.05).P53 shRNA明显增加裸鼠移植瘤的体积和重量(P＜0.05).结论 shRNA干扰P53基因可抑制P53和P21蛋白表达,使癌细胞恶性增殖.
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Fzr1基因沉默促进滋养层细胞的侵袭与增殖
目的 观察Fzr1蛋白在胎盘发育过程中时空性表达变化及其对滋养层细胞侵袭与增殖的影响.方法 免疫印迹和免疫组化法观察Fzr1蛋白的表达量和表达部位,通过RNA干扰技术、Transwell实验和MTS法检测Fzr1对滋养层细胞侵袭和增殖.结果 1)在妊娠早期,Fzrl蛋白强烈表达于绒毛的细胞滋养层和合体滋养层细胞,阳性信号主要位于胞质.在妊娠晚期,Fzr1蛋白主要表达于合体滋养层细胞,且表达量明显下降,阳性信号主要定位于胞核.与妊娠早期相比,妊娠晚期Fzr1蛋白下降4.88倍(P＜0.01).2)与空白对照组相比,Fzr1干扰组,JAR细胞的侵袭能力明显增强(P＜0.01),而无义对照,没有明显变化.3)与空白对照组相比,Fzrl干扰组,JAR细胞的增殖能力明显增强(P＜0.01),而无义对照,没有明显变化.结论 Fzr1蛋白在正常妊娠胎盘呈现时空性的表达,Fzr1基因沉默能促进滋养层细胞的侵袭和增殖能力.
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沉默TROP2基因抑制胃癌BGC-823细胞体外迁移侵袭能力
目的 探讨TROP2基因在胃癌细胞迁移侵袭过程中的作用.方法 用基因克隆技术构建针对TROP2的小干扰RNA(siRNA),瞬时转染胃癌BGC-823细胞系,荧光实时定量PCR和Western blot法检测细胞TROP2 mRNA和蛋白表达水平,MTT法测定细胞增殖能力,Transwell小室实验观察细胞迁移侵袭能力.结果 酶切鉴定和DNA测序分析显示,TROP2靶向RNA干扰重组质粒构建成功.筛选得到佳十扰效果质粒,该质粒转染细胞后,细胞增殖和迁移侵袭能力显著下降(P<0.05).结论 干扰TROP2基因具有抑制胃癌BGC-823细胞迁移侵袭的作用,TROP2基因可能成为癌基因靶向治疗的分子靶点.
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siRNA干扰14-3-3ζ基因可体外促进人胃癌SGC-7901细胞凋亡
目的 探讨siRNA干扰14-3-3ζ基因对人胃腺癌细胞系SGC-7901增殖凋亡的影响及其作用机制.方法 利用siRNA干扰技术降低14-3-3ζ基因的正常表达的SGC-7901细胞为实验组,siRNA-control的对照组和未加处理的空白组.用实时荧光定量PCR和Western blot检测14-3-3ζ基因mRNA的表达水平和蛋白表达水平;CCK8实验检测各组SGC-7901细胞的增殖;流式细胞术检测细胞周期和凋亡;Western blot检测周期和凋亡相关蛋白P53、cyclinD1、PUMA、Bax和Bcl-2.结果 siRNA干扰组14-3-3ζ基因的mRNA和蛋白表达水平低于空白组和对照组(P ＜0.05);CCK8检测细胞增殖较对照组显著降低(P＜0.05);siRNA干扰组细胞周期G0/G1的比率较对照组高,而G2/M和S期则显著降低(P＜0.05);siRNA干扰组的细胞凋亡率也显著升高(P＜0.05);相关通路蛋白在siRNA干扰组中cyclin D1和Bcl-2表达降低,P53、PUMA、Bax蛋白表达增高(P＜0.05).结论 siRNA干扰14-3-3ζ可以通过P53通路,下调cyclin D1抑制SGC-7901细胞增殖并阻滞周期,上调PUMA、Bax蛋白和下调Bcl-2蛋白促进细胞凋亡.
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HLA A表达沉默和酪氨酸羟化酶过表达的人成纤维细胞脑内移植治疗帕金森病大鼠模型
目的 观察人白细胞抗原A(HLA A)敲减和酪氨酸羟化酶(TH)过表达的人胚肺成纤维细胞(HELFs)于脑内移植后帕金森病(PD)大鼠的旋转行为和脑内炎性反应.方法 用TH反转录病毒和携带HLA A干扰序列的慢病毒(表达绿色荧光蛋白GFP)感染细胞后移植于PD大鼠模型纹状体.移植后检测大鼠旋转行为,免疫组化染色观察TH、OX42、OX6和GFAP表达,GFP观察移植物存活.同时移植HELFs以及TH转导的HELFs和大鼠肺成纤维细胞作对照.结果 移植后GFP荧光细胞数量逐渐减少,HLA A敲减组细胞的减少相对较轻,但对大鼠旋转行为的改善不明显;OX42阳性小胶质细胞改变不明显,但OX6表达逐渐增加,而GFAP阳性细胞激活逐渐下降但仍强于移植对侧.结论 HLA A表达沉默细胞移植对大鼠运动症状改善不明显,细胞移植能激活小胶质细胞和星形胶质细胞.
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shRNA抑制人肺癌细胞A549 SURVIVIN基因表达
目的 构建存活素(SURVIVIN)基因的短发夹RNA(shRNA)表达质粒,为肺癌RNA干扰(RNAi)途径的基因治疗打下基础.方法 设计并合成SURVIVIN短发夹结构模板序列,与穿梭载体重组质粒后转染人肺癌细胞A549,通过RT-PCR法筛选出抑制效果强的质粒;MTT和Western blot法检测该质粒对细胞增殖和SURVIVOIN表达的影响.结果 构建和筛选出抑制作用强的质粒;该质粒能明显抑制A549细胞的增殖和SURVIVIN的表达.结论 在RNAi的介导下,SURVIVIN的表达被下调,为肺癌的基因治疗提供实验依据.
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NEK2基因沉默促进卵巢癌细胞SKOV3凋亡
目的 研究siRNA干扰NEK2表达对卵巢癌细胞SKOV3增殖和凋亡的影响及其分子机制.方法 设计合成3条对NEK2的siRNA,转染进SKOV3细胞,采用real-time PCR和Western blot技术筛选出抑制效率高的NEK2-siRNA序列,进行后续实验；分别采用MTT和流式细胞学技术检测细胞增殖和凋亡,用Western blot检测BAD、BCL-2和caspase-3的表达.结果 1)RNA干扰序列2对SKOV3细胞NEK2的抑制效果明显；2)与空白组和阴性对照组相比,NEK2-siRNA转染48 h后,SKOV3细胞增殖能力下降,发生凋亡的细胞增加(P＜0.01)；3)与空白组和阴性对照组相比,NEK2-siRNA转染48 h后,SKOV3细胞中BAD和caspase-3的蛋白表达上调,而BCL-2的蛋白表达下调(P＜0.01).结论 NEK2-siRNA可能通过沉默NEK2的表达,促进卵巢癌细胞SKVO3的凋亡.
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小RNA干扰PCBP2在神经胶质瘤细胞中对P53相关基因的调节和对细胞增殖的影响
目的 探索多聚胞嘧啶结合蛋白2(PCBP2)表达下调对相关基因和胶质瘤细胞增殖的影响.方法 3株神经胶质瘤细胞系(T98G、U87MG和U251)各分为2组,分别转入特异性靶向PCBP2基因的小干扰RNA (siRNA)和对照siRNA,用Western blot法检测siRNA对PCBP2蛋白的抑制效果及对P53蛋白和它的两个靶基因PUMA和BAX的表达影响,同时检测P53共调节因子FHL2和同家族成员FHL1表达变化.用生物素pull-down分析PCBP2是否和FHL家族成员mRNA结合.用5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)掺入法检测细胞增殖能力,Hoechst染色观察细胞凋亡率.结果 PCBP2 siRNA转染这3株细胞后使PCBP2蛋白表达水平明显下调(P＜0.05);增加P53及它的靶基因PUMA和BAX的蛋白表达(P＜0.05);抑制FHL2蛋白(P＜0.05),但并不结合其mRNA的3'非编码区(3'UTR);BrdU阳性细胞减少(P＜0.05);Hoechst染色阳性细胞增多(P＜0.05).结论 抑制PCBP2表达可以增强胶质瘤细胞中P53通路活性,并减弱细胞增殖能力,诱导细胞凋亡.
关键词： RNA干扰 多聚胞嘧啶结合蛋白2 P53 细胞增殖 细胞凋亡
