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博尔纳病病毒核蛋白调控神经干细胞存活增殖及ERK1/2信号通路的实验研究
目的 观察博尔纳病病毒核蛋白(Borna disease virus p40,BDV p40)对大鼠海马源性神经干细胞(Neural stem cells,NSCs)增殖、存活、分化及ERK1/2信号通路的影响,揭示BDV引起神经精神疾病的部分发病机制.方法 (1)分别用pEGFP-N1-p40及pEGFP-N1质粒转染NSCs,观察转染效率并鉴定BDV p40在NSCs中的表达.(2)实验设置3组:未转染组、pEGFP-N1空转对照组及pEGFP-N1 -p40转染组,用CCK-8试剂盒、BrdU摄入实验及免疫组化分别检测细胞存活、增殖及分化为神经元、星型胶质细胞、少突胶质细胞的比例的变化,并经Western Blot检测ERK1/2磷酸化的改变.结果 (1)成功建立表达BDV p40的NSCs模型；PCR结果显示只有pEGFP-N1 -p40转染组细胞有BDV p40基因表达.(2) BDV p40抑制NSCs的存活、增殖,但对于转染后贴壁分化14 d时3组细胞分化为神经元、星型胶质细胞、少突胶质细胞的比例未见显著差异.Western Blot结果显示BDV p40下调了磷酸化ERK1/2在蛋白水平的表达.结论 BDV p40抑制NSCs的存活、增殖,但是对NSCs的分化方向没有明显的影响.BDV p40有可能通过下调磷酸化ERK1/2活性对NSCs的存活、增殖起抑制作用.
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两种博尔纳病病毒株持续感染PC-12细胞模型的建立
目的 构建两种博尔纳病病毒株持续感染的PC-12细胞模型,为研究博尔纳病病毒感染致病机制及比较两种病毒株致病特点的差别提供工具.方法 将BDV Strain V株和Hu株分别感染PC-12细胞系,并进行传代培养,后通过Real time FQRT-PCR、Western blot、间接免疫荧光方法进行病毒核酸和蛋白的检测.结果 在培养传代6代后,两种病毒株感染的PC-12细胞均可检测到BDV核酸及蛋白.结论 BDV Strain V株和Hu株均可在PC-12细胞中复制和表达,两种博尔纳病病毒株持续感染PC-12细胞模型构建成功.
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博尔纳病病毒对BALB/c小鼠感染性检测
目的 分析博尔纳病病毒 (Borna disease virus,BDV) H1766株对BALB/c小鼠的感染性. 方法选择病毒滴度为2.0×107FFU/ml的BDV病毒液分别对新生和成年BALB/c小鼠进行脑内接种,并用相同病毒液对原代培养的新生BALB/c小鼠脑细胞进行接种.经过一定时间的病毒作用后分别提取总RNA,采用巢式RT-PCR方法检测BDV-p40基因,并通过免疫组化方法检测脑内接种脑组织中BDV-P40蛋白.结果 脑内接种病毒的小鼠脑组织中可以检测到BDV-p40基因和BDV-P40蛋白,培养的小鼠脑细胞中可以检测到BDV-p40基因.结论 BDV H1766株可以感染新生和成年的BALB/c小鼠.
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博尔纳病病毒X基因真核表达载体的构建及鉴定
目的 构建博尔纳病病毒(Borna disease virus,BDV)X蛋白真核表达载体,为BDV X蛋白的功能研究奠定基础.方法 从BDV持续感染的人少突胶质瘤细胞(oligodentrocyte,OL)的总RNA中,通过逆转录和PCR获得BDV X基因的完整序列,将其连接到pcDNA6-myc-His (A)载体上,转化至E.coli感受态细菌后,提取质粒筛选阳性克隆,通过PCR法和DNA测序进行鉴定,并转染至OL细胞,通过Western blot方法验证重组蛋白的表达.结果 测序鉴定目的基因序列正确插入至pcDNA6-myc-His(A)载体的酶切位点,PCR扩增的基因片段大小与目的基因相同,Western blot证明转染至OL细胞后可表达BDV X-His融合蛋白.结论 成功构建了博尔纳病病毒X基因真核表达载体pcDNA6-myc-His (A)-BDV X.
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博尔纳病病毒感染与中枢神经系统疾病
一、博尔纳病病毒博尔纳病病毒(Borna disease virus,BDV)系非分节段、以单链RNA为基因组的单负链病毒属病毒,其复制在细胞核而不同于其他同属病毒目故单独分类于BDV科.本病毒基因组为8.9kb,至少编码6种蛋白(N-P-X-M-G-L).此类蛋白之中,N与P在感染个体表达极强,因而在流行病学调研中可起标靶作用.BDV的大特征是在不使脑内细胞发生损害性的状态下构成持续感染.持续感染细胞向细胞外释放微量感染性病毒颗粒,病毒增殖亦不活跃.然而,此种感染细胞能大量表达病毒蛋白.这一现象在RNA病毒是极其独特的个别情况,却也提示此又可能同BDV的致病性相关.
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博尔纳病病毒磷蛋白的原核表达及纯化
目的 构建博尔纳病病毒(Borna disease virus,BDV)磷蛋白(p24蛋白)基因重组表达质粒,原核表达p24蛋白,并进行纯化.方法 通过RT-PCR法从BDV感染的少突胶质细胞株(Oligodendrocyte,OL)中扩增p24基因片段,构建重组表达质粒pET-41a-p24,转化大肠杆菌BL21( DE3),IPTG诱导表达,并对表达的重组蛋白进行亲和层析纯化.结果 经双酶切鉴定和测序证实,重组表达质粒pET-41a-p24构建正确；表达的重组p24蛋白相对分子质量约24 000,表达量占菌体总蛋白的30％以上,主要以可溶形式表达；纯化的重组蛋白纯度达85％左右,可与鼠抗BDV p24单克隆抗体特异性结合.结论 已成功原核表达并纯化了重组BDVp24蛋白,为进一步建立BDV相关免疫学检测方法 奠定了基础.
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抗博尔纳病病毒磷蛋白多克隆抗体的制备及鉴定
目的 制备抗博尔纳病病毒(Borna disease virus,BDV)重组磷蛋白(p24)多克隆抗体,并对其进行鉴定,为BDV血清免疫学检测方法的建立奠定基础.方法 用本课题组前期制备的重组BDVp24蛋白经背腿部多点皮下注射免疫新西兰大白兔,共免疫4次,末次免疫后第7天采血,分离血清,采用抗原亲和纯化法纯化抗血清,ELISA法测定抗血清效价；Western blot和免疫荧光鉴定其特异性.结果 制备的抗BDV p24多克隆抗体的纯度为98％,ELISA效价达1∶128000,该抗体与重组p24蛋白和BDV感染OL细胞表达的p24蛋白均能发生特异性反应.结论 成功制备了灵敏性和特异性良好的抗BDV p24多克隆抗体,为研发相关的诊断试剂和研究该病毒的感染发病机制奠定了基础.
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博尔纳病病毒感染与神经胶质瘤发生的相关性
目的 探讨博尔纳病病毒(BDV)感染与神经胶质瘤发生的可能相关性.方法 用Western-blot方法,对114例神经胶质瘤患者和110例脑外伤患者血清中BDV-p24特异性抗体进行检测.结果 114例神经胶质瘤患者血清中BDV-p24抗体阳性16例,阳性检出率为14.03％;作为实验正常对照的脑外伤患者血清,阳性3例,阳性检出率为2.72％.两组比较差异有统计学意义(P＜0.01).结论 神经胶质瘤患者血清中存在BDV的感染；BDV感染可能与神经胶质瘤的发生相关.
关键词： 神经胶质瘤 博尔纳病病毒 western-blot法 -
精神分裂症患者BDV-p24基因的扩增及其产物的测序鉴定
目的扩增精神分裂症患者PBMCs标本中博尔纳病病毒(Borna Disease Virus,BDV)p24基因,并对基因扩增产物进行测序鉴定,分析其与标准株之间的差异.方法用巢式RT-PCR方检测黑龙江省精神分裂症患者及正常人PBMCs中BDV-p24基因片段,对2例BDv-p24基因阳性的巢式RT-PCR产物进行测序,并与标准株比较.结果9例精神分裂症患者中有2例BDv-p24基因阳性,7例正常人标本中未发现BDv-p24基因阳性.测序结果进一步证实扩增产物为BDv-p24基因,其序列与标准株高度同源.结论用巢式RT-PCR方法可以特异性扩增出BDv-p24基因,扩增产物序列与标准株高度同源,提示黑龙江省的精神分裂症的发生可能与BDv感染有关.
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实时定量RT-PCR检测博尔纳病病毒方法的建立
目的 建立检测博尔纳病病毒(BDV)RNA的实时定量RT-PCR(real-time RT-PCR)方法.方法 设计BDV-p40基因特异性引物和探针,优化反应条件;并以已知的BDV-p40基因扩增产物的克隆为标准品,建立标准曲线;然后对已知BDV RNA进行实时定量RT-PCR的特异性和敏感性检测.结果 建立了特异检测BDV RNA的实时定量RT-PCR技术,并且可以检测到感染细胞中1个拷贝以上BDV RNA.结论 本技术可以直接用于BDV感染的检测和定量分析.
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博尔纳病病毒p40基因重组质粒的构建及鉴定
目的 构建博尔纳病病毒p40基因重组表达质粒.方法 通过PCR方法扩增获得博尔纳病病毒p40基因的完整序列,将此片段定向克隆到pEGFP-N1载体多克隆位点区,筛选重组阳性菌株,提取重组质粒,利用PCR方法和核酸序列测定验证重组质粒构建的正确性.结果 成功构建博尔纳病病毒p40基因重组表达质粒.结论 本文构建的重组质粒将为研究博尔纳病病毒p40基因在真核细胞中的功能和作用提供实验依据.
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博尔纳病病毒接种Wistar大鼠脑组织中病毒基因组的原位检测
本文旨在用原位杂交法探讨博尔纳病病毒(BDV)接种Wistar大鼠脑组织中BDV基因组的分布情况.DIG RNA labeling kit标记BDV p24正链探针后,用斑点实验检测该探针的标记效率,斑点杂交法检测该探针的特异性.在其标记效率与特异性均达到实验要求后,用该探针对颅内接种BDV(H1766株)的Wistar大鼠脑组织中BDV基因组进行原位杂交检测.结果发现,接种3周后,BDV感染主要发生在皮质和海马,仅少量发生在丘脑和下丘脑;接种6周后,皮质和海马的BDV感染仍然存在,且丘脑和下丘脑的BDV感染明显增强,说明BDV在大鼠脑组织中的分布范围随着感染时间的延长而逐步扩大.本文建立的原位杂交法可用于检测BDV在Wistar大鼠脑组织内的分布与迁移情况.
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博尔纳病病毒与人类神经精神性疾病
博尔纳病病毒是一种宿主范围很广的动物病毒,因其可能与人类的某些神经精神性疾病有关而备受重视.但其在人体的感染,致病还存在很多争议.需要通过建立高效灵敏和准确的检测技术进行更加全面的研究,同时对其可能致病机制的分子生物学研究也会有助于澄清有关争议.如果能够确认某些人类的神经精神性疾病与博尔纳病病毒有关,将会极大地帮助人们控制这类危害越来越大的疾病.
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博尔纳病病毒感染与精神分裂症关系的初步研究
目的：探讨精神分裂症患者发病与博尔纳病病毒（BDV）感染的关系，分析被 BDV 感染的精神分裂症患者临床特征。方法：用荧光定量巢式逆转录聚合酶链反应（FQ-nRT-PCR）方法检测86例精神分裂症患者（病例组）和84例健康体检者（对照组）外周血单个核细胞（PBMCs）中 BDVp24和 BD-Vp40基因片段，用β-肌动蛋白（β-actin）作为内参照，并总结阳性患者的临床特征，病例组采用阳性与阴性症状量表（PANSS）评分。结果：病例组外周血标本 BDV p24基因片段检出率11.6%（10/86），BDV p40基因片段检出率14.0%（12/86），拷贝数均>102 kb/μl。对照组 BDV p24、BDV p40基因片段均为阴性（0%，0/84），两组阳性率差异有统计学意义（P 均<0.05）。BDV p24和 BDV p40基因片段均为阳性的标本测序后，与 BDV 标准病毒株 V 和马源的 BDV 病毒株 H1766序列比较同源性分别为96.35%和98.85%。在4个位点出现基因突变（nt1649 T→C、nt1656 G→A、nt1670 C→T 和 nt1676 C→T）。该目的基因片段与马源的 BDV 病毒株亲缘关系近。BDV 阳性患者精神症状主要以幻觉、妄想为主。结论：精神分裂症发病与 BDV 感染有一定的相关性，BDV 阳性患者以阳性精神症状为主要临床特征。
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博尔纳病病毒感染对少突胶质瘤细胞中IL-1β表达量的影响
目的 探讨博尔纳病病毒(Borna disease virus,BDV)感染对少突胶质瘤细胞 (oligodendrocyte,OL)中白细胞介素1β(interleukin 1β,IL-1β)蛋白表达的影响.方法 首先将OL和BDV感染的OL煮沸裂解,分别提取蛋白混合液,测定蛋白的浓度后,将二者的蛋白混合液浓度均调至10 g/L,分别取蛋白混合液及其经10 000 r/min离心5 min后的上清,沉淀后分别进行斑点免疫印迹试验(dot-blot hybridization),检测OL和BDV感染的OL中IL-1β的存在;同时,对提取的OL和BDV感染的OL中的蛋白混合液进行2倍系列稀释后进行斑点免疫印迹试验,检测细胞中的IL-1β的表达量的变化.结果 斑点免疫印迹试验表明,OL和BDV感染的OL中提取的蛋白混合液及收集的沉淀均出现杂交阳性信号,而蛋白混合液离心后的上清未出现杂交阳性信号.等量的OL和BDV感染的OL的蛋白混合液经2倍系列稀释后进行斑点免疫印迹试验,OL的蛋白混合液在≤32倍的稀释度范围内有杂交阳性信号,BDV感染的OL的蛋白混合液在≤8倍的稀释度范围内有杂交阳性信号.结论 ①IL-1β在OL和BDV感染的OL中均存在,且存在于本实验获得的蛋白混合液和沉淀中.②BDV感染使OL中的IL-1β的表达量降低,提示IL-1β的表达量下降,有可能使其参与的脑内的免疫生理及病理反应发生变化,这可能是BDV感染致病的机制之一.
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抗博尔纳病病毒磷蛋白单克隆抗体的制备及鉴定
目的 以重组的博尔纳病病毒(BDV)磷蛋白(p24)为免疫原制备单克隆抗体,并鉴定其特异性.方法 以纯化后的重组BDVp24免疫小鼠,将骨髓瘤细胞与其脾细胞进行融合,经ELISA法筛选出分泌抗p24单抗的细胞株,并对其进行克隆与亚克隆培养,将终获得的其中2株细胞株分别注入小鼠腹腔制备单抗,经亲和纯化法纯化后,采用ELISA法测定效价,利用蛋白免疫印迹和免疫荧光鉴定其特异性.结果 建立了2株稳定分泌抗p24单抗的杂交瘤细胞株,抗体亚类均为IgG1型.纯化后的腹水抗p24单抗纯度为98％和93％,ELISA效价在1∶81 000以上,该抗体均能识别重组p24蛋白和BDV感染人类少突胶质细胞(Oligodendroglia cell,OL细胞)所表达的p24蛋白.结论 成功制备了灵敏性高、特异性好的抗BDVp24单抗,为博尔纳病病毒诊断方法的研制及感染机理的研讨提供依据.
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贵州遵义地区蝙蝠脑组织BDV-P24基因片段的检测
目的 了解贵州遵义地区蝙蝠博尔纳病病毒(BDV)感染情况.方法 采用巢式逆转录聚合酶链反应(nRT-PCR)检测82例蝙蝠脑组织BDV-P24基因片段,阳性产物进行基因序列测定、同源性及分子系统树分析.结果 在82例蝙蝠脑组织中检测出7例BDV-RNA P24基因片段阳性,只有5例成功测出BDV-P24基因片段,与标准株马源Strain V相比较同源性高达99％,出现2个位点的一致性沉寂突变(nt1650T～C,nt1740G-T,突变率为0.9％),与H1766比较其同源性达97％,出现5个位点的一致性沉寂改变(nt1599A～G,nt1671T～C,nt1677T～C,nt1695G～A,nt1740G～T,突变率为2.2％),与He/80比较起同源性为96％,出现7个位点的一致性沉寂改变(nt1566 G～A,nt1581C～T,nt1659 T～C,nt1668 A～G,nt1674 T～C,nt1695 G～A,nt1740 G～A,突变率为3.1％).结论 贵州遵义绥阳地区蝙蝠存在BDV感染,与马源Strain V存在高度同源性,人感染BDV可能存在潜在的动物源性.
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牧羊犬外周血和脑组织博尔纳病病毒检测结果的比较
目的 检测同一牧羊犬外周血和脑组织博尔纳病病毒(BDV)p24片段,比较两者阳性率的差异.方法 采用改进的荧光定量套式RT-PCR,对新疆伊犁地区圈养的100只牧羊犬外周血单核细胞(PBMC)和脑组织(BT)同时进行BDV p24基因片段的检测,并对阳性标本采用GFP-p24、pMD-19扩增后电泳验证,排除质粒污染,并克隆测序,用Fisher精确检验和χ2检验分析两者阳性率的差异.结果 牧羊犬外周血单核细胞和脑组织BDV p24检测的阳性率分别为5%和9%;PBMC组和BT组BDV p24检测阳性率差异无统计学意义(P>0.05).结论 BDV在脑内持续感染,但以RT-PCR对外周血单核细胞BDV p24片段的检测有可能替代脑组织BDV检测,作为大规模流行病学调查的手段.
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贵州遵义地区山羊Borna病毒P24基因片段的检测
目的 探讨贵州遵义及周边地区山羊博尔纳病病毒(BDV)感染状况.方法 采用荧光定量套式逆转录酶聚合酶链反应( FQ-Nrt-PCR)检测了300只山羊外周血单个核细胞( PBMC)中BDV P24基因片段.对阳性产物进行基因序列测定,氨基酸顺序,及同源性分析.结果 300只山羊PBMC中2只检出BDV P24基因阳性片段.山羊BDV P24基因片段阳性率为0.67﹪.BDV P24基因片段测序结果与GenBank提供的strain V毒株比较同源性为96.51%,有3个位点出现一致性沉寂突变,与BDV/MDCK毒株比较同源性为96.51%,有3个位点出现一致性沉寂突变,与C6BV毒株比较同源性为96.51%,有3个位点出现一致性沉寂突变,但所编码的氨基酸没有改变.结论 贵州遵义及周边部分地区山羊存在BDV自然感染.
关键词： 博尔纳病病毒 巢式逆转录荧光定量PCR BDV P24基因 山羊 -
博尔纳病病毒核蛋白转染人少突胶质细胞的蛋白组学研究
目的 研究博尔纳病病毒(Borna disease virus)核蛋白(Nucleoprotein,p40)质粒转染人少突胶质细胞(Oligodendrocyte,OL)后蛋白表达变化.方法 构建BDVp40质粒转染OL细胞的细胞模型和空载体转染细胞模型,分别提取各组细胞蛋白进行双向凝胶电泳和图像分析,用HPLC-Chip/MS纳流液质联用技术进行差异蛋白分析,NCBI数据库搜索鉴定差异蛋白.结果 BDVp40转染后出现蛋白表达差异,与对照组相比有8个蛋白表达上调,4个蛋白表达下调,1个蛋白只在转染后细胞表达而未转染OL细胞组不表达,其中4个蛋白与神经系统疾病相关.结论 BDVp40转染OL细胞后导致相关蛋白表达改变,其中一部分蛋白与神经系统疾病相关.
